CHAPITRE VII

Méthodes et techniques (1).

1° Récolte et conservation des éléments d'examen :

A. — Sur une lésion pilaire.

B. — Sur une lésion non pilaire.

2° Examen microscopique.

A. — Examen extemporané pour le diagnostic.

B. — Préparations stables non colorées et colorées.

3° Cultures.

A. — Choix du milieu nutritif, vases de culture, aération. Température.

B. — Méthodes d’isolement du parasite.

1° Isolement du parasite d'une lésion pilaire.

a. Méthode simple.

b. Méthode de Kral.

2" Isolement du parasite d’une lésion non pilaire.

a. Sur une lésion non suppurée.

b. Sur une lésion suppurée.

C. — Cultures en gouttes suspendues pour l'étude mycologique.

4° Inoculations expérimentales.

1° Récolte et conservation des éléments «l’examen.

A. — Sur une lésion pilaire. — L’étude des trichophytons ne peutètre faite sur tous les poils qui existent a la surface d’une trichophytie pilaire ; on ne prendra pas indistinctement tous les poils, mais seulement ceux qui sont cassés et qui se rompent au ras de l’épiderme quand on les saisit à la pince.

Tout poil qui vient à la pince dans toute sa longueur et avec sa racine est un poil sain, il doit être rejeté pour l’examen microscopique ou l'ensemencement.

On se rapcllera que les poils envahis par le parasite sur les trichophyties animales sont entourés d’une gaine grisâtre, visible à l’œil nu.

Les poils majades sont enlevés à l’aide d’une pince à épiler flambée et sont déposés ensuite entre deux lames de verre préalablement flambées et refroidies. On enveloppe ces lames d’une feuille de papier blanc et l’on peut ainsi trans-

(1) Ce chapitre n’est que l’indication résumée et aussi brève que possible de la technique que j’emploie depuis plus de trois années.

porter et conserver pendant plusieurs mois des échantillons virulents de poiltrichophytiques.

B. — Sun UNE LÉSION DE LA PEAU GLABRE. — 1° Si la Union est sèch: et squameuse, enlever par grattage, à l’aide d’une petite curette flambée, les squames épidermiques et les conserver comme les poils.

2o Dans le cas d’une lésion suppurée, ensemencer immédiatement le pus des vésico-puslules ou étaler le contenu de ces vésieo-puslules sur des lamellede verre pour l’examen microscopique immédiat. Si l’on désire transporter ou conserverie pus, l’aspirer avec une fine pipette de verre stérilisée que l'on introduit directement dans les pustules et que l’on ferme ensuite à la lampe.

2° Examen microscopique.

Cet examen doit toujours être pratiqué avec un grossissement assez fort, 300 diamètres environ (object. 7, ocul.3. Leitz). Pour l’éclairage il faut une source de lumière vive, mais un diaphragme de faible ouverture, 2 à 4 millim. seulement. L’ouverture trop considérable t du diaphragme expose l'observateur a ne plus distinguer les éléments très réfringents du parasite.

A. — Examen extemporané pour le diagnostic. — On dépose les poils ou les squames à examiner sur une lame de verre dans une goutte de solution aqueuse de potasse (potasse caustique : 40 grammes, eau distillée : 60 gramme.-'. On recouvre d’une lamelle de verre, puis on chauffe doucement a la flamme d’une lampe à alcool ou d’un bec Bunsen, sans aller toutefois jusqu’à l’tbullition qui pourrait dissocier les éléments du parasite.

En trois à quatre secondes la préparation est suffisamment éclaircie pour l’examen microscopique.

B. — Préparations stables non colorées et colorées. — 1- < ni commence par éclaircir les poils ou les squames par l’un des deux procèdes suivants :

a) Dans un verre de montre placé sur une platine chauffante, chauffer doucement et sans aller à l’ébullition les éléments d’examen dans la solution aqueuse de potasse ; au bout de quinze à vingt minutes l'éclaircissement est suffisant.

h) Passer successivement l*s poils ou les squames dans un mélange d'alcool et d’éther à parties égales (24 heures), puis dans l’alcool absolu (12 heures), enfin dans la solution de potasse à froid (6 à 12 heures).

2o Quand le poil ou les squames sont éclaircis on peut les examiner non colorés ou colorés.

Dans le premier cas on transporte le poil, au sortir de la potasse, dans un petit cristallisoir rempli d’eau distillée où en quatre à cinq minutes il perd les cristaux de potasse adhérents à sa surface. A l'aide d’une aiguille, on le transporte ensuite sur une lame de verre, dans une goutte de glycérine. On recouvre d’une lamelle, puis on Iule à la paraffine, ou au Masken-Lake.

Cos préparations se conservent fort longtemps pourvu qu’elles soient bien lutées.

Si l’on veut examiner les préparations colorées, on fera usage des couleursde fond dont l'éosine est le type.

Le cheveu éclairci sera lavé à l’eau distillée puis immergé pendant dix à quinze minutes dans une solution aqueuse d’éosine (1 p. 100); on le montera ensuite dans une goutte de glycérine légèrement éosinée.

Les préparations colorées ne sont pas toujours supérieures aux préparations non colorées ; elles ont l’inconvénient d’exiger des manipulations plus nombreuses au cours desquelles les éléments du parasite sont souvent dissociés.

Je rappellerai que pour les reproductions photographiques ces préparations colorées sont absolument nécessaires.

3° Cultures.

A. — Choix du milieu nutritif, vases de culture, aération.

Température.

Voici quelles sont les conditions nécessaires à l’étude fructueuse dos trichophytons et du mierosporum Audouini dans leurs cultures.

lo II est indispensable de ne sc servir que de milieux nutritifs toujours identiques à cux-méines et que l’on puisse par conséquent fabriquer avec une exactitude rigoureuse dans les laboratoires.

On sait, en effet, que si un champignon revêt toujours le même aspect sur le même milieu de culture, ce même champignon variera indéfiniment d’aspect suivant les variations qualitatives et quantitatives du milieu nutritif sur lequel il sera cultivé.

2 o Sur les milieux liquides il est difficile de juger de l’aspect des diverses espèces cryptogamiques ; pour l’étude de ces espèces, il est donc indispensable d’employer les milieux solides sur lesquels on peut apprécier aisément le port des champignons.

On n’utilisera pas toutefois la gélatine que tous les champignons liquéfient plus ou moins rapidement.

3<> Les trichophytons sont aérobies et prennent en culture une grande extension, il est par suite nécessaire de ne les cultiver que sur de larges matras à fond plat (flacons d’Erlenmeyer ou matras de Gayon) dans lesquels la culture, bien aérée, se développe aisément sans rencontrer les parois du verre. Toute culture qui touche aux parois du verre est obligée, en 'effet, de se replier sur elle-même et son aspect naturel est par suite modifié.

4° L’expérience démontre que, dans les cultures, les trichophytons utilisent surtout les substances hydro-carbonées du type des sucres, ils n’utilisent par contre que fort peu de matières azotées. Les milieux nutritifs favorables à leur développement devront donc être pauvres en azote et riches en sucre.

Les milieux qui m’ont toujours donné de lions résultats et qui remplissent les conditions précédemment énoncées sont par ordre :

1° Le milieu d’épreuve de Sabouraud.

Peptones 0 gr. 50

Mallose 3 » 50

Eau 100 »

Gélose (pour solidilicr) 1 » 50

2° Le moût de bière double (eau de malt boublonnée ou bière avant le brassage), étendu de moitié son volume d’eau et solidifié avec 1,50 p. 100 d’agar.

Le moût de bière ayant une composition variable suivant sa provenance, il importe, pour la différenciation des espèces cryptogamiques, de ne se servir que du moût de bière venant de la même brasserie.

3° Les milieux dont la formule est la même que celle du milieu d’épreuve, mais dans lesquels la maltose est remplacée par d’autres subtances hydro-carbonées qui sont, par ordre : mannite, lactose, glucose (1).

4° La pomme de terre est un bon milieu sur lequel le microsporum Audouini et certains trichopliytons se différencient facilement. Ce milieu est malheureusement sujet à des variations assez grandes suivant la provenance des pommes de terre, de plus les trichophytons y meurent en trois semaines.

La température la plus favorable au développement des trichophytons est de 33°. Au-dessus de 33° les cultures souffrent ou même ne se développent pas. Au-dessous de 33°, les champignons progressent mais avec une assez grande lenteur.

B. — Méthode d’isolement du champignon

1° Isolement du parasite d’une lésion pilaire. — a) MÉTHODE SIMPLE.

— 1° Sur une lame de verre flambée et refroidie et à l’aide d’un petit scarificateur ou d’une aiguille coupante flambés, diviser en tronçons aussi petits que possible les poils dont on veut extraire le champignon.

2° Prendre un tube de verre contenant le milieu d’épreuve gélose, flamber un fil de platine et toucher à vide la surface de la gélose pour mouiller le platine, avec le fil de platine porter ensuite les tronçons des poils à la surface de la gélose, en les espaçant de 5 à 6 eentim. ; chaque tube peut ainsi recevoir 15 à 20 fragments de poils.

3° Ensemencer ainsi plusieurs tubes d’agar et les porter à l’étuve à 20°.

(1) A l’heure actuelle, je n’emploie presque plus le milieu d’épreuve de Sabouraud car la maltose ordinaire, très impure d’ailleurs, est devenue très rare dans le commerce et la maltose chimiquement pure est d’un prix extrêmement élevé. Je préfère aux milieux maltosés, les milieux mannités qui sont tout aussi favorables au développement des trichophytons. 11 est en effet- facile de se procurer de la mannite pure et à bon marché.

A cette température, le développement des bactéries est difficile tandis que les champignons croissent lentement.

Certains tronçons des poils ensemencés donneront lieu à des cultures bactériennes (staphylocoque, etc.), mais si l’on a eu soin de semer un nombre suffide tronçons, il s’en trouvera toujours quelques-uns qui donneront des colonies du champignon.

Les colonies des trichophylons et du microsporum apparaissent du cinquième au quinziéme jour, tantôt comme une fine touffe grisâtre de mycéliums immergés dans le milieu nutritif, tantôt comme une petite étoile blanche superficielle.

4° Quand une colonie trichophytique est ainsi développée, l’effleurer avec la baguette de platine flambée et ensemencer un autre tube d’agar (milieu d’épreuve).

5° Quand la culture sera bien développée sur ce nouveau tube d’agar, en reprendre une parcelle avec la baguette de platine dans le point où la culture semble bien pure et ensemencer d’autres vases de culture. On obtient ainsi rapidement une culture pure après plusieurs passages successifs.

Je crois que cette méthode simple doit être adoptée par tous les médecins qui désirent étudier les parasites cryptogamiques de l’homme. Elle ne nécessite, en effet, aucun matériel spécial et en trois semaines ou un mois elle permet d’obtenir des cultures cryptogamiques suffisantes pour la différenciation des diverses espèces.

b) Méthode de Kral. — 1° Dans une cellule de verre flambée, broyer avec une baguette de verre, également flambée, une parcelle de la matière d’ensemencement avec une poudre inerte stérilisée (par exemple de l’acide silicique pulvérisé) .

2° Déposer la poudre ainsi obtenue dans un tube de moût de bière stérile et l’agiter pour bien répartir les éléments broyés.

3° Avec ce tube de moût de bière, ensemencer cinq ou six tubes de gélatinegélose liquéfiée et répartir la semence en agitant.

4° Couler ces tubes de gélatine-gélose dans une boite de Pétri ou dans une cellule quadrillée de Jorgensen.

5° Quand la couche de gélatine-gélose est solidifiée, renverser la boîte de Pétri sous le microscope et rechercher, avec un faible grossissement, une spore isolée.

6° Marquer cette spore à l’encre sur le verre de la boite de Pétri, mettre à l’étuve et, quand la colonie sera développée au niveau de la spore marquée, la reprendre pour ensemencer des vases de culture.

La méthode de Kral, rigoureuse il est vrai, offre, dans la pratique, de telles difficultés qu’elle me parait devoir être complètement abandonnée pour des études médicales.

2° Isolement du parasite d’une lésion de la peau glabre. — a ) LÉSION

non suppurée. — 1° Racler la surface de la lésion à la curette afin d’obtenir des squames que l’on traitera comme je viens de l'indiquer pour les poils.

2° Après'raclage de la lésion, presser sur les bords de la plaque malade afin

do faire sourdre à la surface des gouttelettes de sérosité sanguinolente; prendre ces gouttelettes avec un lil de platine flambé et les étaler a la surface d'un tube d’agar (milieu d’épreuve ou moût de bière), puis mettre à l’étuve a 20". Si l’on a soin de ne pas prendre les premières gouttelettes séro-sanguinolenles qui s’écoulent, ce procédé donne le plus souvent le parasite presque a l étal de pureté.

b) LÉSION SUPPURÉE. — 1" Choisir une vésico-ptisLule non encore ouverte et distendue par le pus, l’ouvrir avec un petit scarificateur flambé.

2° Avec le fil de platine flambé toucher immédiatement la gouttelette de pus sortie de la pustule et ensemencer la surface d’un tube d’agar (milieu d’épreuve ou agar au moût de bière). Enseinenser ainsi plusieurs tubes et les porter a l’étuve à 20°. Au bout de cinq à dix jours, on verra se développer les colonies trichophytiques le plus souvent seules et sans colonies bactériennes si l’on a bien choisi la pustule pour l’ensemencement et si l’on a opéré aseptiquement.

c) Cultures en gouttes suspendues pour l’f.tude mycologique. —

Les cultures en gouttes suspendues sont indispensables pour l’étude mycologique fructueuse des champignons; elles permettent de suivre les cultures a tous les stades de leur développement et sans que les champignons soient altérés.

Voici la méthode que je suis dans la pratique de ces cultures :

1° Prendre une lamelle de verre propre, la placer entre les mors d’une pince Cornet et la flamber, puis déposer la pince sur une table la face flambée de la lamelle regardant en bas.

2° Avec une pipette stérile, dont l’extrémité est recourbée à angle droit et ([ue l’on a remplie de bouillon stérile (1), déposer, au milieu de la face flambée de lamelle, une gouttelette de bouillon.

3° Ensemencer cette gouttelette en y portant avec l’aiguille de platine flambée une minuscule parcelle d’une culture pure du champignon que l’on veut étudier.

4° Porter ensuite la lamelle, en la maintenant bien horizontale, sur une lame creuse que l’on dispose dans une chambre humide à la température ^convenable.

On peut ainsi, chaque jour, en plaçant la lame creuse sous le microscope, suivre le développement du champignon.

Ces cultures en gouttes sur lames creuses ont l’inconvénient de se dessécher très rapidement et par suite de mourir avant qu’on ait pu suivre tout le développement du champignon. Nécessitant l’emploi d’une chambre humide, elles sont de plus très encombrantes, aussi ai-je abandonné leur usage pour le procède suivant que je tenais de Sabouraud.

Au lieu de transporter la lamelle (fig. 16, L) sur une lame creuse, on la

(1) Pour les cultures en gouttes suspendues des trichophytons ou du microsporum Audouini j’emploie le bouillon dont voici la formule :

Peptones 1 gr.

Mannite 3 »

Eau 100 »

dépose sur l’extrémité d’un tube à essais (fig. 16, t) rempli d’eau jusqu’à 2 centim. de son orifice et maintenu bien vertical dans un flacon ou dans un vase à large ouverture rempli d’ouate (fig. 16, V).

Les bords de ce tube ont été préalablement enduits de vaseline. La lamelle adhérant à l'orifice du tube enduit de vaseline, la culture se développe dans une chambre humide.

Elle reste pure si l’on a opéré aseptiquement et si le tube à essais est maintenu bien vertical, car la culture demeure au centre de la lamelle, ne louchant ni à ses bords, ni aux parois du tube.

Ces cultures en gouttes seront placées à l’étuve à 20»; à une température

Fig. 16. — Disposition des cultures en gouttes suspendues pour l'étude myeologigue.

plus élevée, en effet, les vapeurs, qui se forment dans la chambre humide, soulèveraient la lamelle et feraient glisser la culture.

Lorsqucl’on veut examiner le champignon, on enlève la lamelle et l’on essuie avec soin la vaseline adhérente à ses bords, puis on dépose cette lamelle sur une goutte d’acide acétique cristallisable, sur une lame de verre et l’on examine au microscope. L’acide acétique fixe les spores et les éléments du parasite, aussi doit-on lui donner la préférence sur toute autre substance pour l’examen mycologique. Comme l’acide acétique s’évapore rapidement, la préparation ne peut être conservée, on devra donc dessiner immédiatement, à la chambre claire, les parties intéressantes de la préparation et mesurer au micromètre les différents éléments du champignon (1).

(1) On peut conserver ces préparations en laissant évaporer l’acide acétique puis

En pratiquant une série de 15 ou 20 cultures en gouttes suspendues et en sacrifiant chaque jour l’une d’elles pour l’examen microscopique, on peut suivre ainsi le développement complet des trichophytons dans leur vie de mucédinée.

4° Inoculations expérimentale*.

Je n’ai pas pratiqué les inoculations expérimentales îles trichophytons à d’autre espèce animale que le cobaye, sur cet animal elles sont d’ailleurs assez facilement positives. Voici la méthode d’inoculation qui m’a donné les meilleurs résultats :

1° Dans 1 centim. cube d’eau stérilisée ou de bouillon stérile, broyer, avec une baguette de verre flambée , une parcelle de la culture à inoculer de façon à détacher les spores et à les répartir dans le liquide.

2o Charger avec ce liquide une seringue de Roux stérilisée.

3° Épiler et raser la région à inoculer puis la nettoyer soigneusement, d’abord à l’eau chaude et au savon, puis avec un mélangea parties égales d'alcool et d’éther.

4° Introduire dans la peau l’aiguille de la seringue en lui donnant une direction oblique de façon à ce que la pointe reste dans les couches épidermodermiques, sans pénétrer dans le tissu sous-cutané. Enfoncer ainsi l’aiguille de 1 centim. à peu près.

5° Retirer l’aiguille de la seringue en pressant doucement le piston de façon à introduire le liquide dans tout le petit canal creusé par l’aiguille.

Il faut faire ainsi plusieurs inoculations distantes de 1 centim à 1 centim. et demi les unes des autres.

Sabouraud indique une autre méthode d’inoculation également bonne : elle consiste à introduire les spores de trichophyton dans une petite phlyctène produite par une brûlure superficielle ; dans la sérosité alcaline de la phlyctène le trichophyton se développe très facilement.

On peut enfin badigeonner simplement une surface scarifiée avec de l’eau stérilisée, contenant en suspension les spores de trichophyton ; ce procédé ne réussit toutefois que pour certaines espèces trichophytiques très virulentes, par exemple le trichophyton pyogène, à cultures blanches, du cheval.

en montant dans la glycérine après coloration par l’éosine ou mieux par une solution dans l’acide lactique d’un bleu que M. le Dr Delacroix m’a indiqué récemment et qui se trouve dans le commerce sous le nom de Bleu coton G. 4. B.