MILIEUX A L’AMIDON DE BLAIZOT

a) Milieu VT d'entretien.

Jeter 500 grammes de viande de bœuf hachée dans 1.100 grammes d’eau de conduite ; faire macérer six heures à l’étuve à 370 ; filtrer

LA

sur torchon, exprimer le hachis ; faire bouillir le filtrat ; le filtrer

Sur papier Chardin. Reprendre ce second filtrat, le compléter à 1 litre par de l’eau de conduite, ajouter 5 grammes de NaCL et 20 grammes de peptone (Chapoteaut ou marque similaire). Neutraliser, puis alcaliniser en ajoutant 7,5 eme. d’une solution de NaOH 4/100.

Chauffer ce bouillon jusqu’à ébullition. Délayer dans une petite capsule 10 grammes d’amidon avec quelques centimètres cubes d’eau distillée. Au moment où le bouillon arrive à l’ébullition, on lui ajoute le contenu de la capsule et on maintient l’ébullition une minute. On ajoute au bouillon 2,5 grammes de gélose. On porte à l’autoclave pour fondre la gélose, on répartit en tubes et on stérilise. Les tubes sont maintenus verticalement à la sortie de l’autoclave ; la gélose ainsi diluée reste molle après refroidissement.

b) Milieu de récolte.

On incorpore au milieu précédent 3 % de gélose ; on coule en boite de Roux. Au moment de l'emploi, on ajoute à chaque boîte de Roux 10 eme. de bouillon-viande-peptone et on ensemence. Les microbes se développent abondamment à la surface de la . gélose, dans la légère lame de bouillon qui recouvre cette dernière.

c) Milieu à l’amidon-haricots, sans viande.

C’est encore un milieu de récolte, mais un peu moins bon que le précédent. [1 a surtout été créé en vue de l’économie. On fait

tremper 100 grammes de haricots dans un peu d’eau, durant une … nuit à l’étuve à 370. Le lendemain, on les chauffe 20 minutes à l’autoclave dans la même eau. On les passe au presse-purée, on

be.

émulsionne la purée dans un litre d’eau bouillante. On laisse re- froidir, on filtre. On complète à 1.000 centimètres cubes par addi-

… tion d’eau. On ajoute 20 grammes de peptone et 5 grammes de

NaCL. On neutralise, puis alealinise par addition de 7,5 centimètres

- cubes de Na OH. On ajoute 10 grammes d’amidon (4. supra) et

30 grammes de gélose. On coule en boîtes de Roux.

dr

Te

Les cultures sont faites sur gélose recouverte d’une mince lame du même bouillon de haricots. La récolte-est certainement moins abondante que dans le même milieu à la viande. Au total, lécono-

mie est notable.

Vi. — Facteurs de croissance extraits de tissus animaux (Sang). |

119 GÉLOSE SANGLANTE DE PFEIFFER. MÉTHODE MODIFIÉE DE JPA GISCARD:

La méthode classique consiste à étaler à la surface d’une gélose

ordinaire, préalablement coulée et solidifiée en tubes ou en boîtes,

de Pétri, quelques gouttes de sang humain pur et frais.

Giscarp a obtenu de meilleurs résultats en modifiant légèrement la technique. Au lieu de répandre directement, à la surface de la gélose, du sang total et frais, c’est-à-dire dès la sortie des vaisseaux, il n'utilise le sang humain qu’une fois défibriné et laissé vingt-quatre heures à la glacière, ou même à la température ordinaire. [| procède ainsi : à

Prélèvement du sang par ponction veineuse au pli du coude au moyen d’une seringue en verre de 20-30 cmc. La seringue, munie de son aiguille et ainsi prête à servir, a été préalablement stérilisée à l’autoclave dans un gros tube en verre bouché à l’ouate.

Après ponction aseptique et aspiration du sang, celui-ci est immédiatement refoulé dans un ballon à défibriner, flambé avec ses perles de verre.

Avoir soin, dans cette dernière opération, de faire passer le sang non par l’aiguille qu’on aurait laissée montée sur la seringue, mais directement par la tubulure de la seringue après l’avoir l’avoir dégagée de l’embout métallique. C’est une précaution de plus pour assurer une asepsie qui doit demeurer rigoureuse pendant toute la série des manipulations.

Rebouché à l’ouate, le ballon est aussitôt agité pour la défibrination du sang. Lorsque l’opération est jugée suffisante, ce ballon

HS FL

est abandonné tel quel à la glacière, ou encore à la chambre. Dès le lendemain on pourra continuer la préparation du milieu, mais on peut également laisser le sang en réserve, dans ce ballon, à la glacière ou à la température ordinaire, pour ne l’employer que plusieurs jours après, sans qu’il en soit nullement altéré. En tout cas, au moment d'utiliser ce sang défibriné, on aura soin d’agiter à nouveau le ballon pour bien mélanger le liquide surnageant avec les hématies. Cela fait, le sang défibriné, aspiré dans une pipette à boule stérile et de dimension convenable, est réparti dans les tubes de gélose au bouillon peptoné, préalablement inclinée, à raison de V à VIII gouttes par tube. Dans cette opération, le tube est maintenu légèrement incliné et on laissera courir les gouttes de sang sur la surface de la gélose. Ce n’est qu’à la fin de la répar- -tition que le sang de chaque tube est promené avec soin sur toute la surface de la gélose en imprimant au tube des mouvements convenables, et en évitant de faire aller sur ses parois le sang qui laisserait un enduit très gênant pour l’examen de la culture ultérieure. Cela fait, le tube est laissé un moment dans la position inclinée, tandis que le sang recouvre d’une mince couche uniforme Ja surface de la gélose, puis il est relevé verticalement sans se préoccuper si le sang défibriné revient au fond du tube où s’accumulera également l’eau de condensation. Après épreuve de stérilité à l’étuve, les tubes de gélose sanglante sont encapuchonnés et conservés verticalement dans des tambours.

Au moment d’ensemencer sur un tel milieu, on aura soin de procéder, un instant auparavant, à un nouvel étalement, sur la gélose, du sang accumulé au fond du tube, et cela de la même façon que la première fois, en insistant un peu plus, car, ici, les hématies ou leurs débris se sont de nouveau séparés du liquide pour gagner la partie la plus déclive du tube. Aussi, ce mélange des globules rouges plus ou moins détruits, et de la partie liquide surnageante, devra-til être bien homogène avant de cesser l’étalement et de relever le tube (1). Cette fois encore, dès le tube revenu vertical, la plus

4. Poyr faciliter cette manœuvre, par les temps froids, il est recommandé de chauffer légèrement le tube à la flamme.

tan

grande partie du sang défibriné s’accumulera au fond du tube. Il n’y a pas lieu de s’en alarmer : pour si faible que soit la quantité de sang restée adhiérente à la surface de la gélose, elle est très suffisante, le sang paraissant agir dans ce milieu en tant qu’hormone de croissance, plutôt qu’en apportant des matériaux nutritifs, soin qui est ici laissé à la gélose-bouillon peptoné.

L’ensemencement peut être pratiqué dès que tout l’excès du liquide sanguin, que l’on vient d’étaler à la surface de la gélose, a regagné le fond.

En général, 1l ne persiste alors à la surface du milieu qu’un mince enduit rosé qui n’enlève pas à la gélose sa transparence et ne gêne en rien l’examen des cultures. Bien plus, chaque colomie de gonocoque semble,en se développant, écarter le sang qui lenvironne et, tandis qu’elle repose ainsi sur la surface claire et transparente. de la gélose, elle s’entoure d’un mince liseré rouge d’hématies qui facilite beaucoup son repérage. Cette particularité est un grand avantage que possède cette préparation sur tous les autres milieux au sang qui, comme on le sait, sont absolument opaques.

En somme l’on voit qu'entre la gélose sanglante de PFEIFFER et la gélose sanglante de GiscaRp, il y a une différence assez sensible : tandis que dans la première méthode on étend une fois pour toutes, à la surface d’une gélose, quelques gouttes de sang total qui se coagule sur place, dans la deuxième on imprègne cette même surface nutritive d’un liquide qui est en quelque sorte une solution concentrée de substances activantes et cela juste au moment de lPemploi.

Les tubes de gélose sanglante, encapuchonnés, peuvent se conserver longtemps sans que la valeur du milieu s’amoindrisse. Le liquide du fond de chaque tube brunit à la longue, puis devient de moins en moins fluide par évaporation de la partie aqueuse. Aussi, avant qu'il soit trop dense, on aura soin de procéder à son étalement qui, celui-là, sera définitif et remplacera celui qu’on aurait pu faire ultérieurement au moment de l'emploi (1). Dans ces conditions, de

. 1. Si le liquide sanguin du fond du tube était devenu trop visqueux, il suffirait d’ailleurs de le fluidifier par addition de quelques gouttes d’eau physiologique stérile.

Vieux tubes arrivés à un état relativement sec donnèrent malgré tout d’excellents résultats.

120 EXTRAIT GLOBULAIRE DE H. AGULHON ET R. LEGRoUx.

Passer à travers un linge des globules de mammifères — un caillot peut être utilisé — étendre le liquide passé de 4 volumes d’eau physiologique (9 gr. de sel p. 1000), mélanger, chauffer lentement à 75° en agitant régulièrement dès que la température approche de 650, maintenir à 750 pendant 15 minutes, filtrer sur papier, clarifier et stériliser par filtration à la bougie Chamberland F. Répartir en tubes stérilisés.

L’extrait globulaire filtré sera laissé en tubes bouchés à l’ouate.

Les solutions obtenues par cette méthode, ajoutées aux milieux de culture usuels à la dose de 5 à 10 pour 100, permettent d’obtenr d’abondantes cultures de B. de Pfeiffer. A doses faibles (14 %), on obtient encore des résultats positifs, mais les cultures se développent lentement et sont moins épaisses : les colonies restent

petites.

Les sangs d'oiseaux, d’anguille, de cheval donnent les mêmes résultats.

L'extrait globulaire peut être ajouté aux milieux nutritifs liquides, être incorporé à de la gélose fondue ou à de la gélatine fondue, être répandu à la surface de tubes ou de boîtes de gélose ou de gélatine ayant fait prise. On l’associe parfois au sérum hquide.

139 SUCCÉDANÉ DE L'’ASCITE DE LEGROUx.

Ce succédané de l’ascite, ajouté aux milieux usuels, permet d'obtenir facilement la culture des méningocoques, il donne d’abondantes récoltes avec quelques bactéries telles que le pneu-

. mocoque et le streptocoque. Il est d’une confection aisée, peu

coûteuse, et, sauf pour l’isolement du gonocoque, remplace l’ascite humaine.

On peut employer un sérum de bœuf, de cheval ou d’un autre

animal ; ce sérum peut être recueilli sans précautions d’asepsie ; on le décante lorsqu'il est limpide.

Préparation :

SUN TS. RER Eee 600 emc.

Mormolrdu CoMIMErCe PR RER EEE Tr 1 cmc.

agiter pour bien mélanger, puis étendre avec

HautdisEtllée CREER ES EE ER De 1.200 crc.

cette eau est parfois acide au rouge de méthyle et même au tournesol, ce qui est loin d’être nuisible. Répartir après mélange, en tubes, en ampoules ou en ballons, et stériliser à Pautoclave à 1129, 1150 un temps variable suivant le volume contenu dans les paniers. Pour constituer les milieux de culture, ajouter par tube (contenant 7 à 8 eme.) de milieu usuel, { eme. du sérum formolé ; il est inutile et même nuisible d'en mettre une plus grande quantité.

VII. — Facteurs de croissance extraits d'autres substances animales.

140 MiLiEU AU JAUNE D’ŒUF, DE BESREDKA:

Prenons vingt œufs, Réunissons leurs jaunes (350 cmc.) dans un grand verre à pied et ajoutons un litre d’eau distillée. L'eau doit ètre pure et avoir une réaction neutre ; dans le cas où elle serait acide, on commence par la neutraliser.

Reste à clarifier l’émulsion au moyen d’une solution de soude à 1 p. 100. Ce temps est le plus délicat de la préparation ; l’exces de soude rend le milieu impropre à la culture, le défaut de soude nuit à la transparence du milieu.

On évite ces écueils en versant d’abord une quantité de soude égale à la moitié de la quantité de jaunes réunis ; ainsi, à 350 eme. de Jaunes on ajoute — par petites portions — 175 eme. de solution de soude à ? p. 100. On s’arrête un moment pour s'assurer du degré de la solubilisation ainsi réalisée ; puis, on procède à de petites

RTL LE

additions de ? à 1eme. 5 de soude, en aspirant chaque fois le jaune dans une pipette: On suit de la sorte la clarification :

: celle-ci est

arrivée au point optimum lorsque le liquide apparait transparent en couche mince, dans la pipette par exemple, et qu'il reste légerement opaque en couche épaisse, vu à travers les parois du verre à pied. Une dizaine de centimètres cubes ajoutés aux 175 CM. précédemment versés y suffisent généralement.

Avec de l’eau distillée on complète jusqu’à obtenir — dans le cas particulier — sept litres de liquide, dans lequel le jaune est

représenté dans la proportion de 1 : 20 (350 : 7000 = 1 : 20). Le milieu est réparti en boîtes de Roux (50 à 150 eme.) et stérilisé à 1100 pendant vingt minutes.

Il est bon d’être prévenu que la quantité de soude nécessaire - pour dissoudre le jaune d’œuf n’est pas toujours la même ; ainsi, nous avons rencontré des jaunes dont la dissolution demandait

d'indiquer.

159 Miieu À L'ŒUF coMPLET, DE F. M. Hunroon.

Bœuf haché (cœur ou muscle aussi frais que possible)

nee 00 gr.

PeépionerBacto (marque: äméricaimie). 442.1, 30,5. t00. Dre 10 gr. Gélose (après l’avoir pesée, la mettre à gonfler dans l’eau)... 16 gr SONDE RE ER NT DRE CPR LEE PR CPE CIRE MERE OA D gr. AP OL men md needed le aie saut de ale 2 de 2 D de 1eor A ie Mine de ane. 1.000 gr.

Chauffer en remuant jusqu’à 680 (pas plus haut), alcaliniser faiblement au tournesol, ajouter alors 1 cmc. de soude normale par litre. Chauffer au bain-marie à 1000 1 heure, décanter alors le ‘—Hquide du coagulum formé en s’aidant d’une baguette de verre, réchauffer le liquide trente minutes à 1000, Laisser refroidir 10 minutes dans une position inclinée, séparer la portion liquide en l’as-

pirant dans une pipette à boule. Placer alors le liquide dans une | éprouvette cylindrique pour 15 à 20 minutes jusqu’à ce que la graisse présente se soit solidifiée à la surface et puisse être enlevée. Répartir, stériliser à 1000.81 le milieu est par trop trouble, clarifier

presque deux fois moins de soude que la quantité que nous venons

par sédimentation ou centrifugation, ou filtrer sur coton de verre ou amiante cardée.

169 GÉLOSE AU TESTICULE DE TAUREAU FRAIS, DE J.-B. GiscARD.

Hâcher 250 grammes de testicule de taureau (1) après avoir enlevé la vaginale. Mettre le hachis à macérer dans 500 emc. d’eau ordinaire pendant 24 heures. Puis, filtrer cette macération sur papier Chardin d’abord, sur bougie LS ensuite (Giscard se sert de filtres de Martin, dits «pour essais», grand modèle). Le filtrat, une fois éprouvé 24 heures à l’étuve, est ensuite réparti aseptiquement dans des tubes contenant de la gélose nutritive ordinaire à 3 %, de réaction neutre, préalablement stérilisée et maintenue en surfusion vers 459-500,

Le mélange est fait dans la proportion de 1 partie de filtrat pour 5 parties de gélose. Homogénéiser le contenu de chaque tube par rotation. Incliner.

1. On peut se contenter d’opérer sur une petite quantité de testicule,

car, dans cette formule, la macération de testicule ne rentre qu’en faible

proportion dans chaque tube de milieu.

Vu : le Président de la thèse, A. LEMIERRE.

Vu : pour le Doyen, l’'Assesseur, BALTHAZARD. :

Vu et permis d'imprimer : Le Recteur de l’Académie de Paris.

CHARLÉTY.