CHAPITRE XXIII

OXYDA SES

Présence des oxydases dans les cellules végétales et animales. — Propriétés générales. — Laccase. — Tyrosinase. — Influence du milieu. — Action des oxydases sur les phénols insolubles dans 1 eau. — La casse des vins : œnoxydase. — Oxydine. — Oléase.

Les ferments solubles ont été longtemps considérés comme des subtances agissant uniquement à la façon d'agents hydrolisants, c'est-à-dire provoquant la fixation d'une ou de plusieurs molécules d'eau en même temps qu'un dédoublement moléculaire. L'oxydation, la déshydratation, le changement moléculaire sans fixation d'eau, tous ces phénomènes chimiques, étaient attribués à l'action directe de l'énergie Aitale sans aucune intervention diastasique.

Cette théorie tout à fait erronée a été, dans ces derniers temps, victorieusement réfutée par une série de découvertes accomplies dans le domaine de la chimie biologique par Bertrand, Bourquelot, Hikorokuro Yoshida, Cazeneuve, Martinand, etc., dont nous aurons l'occasion d'examiner les travaux.

Les études de ces savants ont démontré l'existence d'une série de substances, présentant les caractères de véritables agents oxydants et fixant l'oxygène sur certains corps. Ces substances, sécrétées par les cellules vivantes, ont reçu le nom d'oxydases. Ces enzymes facilitent l'oxydation de certaines substances, soit en les déshydratant, soit en compliquant leur molécule par fixation d'oxygène.

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Certains sucs vcyctaiix lois (|iie le vin, le lalex de l'arbre à laque, le jus des ponniics, des prunes et d'aulrcs fruits, ainsi que certains chanq)ignons s'altèrent lorsqu'on les expose quelque temps à l'air. Ce phénoniène, qui se manilestc généralement par un changement de coloration, ou, lorsqu'il s'agit de corps solides, par une élévatioji de la température, ne se reproduit pas dans le vide. Il possède donc tous les caractères d'une oxydation, puisque l'intervention de l'air, par conséquent de l'oxygène, est indispensable à sa production.

La cause directe de cette oxydation resta longtemps peu connue. Elle ne fut trouvée qu'en i883, par un chimiste japonais, Hikorokuro \oshida, qui, en faisant des expériences sur l'oxydation du latex de l'arbre à laque, parvint à découvrir dans ce phénomène l'intervention d'une diastase.

Cette découverte donna un nouAcl élan aux études sur les enzymes ; la question fut reprise dans différents laboratoires et des découvertes, portant sur les sujets les plus divers, s'annoncèrent bientôt nombreuses et concluantes. On étudia successivement les tissus végétaux, les muscles, les sécrétions organiques et chacjue recherche opérée dans cette voie apporta des preuves nouvelles.de l'existence des oxydases.

L'oxydation et la transformation en un vernis noir du latex de l'arbre à laque fut nettement reconnue comme un phénomène d'ordre diastasique. Lne transformation présentant quelques caractères analogues et se produisant dans les sucs de nombreux végétaux, tels que les champignons, les pommes de terre, les betteraves, les rhizomes du canna indica. fut attribuée par Bourquelot, Lindet, Bertrand, etc., à un autre enzyme oxydant.

La décoloration du vin et le dépôt de la matière colorante furent reconnus comme étant des phénomènes du même ordre et attribués à l'action d'une diastase, que certains auteurs considèrent comme préexistante dans le moût de vin, tandis que d'autres la considèrent comme étant produite par une moisissure : le botrytis cinerea.

Dans le règne animal, les expérimentateurs eurent l'occasion de faire des découvertes tout aussi nombreuses et tout aussi intéressantes. On trouva un ferment oxydant dans la salive ainsi que dans d'autres sécrétions: mucus nasal, larmes, sperme, tandis que l'urine, la bile, et les sécrétions intestinales furent trouvées exemptes de tout ferment de ce genre.

Jacquet, en 1882, fit des expériences sur l'oxydation de l'alcool benzylique et de l'aldéhyde salicylique avec des morceaux de poumons, de reins et de muscles de cheval, préalablement traités par l'eau phéniquée, puis congelés et réduits en bouillie. Ceslîagments d'organes provoquaient une oxydation qui ne se produisait plus lorsqu'ils avaient été cuits à l'eau bouillante.

Déjà à cette époque. Jacquet reconnut que l'oxydation ne venait jias uniquement des cellules, parce que l'extrait aqueux de ces tissus produisait, aussi bien que les cellules ellesmêmes, une fixation d'oxygène sur l'alcool benzylique et l'aldéhyde salicylique.

7\.leloos et BrauvA^er confirmèrent ces résultats en recueillant une substance, extraite du foie de cheval, qui précipitée de sa solution aqueuse par l'alcool, oxyde l'aldéhyde formique et la transforme en acide avec dégagement d'anhydride carbonique. Cette substance perd, d'ailleurs, toute action oxydante après avoir été chauffée à 100".

Spitzer et Rhomann retrouvèrent cette substance dans le sang et dans les organes de plusieurs mammifères.

Enfin, des phénomènes de destruction interne, que nous avons eu l'occasion d'observer dans la levure, peuvent être altribués à des interventions diastasiques oxydantes.

Nous avons constaté qu'en réduisant une certaine quantité de levure pressée en fragments minuscules et en les plaçant ensuite en tas, on voit bientôt se manifester une élévation de température, qui peut atteindre 4o°, au bout de 2 heures. Cette élévation de température peut être obtenue, par exemple, avec 2 kilogrammes de levure fraîche granulée et disposée en

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las lie '20 ccnlimcli'os de liaiileur à la leiu|)éialiire do 20°. La iiiènie expérience, |)ralIf|iK'e dans Je vide, ne donne pas lieu à la moindre élévalion de lempéraliu-e. On ])eul praliquer l'expérience de la manière suivante :

Dans un flacon à trois lubuhucs d'un demi-litre, on dispose des couches de le\Tire réduite en petits fragments et alternant avec des couches de pierre-ponce qui empêchent la levure de se lasser. Un ihermomètre est introduit dans la tubulure du milieu, et un courant d'air établi à l'aide des deux autres. Aussitôt que l'air pénètre dans le ballon, la température monte et, si l'on ferme le robinet à air, on constate qu'elle s'abaisse immédiatement.

En ne laissant durer l'expérience que quelques heures, on peut la renouveler plusieurs fois avec la même levure, pendant 3 ou 4 jours consécutifs et observer qu'à chaque rentrée de l'air dans le flacon la température s'élève (i).

Lorsqu'on laisse, au contraire, passer l'air dans le flacon ])endant 5 à 6 heures consécutives, la levure se liquéfle et s'épuise complètemen t .

En broyant la knure avec de la pierre ponce dans un broyeur puissant, on obtient une pâte qui, mise à macérer dans l'eau froide et filtrée, donne un liquide exempt de cellules et offrant encore, au point de vue de l'oxydation, les mêmes propriétés que la levure elle-même.

Les fragments de pierre jjonce imprégnés de liquide, mis en présence de l'air tlans une masse de glycogène, y protluisent une élévation de température de 4 à 6 degrés. Cet extrait est moins actif que la levure elle-même, mais une série d'expériences nous ont montré qu'il possédait, tout comme la levure, mi j)ouvoir diastasique oxydant.

I. Cette expérience est surtout intéressante au point de vue de 1 analyse des gaz. Nous avons, eneflet, remarqué que l'on peut, de cette manière, déceler l'oxygène mélangé à des gaz inertes dans la proportion do x pour loo.

Effkont. Les Enzvincs. 2a

En présence de tous ces faits, il est indiscutable que les phénomènes de respiration et d'oxydation des végétaux et des animaux doivent être généralement attribués à des oxy dases .

On voit, d'après ce court exposé, que la découverte des oxydases a été d'une importance considérable, puisqu'elle a jeté cpielque lumière sur des phénomènes encore inexpliqués, ou pour l'explication desquels on avait recours à des théories erronées.

L'étude des enzymes oxydants présente encore un grand intérêt au point de vue chimique, car ils constituent des réactifs très sensibles pour toute une série de substances organiques.

Propriétés générales des oxydases. — Comme toutes les diastases, les oxydases sont des corps éminemment instables : ils sont détruits par la chaleur au-dessus de 60".

Les antiseptiques, en général, ne semblent capables que de retarder l'oxydation produite par ces agents. Cette action retardatrice des antiseptiques n'est cependant pas un fait prouvé d'une façon générale. Nous pensons, au contraire, c[ue les différentes diastases appartenant à cette classe sont plus ou moins sensibles à l'action des antiseptiques et que c'est à ce fait que nous devons attribuer les résultats négatifs de nombre de recherches opérées sur des corps contenant certainement des oxydases.

L'alcool ne semble j)as gêner l'action des enzymes de cette classe, lorsqu'on l'emploie à un degré suffisant de dilution. La diastase du latex, la laccase, produit encore une oxydation en solution alcoolique à 5o pour 100.

Les ferments solubles oxydants bleuissent énergiquement la teinture de gaïac non additionnée d'eau oxygénée, l'acide gaïaconique se formant avec l'oxygène emprunté à l'air.

La température, ainsi que les réactions du milieu, influent sur l'action des oxydases.

Enfin, la plupart des oxydases agissent tout particuliè-

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ronioni sur les corps de la série ai'nmnlique : les |)h('nnls, les aminés et leurs |)rochiils de sii])sliliilion.

Les [)roduils d'oxydation Jburnis ])ar les diaslases sont encore mal définis. L'oxydation des corps do la série aromatique se produit, soit par une élimination de riiydrogènc, soit par fixation directe d'oxygène. Cette oxydation n'est jamais très profonde. L'oxydai ion des matières grasses est beaucoup plus énergique; elle conduit à une dcstruclion complète et à la formation de l'acide carbonique.

L'action des oxydases n'est nullement spécifique. La laccase, par exemple, transforme tout aussi bien l'bydroquinone (phénol biatomique) que le pyrogallol (phénol triatomique).

La position des groupes semble, toutefois, jouer un rôle primordial : la position para, par exemple, paraît influencer favorablement la réaction.

On sait que, dans les diastases hydrolisanles, f individualité est plus caractérisée; que la sucrase, par exemple, ne peut dédoubler que le saccharose et que ce ferment est même incapable d'agir sur des corps très voisins et ne diflérant que par leur configuration.

La quantité d'oxygène absorbé sous l'action des ferments solubles oxydants peut servir, dans la plupart des cas, à mesurer fintensité de l'oxydation.

Préparation des oxydases. — Les oxydases s'extraient des corps qui les contiennent par les méthodes généralement employées pour fextraction des ferments solubles hydrolysants.

Les corps servant à la préparation sont triturés puis mis à infuser en présence de chloroforme. L'emploi de ce dernier corps constitue cependant un danger, car on ignore si cet antiseptique, qui laisse intactes la ]:)lupart des diastases hydrolysantes, est également sans action sur toutes les oxydases. Il est donc à recommander, si l'on cherche des oxydases, de faire deux triluialions. fune avec de l'eau chloroformée, l'autre

3?io LES ENZYMES

avec de l'eau contenant de l'éllier. Dans certains cas, c'est dans l'eau éthérée qu'on trouvera lesoxydases, tandis que l'infusion chloroformée ne contiendra pas trace de substances actives.

L'infusion est ensuite précipitée par l'alcool ; on redissout le précipité formé et on le précipite à nouveau plusieurs fois pour le purifier.

La méthode d'extraction parla gJycérine est également applicaJjle à la préparation des oxydases.

Laccase.

La laccase est un ferment soluble produisant l'oxydation du latex de l'arbre à laque et le transformant en ui^ vernis de très bel aspect dont les Japonais, les Tonkinois et les Chinois se servent pour recouvrù" leurs meubles.

Le latex est un liquide clair présentant l'aspect et la consistance du miel. On le récolte dans l'Asie orientale en pratiquant des incisions dans l'écorce de certains arbres résineux du genre anacardiaqué (Rhus vermicifera J .

L'odeur du latex est très faible et se raj)proche un peu de celle de l'acide butyrique ; il possède une réaction acide.

Le latex s'altère avec une rapidité extraordinaire. Mis en présence de l'oxygène, il brunit et sa surface se recouvre d'une pellicule résistante d'une belle couleur noire et absolument insoluble dans les dissolvants ordinaires. Dans le vide, l'altération ne se produit pas et le latex peut se conserver très longtemps.

Les premières données sur la laccase sont dues au chimiste japonais Hikorokuro losliida. L'étude de l'oxydation do latex lui révéla la présence d'un corps qu'il appela acide uruschique (C"'H"0"), corps qui par oxydation se change en acide oxyuruschique, ainsi que l'indique l'équation suivante :

2G' ''Hi'-'02 -4- 30 = 2CI ''H'803 + H^O acide uruscliique acide oxyuruschique

LACCASE 34 1

Bcrlrand, en délavanl lo Inlox dans une grande quantité <l'alcnol, Y déconvrit doux prodiiils, l'vni qvii entre en solution el l'aiilrc qui se préci|)ile.

Ce précipité, séparé du liquid(\ esl une sorte de gonmie. <3n le lave avec soin à l'alcool, on le reprend par l'eau dislillée, puis on le précipite à nouveau jiar lo volumes d'alcool. On peut alors le recueillir sous forme de flocons et le sécher 'dans le vide. Le produit obtenu par cette méthode ressemble iiux gommes ordinaires et se transforme, comme celles-ci, par riiydratation , en un mélange de galactose et cl'arabinose.

Ce corps possède un pouvoir diastasique.

La solution alcoolique, après qu'on en a enlevé le précipité gommeux, est distillée rapidement dans le vide. Le résidu est agité dans l'eau puis dans l'étlier; l'eau retient le glucose, les sels minéraux, etc. et l'éther dissout l'extrait résineux du latex. L'éther est alors décanté et évaporé dans une atmosphère d'hydrogène.

Le produit obtenu par cette méthode est le laccol; c'est un liquide huileux, d'une assez forte densité, ne se dissolvant pas dans l'eau, mais entièrement solubledans l'alcool, l'éther, le chloroforme et le benzène. La manipulation de ce produit présente certains dangers : des traces de laccol peuvent agir ■d'une façon nocive sur l'épiderme. Mis en présence de l'air, il se colore en brun rouge, prend une certaine visquosité et finit par se résinifier.

L'oxydation, favorisée par la potasse et la soude, se produit en diverses phases. Le liquide s'échaufTe, verdit, devient nf)ir d'encre, et absorbe une grande quantité d'oxygène. Le laccol donne avec le perchlorure de fer et l'acétate de plomb <:lcs réactions ressemblant fort aux réactions que produisent, avec ces mêmes agents, les phénols polyatomiques.

En présence de laccase, l'oxydation du laccol est beaucoup plus profonde, beaucoup plus rapide et donne finalement une sidDStance noire, insoluble qui ne s'obtient pas en l'absence de l'enzvme.

Bertrand, au début de ses études, a cru que la fixation d'oxygène se faisait par une simj^le affinité chimique, et que la laccase agissait ensuite sur les corps oxydés à la façon d'un agent hydratant.

iV la suite de ses expériences, le chimiste français parvint à déterminer le véritable mécanisme de l'oxydation. Il remarqua que la quantité d'oxygène absorbé par le laccol au contact de l'air, augmente avec la dose de laccase employée, ce qui ne peut s'expliquer que par une action oxydante directe de la laccase.

Des démonstrations probantes furent fournies dans la suite par Bertrand. Il fit agir une certaine dose de laccase sur des corps voisins du laccol, principalement sur l'hydroquinone et sur le pyrogallol et constata qu'en présence de la laccase tous les phénols polyatomiques absorbaient une certaine quantité d'oxygène, en dégageant de l'acide carbonique. En l'absence de diastase au contraire, ou bien avec une solution diastasiquc chauflécà loo'', aucune oxydation ne se produisait. L'action oxydante de la laccase est donc bien démontrée.

Bertrand découvrit ensuite une réaction très sensible pour déceler la présence d'oxydases dans les plantes. Il constata que la teinture alcoolique de gaïac prenait, en présence de ia laccase, une coloration bleue intense par la seule intervention de l'air, tandis que, pour obtenir le même résultat avec les diastases hydrolisantes, il est nécessaire d'employer l'eau oxygénée.

La même réaction a encore lieu quand on traite par la teinture de gaïac des coupes d'organes contenant une diastase oxydante.

La sensibilité de cette réaction permit à Bertrand de reconnaître la présence de la laccase dans un grand nombre de végétaux, et d'émettre l'hypothèse, très justifiée d'ailleurs, que la laccase se trouve répandue dans tout le règne végétal. Voici la nomenclature des végétaux dans lesquels cette diastase a été trouvée :

LAC CASE 3t^^^

Betteraves, rarolles, navels (racines), dahlias (i-acines. lubcrcules). pommes de lerre (tubercules), asperyes (tig<! jaune), balizier (i-bizome), luzerne, trèfle, lay grass (liges et feuilles), lopinaud)()urs. jionimes, ])oires, marrons, gaï"denias (flcm-s), arbre à laque (latex).

Pour l'cxtraclion de la laccasc, sécrétée par les végétaux que nous venons de citer, Bertrand se servit d'une méthode un peu différente de celle employée pour le latex. Le suc extrait des organes parenchymateux des rhizomes ou des tubercules, est précipité aussitôt après son extraction. Quant au liquide extrait des parties xertes de la jîlante, on l'additionne de chloroforme et on l'abandonne à lui-même, à la température ordinaire, pendant 2 4 heures ; il se forme alors un coagulum que l'on sépare du reste du liquide, et c'est dans le liquide fdtré qu'on opère la précipitation par l'alcool. Cette ]H'écipitation se pratique de la même façon que pour le latex de l'arbre à lacjue.

Bertrand a remarqué que la plus grande quantité de laccase est sécrétée par les organes en voie de formation.

Emile Bourquelot et Bertrand recherchèrent la présence de la laccase dans les champignons, x^égétaux qui provoquent, ainsi qu'on lésait, des phénomènes énergiques d'oxydation.

Schunbein, en i856, avait déjà fait la curieuse remarque, qui d'ailleurs resta à l'état de simple observation, que le suc des deux champignons, leBoletus luridus et l'A. sanguineus bleuissait la teinture de gaïac sans addition d'eau oxygénée et jierdait cette faculté lorsqu'il était chauffé à loo".

La présence des oxydases fut recherchée par les saxants français dans plus de deux cents espèces de cryptogames et la réaction du gaïac fut essayée dans les divers organes de ces plantes. Ils examinèrent surtout les Basidiomycètes, c[uelques Ascomycètes, un Myxomycète : le Reticularia maxima, les Polyporés et les Agaricinés. Le Russula foetens Persoon fut tout particulièrement étudié à cause de la parlicularilé qu'ont toutes ses parties de se colorer en bleu par la solution

de gaïac. Les opérateurs coupèrent et broyèrent i25 grammes de Russula, puis les firent macérer dans de l'eau addilionnéc de chloroforme. Le liquide filtré, prenait, au bout d'une heure, successivement les teintes jaune pâle, puis rouge sale ; i! présentait tous les caractères d'une solution de laccase.

La diastase oxydante de ces difïérents végétaux est soluhle. du moins en partie, dans l'alcool, car lorsqu'on ajoute un excès de ce réactif à la solution diastasique, même lorsque celle-ci est fort active, on n'obtient qu'un précipité très faible.

Voici le tableau que Bourquclot et Bertrand donnent comme résumé de leurs expériences :