CHAPITRE VII
Méthodes et techniques (1).
1° RÉCOLTE ET CONSERVATION DES ÉLÉMENTS D'EXAMEN : A. — Sur une lésion pilaire.
B. — Sur une lésion non pilaire, 29 EXAMEN MICROSCOPIQUE.
A. — Examen extemporanné pour le diagnostic.
B. — Préparations stables non colorées et colorées. 3° CULTURES.
A.— Choix du milieu nutritif, vases de culture, aération. Température. B. — Méthodes d'isolement du parasite, 1° Isolement du parasite d’une lésion pilaire. a. Méthode simple.
b. Méthode de Kral.
2° Isolement du parasite d’une lésion non pilaire. a. Sur une lésion non suppurée.
b. Sur une lésion suppurée.
C.— Cultures en gouttes suspendues pour l'étude mycologique. 49 INOCULATIONS EXPÉRIMENTALES.
1° Récolte et conservation des éléments d'examen.
À. — SUR UNE LÉSION PILAIRE. — L'étude des trichophytons ne peutêtre faite sur tous les poils qui existent à la surface d'une trichophytie pilaire; on ne prendra pas indistinctement tous les poils, mais seulement ceux qui sont cassés et qui se rompent au ras de l’épiderme quand on les saisit à la pince.
Tout poil qui vient à la pince dans toute sa longueur et avec sa racine est un
. poil sain, il doit être rejeté pour l'examen microscopique ou l’ensemencement.
On se rapellera que les poils envahis par le parasite sur les trichophyties animales sont entourés d'une gaine grisâtre, visible à l'œil nu.
Les poils malades sont enlevés à l’aide d’une pince à épiler flambée et sont déposés ensuite entre deux lames de verre préalablement flambées et refroidies. On enveloppe ces lames d'une feuille de papier blanc et l’on peut ainsi trans-
(1) Ce chapitre n’est que l'indication résumée et aussi brève que possible de la technique que j'emploie depuis plus de trois années.
porter et conserver pendant plusieurs mois des échantillons virulents de poils trichophytiques.
B. — SUR UNE LÉSION DE LA PEAU GLABRE. — 10 Si la lésion est sèche et squameuse, enlever par grattage, à l'aide d'une petite curette flambée, les squames épidermiques et les conserver comme les poils.
20 Dans le cas d'une lésion suppurée, ensemencer immédiatement le pus des vésico-pustules ou étaler le contenu de ces vésico-pustules sur des lamelles de verre pour l'examen microscopique immédiat. Si l’on désire transporter ou conserver le pus, l’aspirer avec une fine pipette de verre stérilisée que l’on introduit directement dans les pustules et que l’on ferme ensuite à la lampe.
20 Examen microscopique.
Cet examen doit toujours être pratiqué avec un grossissement assez fort, 300 diamètres environ (object. 7, ocul. 3. Leïtz). Pour l'éclairage il faut une source de lumière vive, mais un diaphragme de faible ouverture, 2 à 4 millim. seulement. L'ouverture trop considérable du diaphragme expose l'observateur à ne plus distinguer les éléments très réfringents du parasite.
A. — EXAMEN EXTEMPORANÉ POUR LE DIAGNOSTIC. — On dépose les poils ou les squames à examiner sur une lame de verre dans une goutte de solution aqueuse de potasse (potasse caustique : 40 grammes, eau distillée : 60 grammes). On recouvre d’une lamelle de verre, puis on chauffe doucement à la flamme d’une lampe à alcool, ou d’un bec Bunsen, sans aller toutefois jusqu'à l'ébullition qui pourrait dissocier les éléments du parasite.
En trois à quatre secondes la préparation est suffisamment éclaircie pour l'examen microscopique. ; ;
B. — PRÉPARATIONS STABLES NON COLORÉES ET COLORÉES. — 1° On commence par éclaircir les poils ou les squames par l’un des deux procédés suivants?:
a) Dans un verre de montre placé sur une platine chauffante, chauffer doucement et sans aller à l'ébullition les éléments d'examen dans la solution aqueuse de potasse ; au bout de quinze à vingt minutes l’éclaircissement est suffisant.
b) Passer successivement les poils ou les squames dans un mélange d'alcool et d’éther à parties égales (24 heures), puis dans l'alcool absolu (12 heures), enfin dans la solution de potasse à froid (6 à 12 heures).
20 Quand le poil ou les squames sont éclaircis on peut les examiner non colorés ou colorés.
Dans le premier cas on transporte le poil, au sortir de la potasse, dans un petit cristallisoir rempli d’eau distillée où en quatre à cinq minutes il perd les cristaux de potasse adhérents à sa surface. A l’aide d’une aiguille, on le transporte ensuite sur une lame de verre, dans une goutte de glycérine. On recouvre d’une lamelle, puis on lute à la paraffine ou au Masken-Lake.
Ces préparations se conservent fort longtemps pourvu qu'elles soient bien lutées.
Si l'on veut examinér les préparations colorées, on fera usage des couleurs de fond dont l'éosine est le type. :
Le cheveu éclairci sera lavé à l’eau distillée puis immergé pendant dix à quinze minutes dans une solution aqueuse d’éosine (1 p. 100); on le montrera ensuite dans une goutte de glycérine légèrement éosinée.
Les préparations colorées ne sont pas toujours supérieures aux préparations non colorées ; elles ont l'inconvénient d’exiger des manipulations plus nombreuses au cours desquelles les éléments du parasite sont souvent dissociés.
Je rapellerai que, pour les reproductions photographiques, ces préparations colorées sont absolument nécessaires.
3° Cultures.
A. — CHOIX DU MILIEU NUTRITIF, VASES DE CULTURE, AÉRATION. TEMPÉRATURE.
Voici quelles sont les conditions nécessaires à l’étude fructueuse des trichophytons et du microsporum Audouini dans leurs cultures.
10 Il est indispensable de ne se servir que de milieux nutrilifs toujours identiques à eux-mêmes et que l’on puisse par conséquent fabriquer avec une exactitude rigoureuse dans les laboratoires.
On sait, en effet, que si un champignon revêt toujours le même aspect sur le même milieu de culture, ce même champignon variera indéfiniment d'aspect suivant les variations qualitatives et quantitatives du milieu nutritif sur lequel il est cultivé.
20 Sur les milieux liquides il est difficile de juger de l'aspect des diverses espèces cryptogamiques ; pour l’étude de ces espèces, il est donc indispensable d'employer les milieux solides sur lesquels on peut apprécier aisément le port des champignons.
On n’utilisera pas toutefois la gélatine que tous les champignons liquéfient plus ou moins rapidement.
30 Les trichophytons sont aérohbies et prennent en culture une grande extension, il est par suite nécessaire de ne les cultiver que sur de larges matras à fond plat (flacons d'Erlenmeyer ou matras de Gayon) dans lesquels la eulture, bien aérée, se développe aisément sans rencontrer les parois du verre. Toute culture qui touche aux parois du verre est obligée, en effet, de se replier sur elle-même et son aspect naturel est par suite modifié.
40 L'expérience démontre que, dans les cultures, les trichophytons utilisent surtout les substances hydro-carhonées du type des sucres, ils n’utilisent par contre que fort peu de matières azotées. Les milieux nutritifs favorables à leur développement devront donc être pauvres en azote et riches en sucre.
Les milieux qui m'ont toujours donné de bons résultats et qui remplissent les conditions précédemment énoncées sont par ordre : 1° Le milieu d'épreuve de Sabouraud.
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20 Le moût de bière double (eau de malt houblonnée ou bière avant le brassage), étendu de moitié son volume d’eau et solidifié avec 1,50 p. 100 d’agar.
Le moût de bière ayant uné composition variable suivant sa provenance, il importe, pour la différenciation des espèces cryptogamiques, de ne se servir que du moût de bière venant de la même brasserie.
3 Les milieux dont la formule est la même que celle du milieu d'épreuve, mais dans lesquels la maltose est remplacée par d’autres subtances hydro-carbonées qui sont, par ordre : mannite, lactose, glucose (1).
40 La pomme de terre est un bon milieu sur lequel le microsporum Audouini et certains trichophytons se différencient facilement. Ce milieu est malheureusement sujet à des variations assez grandes suivant la provenance des pommes de terre. De plus, les trichophytons y meurent en trois semaines.
La température la plus favorable au développement des trichophytons est de 330. Au-dessus de 33° les cultures souffrent ou même ne se développent pas. Au-dessous de 33°, les champignons progressent mais avec une assez grande lenteur.
