I , II

Au début de l'expérience, la température de 22° se montre très liivorable à l'action de l'enzyme : après 6 heures de fermentation on a constaté, à cette température, un dégagement de 0,76 grammes d'acide carbonique, tandis qu'à 12° et i/i°, il ne se forme que o,/|3 de ce gaz. Mais si l'opération se prolonge à la température de 22°, l'action se ralentit; ce ralentissement doit avoir évidemment pour cause une destruction partielle de la diastase.

La marche de la fermentation est encore influencée par la concentration des solutions sucrées.

SACCHAROSE CO" (eN GRAMMEs) APRÈS :

POUR CENT ^^ ^

iC HEURES 2/1 HEURES /|0 HEURES

Dans des liquides contenant 16 pour 100 de sucre, la fermentation est plus active que dans ceux qui en contiennent 27 pour 100, mais l'enzyme a encore de l'action sur les solutions

conlcnaiit 07 pour 100 de sucre. Dans les solutions conlcnant de 40 à 5o pour 100 de sucre, la fermentation est presque complètement arrêtée, mais l'enzyme n'est nullement altéré car, par une dilution du moût, on peut obtenir une nouvelle fermentation.

L'activité cliastasique de la zymase diminue au fur et à iTiesure que son action se prolonge; si l'on compare, en effet, la quantité d'acide carbonicpie formé par l'action des enzymes pendant les 1 6 premières heures avec la quantité de gaz dégagé pendant les 16 heures suivantes, on constate une décroissance rapide du pouvoir ferment. En calculant ce pouvoir pour 100 centimètres cubes de suc et par heure, Bucbner a trouvé que la zymase fournit, en moyenne, les quantités d'acide carbonique suivantes :

De 1 à i(J h. Deiljùaih. De2/|à/|oh. De/|oà(;/|h.

Moyenne de 3 essais. .

. — 2 essais. .

— 2 essais. .

o,oiG

o,oo4

L'extrait de levure, comme toutes les solutions diastasiques, produit dans l'eau oxygénée un dégagement d'oxygène. Lorsque l'extrait a été additionné d'acide cyanhydrique, il perd cette propriété caractéristique. Mais si l'on soumet alors l'extrait additionné d'acide cyanhydrique à l'action prolongée de l'air, on voit réapparaître la réaction de l'eau oxygénée.

Il est donc probable que l'acide cyanhydrique se combine avec les diastases pour former une combinaison en eiitravant leur activité et que cette combinaison se détruit au contact de l'oxygène qui régénère l'enzyme.

Voici une expérience de Bûchner relative à l'action de l'acide cyanhydrique et de l'air sur la zymase :

On mélangea 4 centimètres cubes d'extrait avec 6 centimètres cubes d'acide cyanhydrique à 2 pour 100; la moitié A du mélange fut mise en contact avec 3 grammes de sucre

ZYMASE 'i'>S>

de r.iiino; l'aulrc moilic !> lui soumise à l'acliou tie l'aiipendanl i heure, puis égalemenL atlclilionnéc de 3 grammes de saccharose. On plaça les liquides dans des tubes en L fermés d'un côlé. L'essai A ne produisit aucune trace d'acide carbonique, tandis que dans l'essai B la partie fermée du tulje fut remplie de ce gaz au bout de 20 heures, le dégagement ayant commencé au bout de 5 heures.

La zymase est influencée par les conditions chimiques du milieu.

Les sels neutres comme le sulfate d'ammonium, le chlorure de calcium, etc. , ont une action retardatrice sur la fermentation .

On constate aussi qu'il existe une relation directe entre l'actiA'ité de l'extrait de levure et la présence dans le jus d'albumine coagulable.

L'extrait de levure, maintenu pendant quelque temps à la température de 35° à 4o°, se trouble, donne naissance à des flocons et perd son activité. D'un autre côté, on a observé que quand un extrait devient inactif pour une raison quelconque, il ne se coagule presque plus à la température de /io° à 5o".

Cette relation entre la présence de matières coagulables et l'activité diastasique est expliquée par Bûchner de la façon suivante. D'après lui, la zymase serait une matière albuminoide qui se coagulerait par la chaleur, mais cette coagulation ne se produirait plus lorsque la substance diastasique est transformée.

Bûchner interprète encore la grande altérabilité de la zymase par la présence d'une diastasc peptonisante dans l'ex- Irait de levure : cet enzyme agirait sur la zymase en la rendant inactive. C'est la présence sinndtanée de ces deux ferments, l'un peptonisantet l'autre produisant le dédoublement du sucre, qui explique l'activité du suc de levure aux températures relativement basses.

A 22", la peplasc agit avec plus d'énergie que la zymase. tandis qu'à basse température l'action peptonisante est peu ])rofonde et la zymase peut produire de plus grandes quantités d'alcool.

3aO LES ENZYMES

L'influence favorable des sucres sur la conservation de la zymasc parle aussi en faveur de l'hypolhèse de la digestion de la zymase par l'enzyme peptonisant.

On sait que dans les solutions conccn trées de saccharose la digestion de la fdjrinc par la pepsine est retardée. Or, si l'on mélange un volume d'extrait de levure avec un volume d'une solution de saccharose à -5 pour loo, on obtient une solution qui se conserve pendant une semaine à la température ordinaire et pendant i5 jours dans une glacière. Le sucre a donc une action très favorable sur la conservation de la zymase.

L'activité de l'extrait de levure varie notablement suivant les races employées à sa confection. En général, les levures de fermentation basse donnent un suc très actif, tandis que les levures de boulangerie ne contiennent presque pas de zymase. On observe encore une grande différence entre les extraits de levures fraîches et ceux des levures qui ont séjourné pendant quelque temps à l'air. Ce sont ces dernières qui donnent les extraits les moins actifs.

Cependant toutes les levures de brasserie ne donnent pas un jus de même activité. La provenance de la levure joue encore ici un rôle considérable.

Les différences qu'on observe suivant la provenance et suivant l'âge de la levure apportent un argument à l'hypolbèse expliquant l'altération de la zymase par l'action d'un autre enzyme.

Bûchner divisa une certaine quantité de levure en 2 portions A et B. L'extrait fut exprimé de suite de A, tandis que la portion B fut abandonnée à elle-même pendant 3 jours à y^'-S" avant qu'on en exprimât le suc. L'extrait de A possédait une activité assez forte, tandis que le liquide provenant de B ne donnait qu'une quantité minime d'acide carbonique. Btichner attribue la diminution de l'activité dans le second cas à une peptonisation se produisant pendant les 3 jours de séjour à 7°-8°. L'action de la pepsine serait également cause, d'après lui, de l'altération de la cliastase contenue dans la levure de grains pressée.

ZYMASE 3^7

Celle opinion est encore renrorcéc par une exjiérience de Ilolni qui a dcnionlré tout récemment la présence de l'en/ymc ])i-ololytique dans le suc des levures.

Bûclmer a. du reste, démontré directement la peptonisation do la /yniasc par l'enzyme à l'aide de l'expérience suivante:

Il plaça trois lubcs contenant 3 centimètres cubes d'extrait de levure dans la glace. Deux de ces tubes furent additionnés de o"%i de trypsine, le troisième tube servant de tid^e témoin. Après 12 heures, chaque .tube reçut 2 grammes de saccharose pulvérisé. Les essais pratiqués avec la trypsine restèrent absolument inactifs après l'addition de sucre de canne ; au contraire, dans le tube témoin, une fermentation très active se produisait.

La découverlc de Bûclmer a rencontré de nombreux contradicteurs qui se sont efforcés de démontrer, que l'extrait de levure contenait toujours, soit des cellules, soit des ferments et qui ont attribué le dédoublement du sucre à l'intervention des cellules vivantes.

Biichner a victorieusement réfuté toutes ces objections à l'aide d'expériences concluantes.

L'existence de la zymase est démontrée par les faits suivants :

1° On peut obtenir une fermentation alcoolique avec la substance solide obtenue par la précipitation du suc par l'alcool ;

2° On obtient avec le suc de levure une fermentation presque instantanée, dont l'intensité diminue avec le temps. S'il s'agissait de cellules vivantes on observerait un phénomène tout à fait opposé : la fermentation augmenterait d'intensité au fur et à mesure que les cellules se développeraient ;

3" Le suc de levure produit une fermentation en présence de doses d'antiseptiques qui paralyseraient l'activité des cellules A i^ antes ;

4" Par le passage sur le fdlre en porcelaine, on obtient encore des liquides actifs, sans qu'on puisse y déceler la présence d'organismes.

En somme, la fermentation alcoolique est produite par dèsagents chimiques en dehors et en l'ahscnce de cellules vivantes. Il est vrai que la matière qui produit cette transformation est élaborée par l'activité vitale, et que sa formation est intimement liée à l'accroissement et à la multiplication des cellules. Le pouvoir ferment des cellules se réduit donc à la propriété qu'elles ont de produire la zymase.

Fermentation intercellulaire. — La zymase doit se trouver dans beaucoup d'autres celhdes vivantes. Le pouvoir ferment que l'on peut développer daus certains champignons nous paraît devoir être attribué à une sécrétion de zymase se produisant dans des conditions particulières.

Il y a aussi tout lieu d'admettre que, dans les phénomènes de fermentation intercellulaires, c'est encore la z^anase qui joue un rôle actif. Pasteur a constaté que les fruits plongés dans le gaz anhydride carbonique entrent en fermentation et transforment le sucre en alcool et anhydride carbonique.

Muntz, en remplaçant l'air par l'azote, a constaté le même phénomène pour les plantes en pleine végétation. Il se forme, dans ces conditions, de l'alcool dans les feuilles de la plante.

On explique ce phénomène par l'activité vitale et on admet que les changements dans le travail sont dus aux changements dans les conditions de nutrition.

Nous croyons qu'il est plus facile d'admettre que l'absence d'oxygène est, dans ces conditions, favorable à la sécrétion do la zymase. La fermentation que l'on constate en ce cas est analogue à celle qui se produit sous l'action de la levure alcoolique ; dans les deux cas c'est la zymase qui la provoque.

L'intervention de la zymase dans les fruits à l'abri de l'air, nous a fourni le sujet de recherches intéressantes que nous poursuivons actuellement et qui sont encore loin d'être terminées ; mais nous pouvons, dès à présent, donner quelcpies indications qui trouveront leur complet développement dans un travail ultérieur.

ZYMASE 32y

Les nombreux essais f|iie nous avons pratiqués nous oui confirmé la présence de lazymase dans les l'ruilsel noiannueni dans les cerises, tlans les prunes, dans les pois, ainsi (pic clans l'orge.

Les premiers essais ont élé l'ails avec des cerises, de la façon suivante :

Les fruits frais sont lavés dans une solution diluée d'aldéhyde formique afin de détruire les germes, puis soigneusement essuyés et plongés dans des ballons contenant de l'huile d'olive. Au bout de 3 jours, les cerises sont couvertes de petites bulles de gaz et l'on constate ensuite au-dessus de l'huile qui recouvre les fruits, un dégagement d'acide carbonique cjui s'accentue après le 5" jour.

La fermentation continue très lentement pendant 20 jours à la température de 10°. Après ce temps on verse l'huile, on écrase les cerises ainsi que les noyaux dans un mortier et on en exprime le jus en j^ressant la masse dans un linge.

Le résidu est enlevé du linge, traité à froid par l'éther pour le débarrasser de l'huile, puis desséché dans le vide et réduit en une poudre fine qu'on fait macérer avec 2 volumes d'eau additionnée d'une faible dose d'éther. On laisse en repos dans un flacon bouché, à 5°, pendant 12 heures, après quoi la masse est soumise à une forte pression. On obtient ainsi un jus qui. filtré sur papier-filtre, constitue un liquide visqueux, limpide, de réaction faiblement acide et fournissant la réaction du gaïac et de l'eau oxygénée.

La présence de zymase dans ce licjuide peut être constatée par les essais suivants :

A 5o centimètres cubes chi liquide on ajoute 7 grammes de sucre de canne en poudre et on laisse en repos pendant (3 heures à 22° dans un petit ballon muni d'un tube à dégagement. Après 2 heures, on constate la formation d'acide carbonique et après 6 heures une diminution de poids de 3 décigrammes.

On fait \m essai parallèle avec le même liquide maintenu

33o- LES ENZYMES

préalablement à [\o° pondant une heure, dans im flacon fermé, puis refroidi à 22° et laissé à cette température pendant 5 heures, en laissant ouvert le tube à dégagement. Dans ce deuxième essai on ne constate ni dégagement de gaz, ni diminution de poids. La diastase alcoolique a donc été détruite par la chaleur.

L'analyse de la solution sucrée non fermcntée montre qu'il s'est toutefois produit un changement dans sa composition chimique. Nous avons, par exemple, constaté, dans une de nos expériences, que 3,4 grammes de sucre avaient été transformés en sucre interverti.

Cette transformation ne peut pas être attribuée à l'acidité an liquide, car en chauffant le jus actif dans un vase fermé, pendant 10 minutes à 80" avant l'addition de sucre et en maintenant ensuite le liquide additionné de sucre pendant une heure à /|.o", puis pendant 5 heures à 22", nous n'avons obtenu que o^'',i5 de sucre interverti au lieu de 3"', 4. Le liquide actif contient évidemment de la zymase et de la sucrase et, tandis que la zymase est détruite par la chaleur, la sucrase n'est pas altérée.

L'existence de la zymase dans le jus cellulaire des cerises a été confirmée par d'autres essais dans lesquels on a pu doser l'alcool produit. Voici comment on a opéré :

200 centimètres cubes de jus actif ont été additionnés de sucre et de 2 grammes de chlorol'orme. Dans un essai parallèle, on a adchtionné une solution à i5 pour 100 de sucre, d'un peu de chloroforme et de 2 grammes de levures. Les deux liquides, laissés 5 jours à 10° ont donné des résultats différents.

Dans le liquide contenant des levures, la fermentation ne s'est pas manifestée, tandis que dans le liquide cellulaire des cerises on a trouvé o"'",8 d'alcool.

La non-existence de levures dans le moût fermenté à été confirmée par l'analyse microscopique, ainsi que par la culture sur plaques.

ZVMASE 3-Ai

Les essais pratiqués en \v\c de prccipilcr la diaslase [)ar l'alcool n'ont irns fourni de résultats satisfaisants. Le liquide <ictif perd ses propriétés en passant par les bougies de porcelaine, et la zyinase que nous avons obtenue diflere, à ce point de vue, de la diastase isolée par Bucbner.

Dans le cours de nos essais nous avons constaté, en outre, que les pois frais, ainsi que l'orge, fournissent, par la fermenlation intercellulaire, des quantités d'alcool assez considérables. Les pois sucrés, abandonnés dans l'huile, ont fourni à l'analyse 2 pour 100 d'alcool. L'orge, préalablement trempé, essuyé et mis dans l'huile, a fourni 1,6 pour 100 d'alcool.

En traitant ces grains par des procédés analogues à ceux employés pour les cerises, nous avons pu y constater la présence de zymase.

Applications industrielles de la zymase. — La zymase, tout en étant très intéressante au point de vue théorique, aura peut-être aussi, dans l'avenir, de très nombreuses applications industrielles.

La fermentation produite par la diastase, sans intervention directe des levures, présente, théoriquement, un grand avantage. On peut arriver, de cette façon, à des fermentations beaucoup plus rapides et à des produits plus purs et plus parfaits.

A l'heure actuelle, les distillateurs et les brasseurs cultivent eux-mêmes leurs levures et cherchent à les approprier à leur mode de travail. Cependant, même en partant de levures pures, on n'aboutit pas toujours à de bons résultats ; il se produit souvent une infection et, par suite, une dégénérescence des ferments.

Il est à prévoir que, dans l'avenir, la culture les levures et la fabrication subséquente de la zymase se feront dans des usines spéciales, où les brasseurs et les distillateurs se procureront des préparations d'une grande activité et fournissant un travail immédiat.

Il est vrai que, dans la brasserie, la levure joue encore un

rôle important au point de vue de l'élimination des matières azotées, travail que la zymase seule ne pourrait effectuer. On sera donc forcé, en travaillant avec les enzymes seuls, de changer complètement la technique et de créer de nouveaux procédés.

La découverte de la zymase est trop récente pour qu'elle puisse prétendre révolutionner immédiatement l'industrie; cependant les premières tentatives d'application industrielle ont déjà été faites par Bûclmer, qui a créé un nouveau procédé ayant pour but la préparation d'une levure durable destinée à remplacer la levure pressée dans la panification.

Ce jirocédé consiste à sécher tout d'abord la levure à basse température, à chauffer ensuite jusqu'à 5o°, puis à ioo°, et enfin, lorsque la levure est complètement desséchée, à la broyer pour la réduire en poudre. Elle est alors livrée au commerce.

Ce procédé présente plusieurs avantages. La levure préparée de cette façon se conserve beaucoup mieux que la levure pressée, les cellules mortes étant moins exposées au changement que les cellules vivantes. De plus, le séchage plus intense de cette levure la recommande au point de vue de l'hygiène, car les microorganismes, que renferment toujours les pains de levure, sont ici détruits et ne peuvent plus influer sur la pâte, même lorsqu'elle est insuffisamment stérilisée.

La levure de Bûchner s'appelle levure d'attente ; elle est employée dans la boulangerie de la même façon que les levures pressées ordinaires. D'après l'auteur du brevet, des essais ont prouvé que l'addition de 5 à lo jjour loo de levure d'attente était suffisante pour produire le ramollissement de la pâte.

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