TECHNIQUE

lo Examen des parasites vivants. — Get examen est très simple et très instructif; il permet d'observer les mouvements des Hématozoaires, d'assister à certaines de leurs transformations, enfin de reconnaître aisément les différentes espèces. On devra, autant que possible, examiner le sang de malades n'ayant pas encore pris de quinine, et le recueillir un peu avant l'accès ou dès qu'il commence. On lave le doigt du malade au savon, puis à l'alcool, on fait à la pulpe une légère piqüre avec une aiguille ou une lancette préalablement flambée. On presse légèrement afin de faire sourdre une goutte de sang. On essuie la première goutte avec un linge propre et on recueille la seconde et les suivantes sur une lamelle couvre-objet très bien nettoyée; on la place ensuite sur une lame porte-objet, que l’on vient d’essuyer rapidement afin d'enlever les poussières de atmosphère, qui auraient pu s’y déposer. Le sang se répand immédiatement en une couche très mince, sans qu’il soit nécessaire d'exercer aucune pression sur la lamelle et on l’examine séance tenante

avec un objectif à immersion, après avoir déposé une goutte d'huile de cèdre sur la préparation.

On peut même colorer le parasite vivant : on dépose sur la lame couvre-objet, à côté de la goutte de sang, une goutte d’une solution de bleu de méthylène dans le liquide physiologique composé de 0 gr. 75 de chlorure de sodium pour 100 centimètres cubes d’eau. On recouvre le tout d’une lamelle; les deux liquides se mélangent et au bout de quelque temps les parasites ont absorbé la coloration, qui n’est pas toxique pour eux. On peut alors les distinguer plus facilement et observer leurs mouvements sur un fond incolore.

2 Fixation et coloration. — Si l’on veut conserver les préparations, il faudra d’abord les fixer, puis les colorer. Pour cela, on recueille une goutte de sang, en prenant les mêmes précautions que précédemment, à l’une des extrémités d’une lame de verre préalablement chauffée et on l’étalerapidement sur toute sa largeur avec une lamelle, un morceau de carton bristol ou une simple feuille de papier à cigarettes. On obtient ainsi une couche de sang très mince qu’on laisse sécher. La fixation se fait en passant la préparation deux ou trois fois dans la flamme d’une lampe à alcool ou mieux en la plongeant pendant quelques minutes dans un mélange à parties égales d'alcool absolu et d’éther. Les préparations ainsi fixées. se conservent à sec indéfiniment el peuvent être envoyées des pays les plus éloignés pour être ensuite colorées et examinées dans un laboratoire,

Les colorants qui peuvent être employés sont la fuchsine ou lPhématéine, mais ceux-ci ont l’inconvénient de colorer uniformément tous les éléments. Aussi a-t-on recours à la double coloration par l’éosine en solution dans l’alcool à 600 et le bleu de méthylène en solution dans l’eau. On a ainsi uue préparation où les globules rouges sont colorés en rose par l’éosine et où les Hématozoaires et les globules blancs

De

sont colorés en bleu par le bleu de méthylène. On distingue toujours très facilement les globules blancs des parasites à leur gros noyau de forme très irrégulière et qui se colore beaucoup plus que le reste du-globule. Rien de semblable chez l’'Hématozoaire, dont la coloration est uniformément bleu clair. |

Si l’on veut étudier la structure intime du micro-organisme il faut employer la méthode Romanovsky où une méthode analogue. On peut faire dissoudre d’une part 10 grammes de bleu médicinal de Hôücasr dans 100 centimètres cubes d’eau et filtrer après vingt-quatre heures à une température d’environ 24° ou 25°. D'autre part, on se sert de l’éosine de Hôücusr en solution aqueuse à 1 pour 160. On mélange les deux colorants dans la proportion de 2 centimètres cubes de la solution de bleu de méthylène pour 5 centimètres cubes d’éosine et on laisse agir le mélange pendant vingt minutes ou une demi-heure. On peut ainsi colorer et bien mettre en évidence le noyau de l’Hématozoaire. Les préparations colorées, il suffit de les laver, de les sécher et de les conserver ainsi ou montées dans le baume.

Récemment Laveran (83) a modifié la méthode de Romanovsky; voici la description qu’il donne de son procédé :

« J’emploie les réactifs suivants qui doivent être préparés à l’avance:

« 1° Bleu de méthylène à l’oxyde d'argent ou bleu Borne. Dans une fiole de 150 centimètres cubes environ, on met quelques cristaux d’azotate d'argent et 50 à 60 centimètres cubes d’eau distillée ; quand les cristaux sont dissous, on remplit la fiole avec une solution de soude et on agite; il se forme un précipité noir d'oxyde d'argent, qui est lavé à plusieurs reprises à l’eau distillée,de manière à enlever l'azotate de soude et l’excès de soude. On verse alors sur l’oxyde d’argent une solution aqueuse saturée de bleu de méthylène pré-

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parée avec du bleu de méthylène médicinal de Hücusr; on laisse en contact pendant sept à huit jours en agitant à plusieurs reprises.

« 2° Solution aqueuse d’éosine à 1 p. 100 (éosine soluble dans l’eau de Hücasr).

« 3° Solution de tanin à 5 p. 100.

« IL est bon de mettre dans les fioles qui contiennent les solutions d’éosine et de tanin de petits morceaux de camphre, afin d'empêcher la production des Moisissures.

« Pour colorer une préparation de sang, on procède comme il suit :

« Le sang, desséché en couche mince à la surface d’une lamelle couvre-objet, est fixé par l’alcool absolu (20 minutes environ). ;

« On prépare, au moment de s’en servir, le mélange colorant d’après la formule suivante:

Solution d’éosine à 1 p. 100......... . l centimètres cubes, HAUSAISLEIÉES PR RE RE RES Ai — Bed BORREL. SR DEN, SPNee PRE —

« On se sert pour préparer ce mélange d’une petite éprouvette graduée ; les solutions d’éosine et de bleu de méthylène sont filtrées séparément au moment où se fait le mélange; on agite avec une baguette de verre, et l’on verse le liquide colorant dans un godet de porcelaine. La lamelle sur laquelle le sang a été desséché est placée à la surface du liquide, de manière à ce qu’elle surnage pendant que la coloration s’opère.

«Si le sang a été desséché sur une lame porte-objet, on colore dans une boîte de Péri, par exemple, en ayant soin de placer la surface recouverte de sang de manière à ce qu’elle baigne dans la partie supérieure du liquide, sans que le précipité qui se forme toujours plus ou moins rapidement vienne s’accumuler à sa surface.

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«Sile sang a été recueilli récemment, il suffit, pour la coloration de la chromatine de la plupart des Hématozoaires et notamment de l’'Hématozoaire du paludisme, de laisser la préparation pendant cinq à dix minutes dans le liquide colorant. Pour la coloration de la chromatine des Hématozoaires endoglobulaires des Oiseaux et des flagelles, il est nécessaire de laisser les préparations pendant plusieurs heures et quelquefois pendant douze heures dans le bain colorant.

« Lorsque le sang est desséché depuis longtemps, la coloration se fait plus lentement que lorsque la dessiccation est récente ; j'ai réussi cependant à obtenir de bonnes colorations de la chromatine des Hématozoaires du paludisme dans des préparations de sang qui dataient de plusieurs années.

« Pour la durée de la coloration, quelques tâtonnements sont inévitables, car cette durée varie avec la nature des Hématozoaires, avecle temps qui s’est écoulé depuis que le sang a été recueilli et desséché, et aussi avec les solutions d’éosine et de bleu de méthylène, dont le pouvoir colorant n’est pas toujours le même.

« Lorsqu'on suppose que la coloration est suffisante, la préparation est lavée à grande eau, puis soumise à l’action de la solution de tanin pendant une minute environ; on lave de nouveau à l’eau distillée et on sèche.

« Avant de monter dans le baume, on examine la préparation à sec; si la coloration est trop intense ou s’il existe un dépôt granuleux abondant, on lave à l’alcool absolu.

« Les hématies doivent être colorées en rose et les novaux des leucocytes en violet foncé. Le protoplasma des Hématozoaires se colore en bleu pâle, la chromatine en violet ou en rouge violacé.

« La solution de bleu Bonrez doit être renouvelée lorsqu’elle donne rapidement un abondant précipité, après son

mélange à la solution d’éosine. »

MORPHOLOGIE n,

Nous examineronssuccessivementles trois espèces d’Hématozoaires pathogènes pour l'Homme et nous donnerons ensuite sous forme de tableau leurs caractères différentiels.

Plasmodium malariæ (Laveran, 1881) (pl. Il). — Quelque temps après avoir, pénétré dans le globule rouge, le parasite se présente sous la forme d’un petit organisme ovoïde, transparent, d'environ 3 p de diamètre. Il est assez réfringent pour que la limite de son contour apparaisse avec netteté. Plusieurs parasites peuvent occuper la même hématie. Le jeune Plasmodium émet lentement des pseudopodes, et si on l’examine un certain temps de suite, on peut observer ses mouvements amiboïdes. Il grandit et, au bout de deux jours environ, on voit apparaître au milieu du protoplasma quelques grains de pigment situés à la périphérie ou tous réunis d’un même côté. Ce pigment, provenant de la dégénérescence de l’hémoglobine du globule envahi, a aspect de grains grossiers ou de bâtonnets de couleur brun obscure et p eu mobiles. Les courants protoplasmiques, mis en évidence par les grains de pigment, sont très lents, souvent même inappréciables.

Le globule rouge parasité conserve son contour régulier; tantôt 1l garde sa dimension et sa coloration, tantôt il se rétracte et devient plus foncé que les globules sains. Le troisième jour, le parasite prend l’aspect d’un corps arrondi, quelquefois elliptique, transparent, pigmenté, entouré d’une petite zone foncée, reste de l’hématie, qui finit par disparaitre au bout de soixante heures.

Parmi les formes adultes, les unes se segmentent dans le sang même de l'Homme, donnant des Mérosoites, appelés S'porozoiles où S'pores ; ce sont les Sehizontes, Monontes ou S'porocytes, suivant les auteurs, Les autres concourent à la

reproduction sexuée et ne peuvent évoluer complètement que chez un hôte intermédiaire qui est le Moustique (Anopheles), ce sont les Gamètes ou Gamétocytes, les unsmäles, les autres femelles.

Les schizontes, arrivés à maturité, sont plus petits qu’un globule rouge normal; ils perdent leur mobilité et le pigment augmente à leur intérieur. Celui-ci se rassemble bientôt au centre, se disposant en rayons allant de la périphérie au centre. À ce moment, on voit apparaître à la périphérie du schizonte de petits points plus réfringents, puis des rayons bien nets partageant le protoplasma en secteurs sphériques, de sorte que le corps segmenté a tout à fait la forme d’une marguerite. Le nombre des mérozoïtes mis en liberté varie de 6 à 12. Pour passer de la forme jeune à la forme sporulée, le parasite met soixante-douze heures. Comme, d'autre part, c’est au moment de la sporulation ou schizogonie qu’a lieu Paccès, il produira la fièvre quarte. La schizogonie a lieu surtout dans le sang périphérique, mais aussi dans celui des organes.

On observe quelquefois des formes libres, pâles et extracellulaires qui se remplissent de vacuoles, se déforment et se fragmentent; ce sont vraisemblablement des formes de dégénérescence du parasite.

Les gamètes, mâle et femelle, se présentent sous l’aspect de corps sphériques distincts des schizontes adultes surtout par la grande mobilité du pigment. Leur taille varie de la moitié au double d’un globule normal. Si l’on examine du sang paludique frais dix à quinze minutes après la ponction du doigt, on peut étudier les gamètes mâles. Ces gamètes, appelées encore gamétocytes mâles ou microgamétocytes, correspondent aux corps flagellés décrits par LaveraN.

Voici comment ils se forment : le pigment devient d’abord extrêmement actif et l’on voit apparaître sur un ou plusieurs

points de la périphérie du microgamétocyte de très fins filaments mobiles, les {agella, microgamèles où spermoïdes, tandis que le pigment occupe toute la masse de l’organisme moins la périphérie; dans tous les cas, il ne se rassemble jamais en une petite masse centrale comme cela a lieu dans les schizontes. Les microgamètes ont un contour très régulier et sont renflés à leur extrémité libre. Leur longueur ne dépasse généralement pas deux ou trois fois la longueur du corps qui leur a donné naissance. Ils sont extrêmement mobiles et leurs mouvements perpétuels déplacent rapidement les globules rouges situés au voisinage du parasite. Le pigment, toujours très actif, peut passer en partie de l’intérieur du parasite à l’intérieur d’un flagellum. Après un temps plus ou moins long, les microgamètes se séparent de l’organisme qui les à produits et s’agitent libres dans le sang, présentant des mouvements d’ondulation très actifs. Ces mouvements peuvent durer trois quarts d'heure; puis graduellement les mouvements cessent et les flagella ne peuvent plus être aperçus dans le champ du microscope. Le parasite se déforme et finit par disparaitre complètement.

Les microgamétocytes ou corps flagellés, non seulement ne se forment jamais dans le sang qui cireule, mais ils meurent très vite dans le sang retiré des vaisseaux, n’y trouvant pas un milieu propice pour continuer à évoluer. Leur évolution complète ne peut avoir lieu que dans le tube digestif de certains Moustiques, comme nous le verrons au chapitre de la reproduction.

Plasmodium vivax (Grass et Fecern, 1890) (PI. Il. — Le jeune Hématozoaire est un petit corps sphérique ou ovoïde, transparent et réfringent, situé à l’intérieur d’une hématie. Il mesure de 3 à 4 » de diamètre. Doué de mouvements amiboïdes actifs, son aspect change constamment. Il à tantôt la forme d’une croix, tantôt celle d’une étoile, tantôt une forme

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plus irrégulière encore; il prend quelquefois l’aspect d’un anneau quand il ÿ a fusion de l’extrémité libre de deux pseudopodes englobant à leur intérieur une portion de globule, On peut rencontrer dans le même globule rouge plusieurs de ces organismes. Au bout d’un certain temps, se forment aux dépens de l’hémoglobine, à l’intérieur du Plasmodium, de fines granulations pigmentaires d’un brun foncé. Ces grains sont doués de mouvements très actifs; ils semblent danser au milieu de la masse protoplasmique. À ce moment le parasite présente des mouvements amiboïdes très prononcés; il est moins réfringent et souvent très difficile à bien délimiter, son contour ayant perdu beaucoup de sa netteté primitive.

Si l’'Hématozoaire est mis en liberté dans le sérum à ce stade, par suite de l'éclatement accidentel du globule, il a l’aspect d’une petite masse claire, pigmentée, qui peut se diviser, restant unie par un mince filet protoplasmique, et qui devient de plus en plus pâle, puis, bientôt, tout à fait indistincte.

Au bout de vingt-quatre heures environ, le parasite occupe à peu près la moitié du globule rouge. Ce dernier augmente de volume et perd graduellement sa coloration première. Les mouvements amiboïdes sont moins actifs et le pigment devient de plus en plus apparent. Après quarante heures, le Plasmodium à atteint la taille d’un globule rouge normal; il envahit presque complètement le globule parasité, dont il ne reste qu’un anneau très pâle.

Le schizonte du Plasmodium vivax est une masse sphérique transparente, de diamètre sensiblement plus grand qu’un globule rouge normal. À son intérieur se trouvent des grains très fins et très mobiles de pigment brun clair. Au moment de la schizogonie, le pigment se réunit au centre du schizonte pour former une masse assez compacte et on