PAS

Il s’agit maintenant d'isoler les espèces qui peuplent ces cultures, et d’y caractériser, si possible, le microbe des nodosités.

La culture À m’a fourai trois espèces : deux bactéries sporogènes et un bacille représenté sur six tubes par trois colonies; Les colonies de bactéries sont beaucoup plus nombreuses; l’une d'elles, que j'appelle 4, présente un aspect particulier; elle s’étend à la surface de la gélose, en donnant des arborescences tout à fait comparables à celles que l’eau congelée forme snr les vitres. L'autre bactérie donne des colonies riches et chagrinées; elle n'offre aucun intérêt.

Le bacille forme des colonies proéminentes, pâteuses, qui s’étalent en vieillissant ; je l'appelle b.

La culture B renferme un plus grand nombre d'espèces; je n’en ai conservé qu'une seule, un bacille très mobile assez semblable comme aspect au microbe des nodosités.

Les microbes a et b attirent l'attention par la régularité avec laquelle ils se succèdent dans la culture; j’ai déjà dit que la bactérie apparaît la première, envahit tout le tube, et donne des spores ; puis le bacille b se développe à son tour, et dans la culture de huit jours, il semble qu’il soil seul; on ne trouve plus ni spores ni bactéries. En séparant les espèces contenues dans une culture âgée, afin d’être plus sûr d'obtenir les microbes producteurs de mucosité, je n’ai obtenu que 3 colonies de bacille b. Ceci m’a fait penser que la bactérie « doit présenter un stade bacillaire qui ne serait autre que 6.

Pour établir les relations qui existent entre ces deux formes, j'ai isolé à nouveau la bactérie 4 du sol. Rien n’est plus facile : cette bactérie est très répandue à la surface de la terre arable; et comme elle se reconnaît facilement à son mode de développement, on l’obtient à l’état de pureté au bout de sept ou huit jours. Voici comment : on prend un fragment de colonie, on le dépose au milieu d’un tube de gélose. En moins de 48 heures, la bactérie s'est propagée à plus de 2 centimètres du point d’origine; on détache un fragment périphérique qu’on dépose sur un autre tube. En répétant cette opération trois ou quatre fois, on est parfaitement sûr d’avoir éliminé toutes les impuretés. En culture pure, la bactérie 4 donne de longs filaments qui rayonnent en tout sens, se croisent et se groupent en faisceaux visibles à l'œil nu, légèrement proéminents etadhérant fortement

É à la gélose ; des filaments diffus et nuageux pénètrent dans le | substratum et l’envahissent lentement. Au bout de 24 heures, les filaments les plus âgés renferment déjà des spores. Après 3 à 4 jours, ces spores germent en donnant naissance à des filaments analogues aux premiers, mais plus courts et plus gros, la culture revêt alors un aspect humide et se laisse détacher assez facilement de sa gélose. Cette seconde génération sporule très lentement à son tour, et les spores une fois formées se conservent indéfiniment. Ce n’est pas là le seul processus de repro duction que les formes courtes présentent. Au bout de quinze jours on voit poindre un peu partout de petites colonies laiteuses qui augmentent de volume ; elles sont fournies par un bacille court, noyé dans une mucosité abondante. Si on ensemence une parcelle de ces colonies, on n'obtient que la forme bactérienne et le processus recommence. = On peut l'activer par la chaleur, par l'emploi des milieux acides placés à 35°, etaussi par la concurrence vilale, comme cela se passait dans la culture A.

Les formes courtes, avant de se résoudre en coccobacilles, pré-

sentent dans chaque article une, deux ou trois condensations protoplasmiques, suivant la rapidité de la transformation. Ces granulations absorbent peu à peu la masse de Ja bactérie, et, une foisindépendantes, elles se reproduisent sur place on donnant des colonies laiteuses. La fig. 9, PL.IT, représente cette évolution, et la fig. 6, PL II, reproduit les coccobacilles libres. : La forme bacillaire ne se fixe qu'à la longue, et c’est pour cela, précisément, que les colonies du bacille L étaient si rares alors qu’on s'attendait à n’obtenir qu’elles. Le bacille b est em effet le stade dissocié et mobile de la bactérie «4. En partant d’une culture pure de cette dernière, on arrive à obtenir en huit jours des cultures identiques comme aspect à celles que l'on obtient en ensemençant directement le bacille b. Dans les deux cas la mucosité est abondante,d’une couleur rosée quandelle est épaisse, et virant au rouge orangé par la dessiccation *.

4. Donnons en passant les caractères que présente la bactérie a sur quelques milieux de culture. Ce qui précède se rapporte à la gélose de haricots.

Sur gélose de viande elle est beaucoup plus stable.

Dans les bouillons, elle forme des zooglées hyalines qui restent longtemps en suspension dans le liquide. Au bout de plusieurs semaines elles se désagrègent et tombent au fond des récipients en formant un dépôt pulvérulent, renfermant des bacilles fins et des spores.

Ceci étant établi, nos investigations se borneront désormais à identifier les deux bacilles b et c avec le microbe des nodosités. Tous deux produisent une mucosité abondante, légèrement lactescente avec b, et très hyaline avec c ; le plus souvent, la mucosité fabriquée par le bacille authentique est intermédiaire entre les deux. On sait en outre que celui-ci ne liquéfie pas la gélatine, qu'il possède un stade ramifié qui apparaît dans des conditions déterminées, qu'il fixe de l’azote dans les milieux de culture, et enfin qu'il produit des tubercules par inoculation aux

légumineuses.

Voyons si les bacilles b et c possèdent ces propriétés. Culture sur gélatine. — b liquéfie la gélatine d’une façon

irrégulière; si on l’ensemence en siries, il se développe une traînée grisâtre très proéminente; quelquefois des excavations se forment sur son trajet ; leurs bords sont taillés à pic, la liquéfaclion ne se généralise jamais.

c ne liquéfie pas la gélatine.

Formes ramifiées. — L'action de la température de 35° est sans action sur les microbes b etc; ils s’y habituent très facilement, et se développent aussi abondamment et plus vite qu’à la température de la chambre. |

Lorsqu'on fait usage, à 35°, de gélose additionnée de 14/1000 d’acide tartrique ou d'acide oxalique, le bacille b forme des filaments composés généralement de deux segments dont les extrémités paraissent vides et ne prennent pas la couleur. Pour observer les formes ramifiées, il faut examiner des cultures de 24 heures; elles sont alors constituées par des colonies sèches, aplaties, très minces, comme de légères écailles ; elles renferment des bâtonnets enchevêtrés présentant souvent des renflements et des ramifications très nettes.

Au bout de 48 heures, les filaments commencent à se segmenter en boules, et à partir de ce moment la mucosité se forme ; dans les cultures de 3 à 4 jours on ne trouve plus de formes longues et ramifiées.

Le bacille c s’est montré complètement réfractaire à cette

Elle liquéfie énergiquement la gélatine, et se comporte ensuite dans le liquide comme dans les bouillons.

Elle ne coagule pas le lait; elle se développe très bien sur pomme de terre glycérinée, mais perd son aspect particulier : elle forme un épais enduit glaireux.

transformation; j'ai fait une série de trente réensemencements successifs, d’abord toutes les 24 heures, puis à huit heures d'intervalle; à aucun moment il n’a présenté de formes rameuses ; J'ai arrosé des cultures âgées de huit heures avec quelques gouttes d'acide oxalique au 1/300; il n’en a pas trahi la moindre gène dans son développement.

Les microbes présentaient cependant des modifications assez prononcées vers le quinzième passage : quelques-uns avaient la forme de point d'exclamation; leur contenu, d'une manière générale, était granuleux et vacuolaire. Le 15° passage a servi à ensemencer un tube de gélose alcaline; la culture a été conservée à la température de la chambre. Le 30° passage a été exposé à la température de 35° pendant 30 jours, puis ensemencé sur milieu alcalin et conservé à la température de la chambre. Nous la retrouverons plus loin,

Fixation de l'azote libre. — Pour étudier le pouvoir fixateur des bacilles b et c vis-à-vis de l’azote libre, j'ai employé la méthode habituelle. Le tableau suivant contient le résumé des résultats obtenus :

Désignation des cultures. Sucre initial. Sucre consommé. Az. init. Az, final, Az. gagné, mgr. mer, mgr. mgr. mer.

No 4 (b) 1500 » 19,5 22.8 3,3 2 (c) id » 19,5 25,5 6,0 3 (b) 1750 585 1,1 7,4 0,4 4 (0) id. 1376 7,1 10 2,9 5 (b+c) id 1307 7,1 13,4 6,3

Les cultures n°° 4 et 2 ont été beaucoup plus actives que les n® 3 et 4. L’explication se trouve peut-être dans la composition des bouillons; ce qui montre d’ailleurs que le second n’est pas favorable, c’est l’apparition des spores dans le n° 3. Par contre les deux formes associées doublent la quantité d'azote initial ; ceci prouve que les deux microbes s’influencent favorablement, à l'instar des formes différenciées des microbes des nodosités. L'aspect des cultures concorde bien avec ces résultats, d’après ce que l’on sait des relations de la mucosité avec l'azote gagné. Dans le vase n° 5, le bouillon est littéralement gélatinisé.

Inoculation des plantes, — Jusqu'ici, 1l ny a pas concordance complète entre les caractères du bacille c et ceux du microbe

CRT

des nodosités; b seul répond à toutes les exigences; c possède à un haut degré la faculté de fixer l'azote libre, maïs il ne produit pas de formes rameuses. LIRE des plantes va trancher la question. | |

J'ai inoculé les formes microbiènnes suivantes en employant encore des vesces de Narbonne végétant en milieu stérile.

1° Bactérie a ; 2° bacille b ; 3° bacille c; 4° a + b; 5° a + c:; 6° c+b. Les plants inoculés avec (c + b) seuls ont donné des résultats positifs, qui ont été confirmés nr ee par une nouvelle série d'expériences. |

Si on rapproche ces résultats de ceux qu’on a obtenus avec les formes différenciées du bacille authentique, on saisit facilement l'harmonie qui:existe entre eux; et comme on a déjà établi que les variétés de microbes, étudiées dans le chapitre précédent, appartiennent à, une espèce unique, on est en droit de conclure que les deux microbes b et & constituent aussi deux formes différentes des microbes des nodosités.'

On connaît donc maintenant la forme de résistance de ce microbe: c’est la bactérie a; mais, à côté de cette forme de résistance, il y en a d’autres qui vivent à l’état de liberté dans le sol, comme des microbes saprophytes: le bacille c est de ce nombre. Comme c’est lui qui, se rapprochait le plus de la forme typique, parmi toutes les espèces qui peuplaient la culture B, c’est à lui que j’ai donné la préférence dans mes démonstrations. Il se peut que toutes les autres éspèces qui poussaient à côté de c soient distinctes du microbe des nodosités. Néanmoins il existait dans cette culture un ensemble d'espèces qui s'influençaient d’une manière favorable. Aucune des espèces associées ne donnait en culture pure un développement comparable à celui qu'atteignait la culture B, et le bacille c lui-même n’a fourni ce résultat qu’à la suite dan grand nombre de passages sur gélose.

La bactérie « est un microbe immobile; elle est incapable d’obéir aux actions chimiotaxiques exercées par la racine des légumineuses; elle ne s'implante pas sur ces organes; ce sont les formes libres et mobiles seules qui produisent l'infection des plantes.