B. — MÉTHODE D'ISOLEMENT DU CHAMPIGNON

1° Isolement du parasite d’une lésion pilaire. — 4) MÉTHODE SIMPLE. — 1° Sur une lame de verre flambée et refroidie et à l’aide d’un petit scariticateur ou d’une aiguille coupante flambés, diviser en tronçons aussi petits que possible, les poils dont on veut extraire le champignon.

2° Prendre un tube de verre contenant le milieu d’épreuve gélosé, flamber un fil de platine et toucher à vide la surface de la gélose pour mouiller le platine, avec le fil de platine porter ensuite les tronçons des poils à la surface de la gélose, en les espaçant de 5 à 6 centim.; chaque tube peut ainsi recevoir 15 à 20 fragments de poils.

30 Ensemencer ainsi plusieurs tubes d’agar et les porter à l'étuve à 200.

(1) A l'heure actuelle, jen’emploie presque plus le milieu d’épreuve de Sabouraud car la maltose ordinaire, très impure d’ailleurs, est devenue très rare dans le commerce, et la maltose chimiquement pure est d’un prix extrêmement élevé. Je préfère aux milieux maltosés, les milieux mannités qui sont tout aussi favorables au développement des trichophytons. Il est en effet facile de se procurer de la mannite pure et à bon marché.

À cette température, le développement des bactéries est difficile, tandis que les champignons croissent lentement.

Certains tronçons des poils ensemencés donneront lieu à des cultures bactériennes (staphylocoque, etc.), mais si l’on a eu soin de semer un nombre suffide tronçons, il s’en frouvera toujours quelques-uns qui donneront des colonies du champignon,

Les colonies des trichophytons et du microsporum apparaissent du cinquième au quinzième jour, tantôt comme une fine touffe grisâtre de mycéliums immergés dans le milieu nutritif, tantôt comme une petite étoile blanche superficielle.

40 Quand une colonie trichophytique est ainsi développée, l’effleurer avec la baguette de platine flambée et ensemencer un autre tube d’agar (milieu d'épreuve). .

5° Quand la culture sera bien développée sur ce nouveau tube d’agar, en reprendre une parcelle avec la baguette de platine dans le point où la culture semble bien pure et ensemencer d’autres vases de culture. On obtient ainsi rapidement une culture pure après plusieurs passages successifs.

Je crois que cette méthode simple doit être adoptée par tous les médecins qui désirent étudier les parasites cryptogamiques de l’homme. Elle ne nécessite, en effet, aucun matériel spécial et en trois semaines ou un mois elle permet d'obtenir des cultures cryptogamiques suffisantes pour la différenciation des diverses espèces.

b) MÉTHODE DE KRAL. — 1° Dans une cellule de verre flambée, broyer avec une baguette de verre, également flambée, une parcelle de la matière d’ensemencement avec une poudre inerte stérilisée (par exemple de Pacide silicique pulvérisé).

20 Disposer la poudre ainsi obtenue dans un tube de moût de bière stérile et l’agiter pour bien répartir les éléments broyés.

3° Avec ce tube de moût de bière, ensemencer cinq ou six tubes de gélatinegélose liquéfiée et répartir la semence en agitant.

4° Couler ces tubes de gélatine-gélose dans une boîte de Pétri où dans une cellule quadrilléé de Jürgensen.

5o Quand la couche de gélatine-gélose est solidifiée, renverser la boîte de Pétri sous le microscope et rechercher, avec un faible grossissement, une spore isolée.

6° Marquer cette spore à l'encre sur le verre de la boîte de Pétri, mettre à l’étuve, et quand la colonie sera développée au niveau de la spore marquée, la reprendre pour ensemencer des vases de culture.

La méthode de Kral, rigoureuse il est vrai, offre, dans la pratique, de telles difficultés, qu’elle me parait devoir être complètement abandonnée pour des études médicales.

2 Isolement du parasite d'une lésion de la peau glabre, — &) LÉSION NON SUPPURÉE. — 1e Racler la surface de la lésion à la curette afin d'obtenir des squames que l’on traitera comme je viens de l'indiquer pour les poils.

20: Après raclage de la lésion, presser sur les bords de la plaque malade afin

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de faire sourdre à la surface des gouttelettes de sérosité sanguinolente; prendre ces gouttelettes avec un fil de platine flambée et les étaler à la surface d'un tube d'agar (milieu d'épreuves au moût de bière), puis mettre à l’étuve à 20°. Si l'on a soin de ne pas prendre les premières gouttelettes séro-sanguinolentes qui s'écoulent, ce procédé donne le plus souvent le parasite presque à l'état de pureté.

b) LÉSION SUPPURKE. — 1° Choisir une vésico-pustule non encore ouverte et distendue par le pus, l'ouvrir avec un petit scarificateur flambé.

2° Avec le fil de platine flambé toucher immédiatement la gouttelette de pus sortie de la pustule et ensemencer la surface d’un tube d'agar (milieu d'épreuve ou agar au moût de bière). Ensemenser ainsi plusieurs tubes et les porter à l'étuve à 20°. Au bout de cinq à dix jours, on verra se développer les colonies trichophytiques le plus souvent seules et sans colonies bactériennes si l'on a bien choisi la pustule pour l’ensemencement et si l'on a opéré aseptiquement.

c) CULTURES EN GOUTTES SUSPENDUES POUR L'ÉTUDE MYCOLOGIQUE. —

Les cultures en gouttes suspendues sont indispensables pour l'étude mycologique fructueuse des champignons; elles permettent de suivre les cultures à tous les stades de leur développement et sans que les champignons soient altérés.

Voici la méthode que je suis dans la pratique de ces cultures :

1° Prendre une lamelle de verre propre, la placer entre les mors d'une pince Cornet et la flamber, puis déposer la pince sur une table la face flambée de Ja lamelle regardant en bas.

20 Avec une pipette stérile, dont l'extrémité est recourbée à angle droit, et que l’on a remplie de bouillon stérile (1), déposer, au milieu de la face flambée de lamelle, une gouttelette de bouillon.

3° Ensemencer cette gouttelette en y portant avec l'aiguille de platine flambée une minuscule parcelle d’une culture pure du champignon que l’on veut étudier.

4° Porter ensuite la lamelle, en la maintenant bien horizontale, sur une lame creuse que l’on dispose dans une chambre humide à la température convenable.

On peut ainsi, chaque jour, en plaçant la lame creuse sous le microscope, suivre le développement du champignon.

Ces cultures en gouttes sur lames creuses ont l'inconvénient de se dessécher très rapidement et par suite de mourir avant qu’on ait pu suivre tout le développement du champignon. Nécessitant l'emploi d'une chambre humide, elles sont de plus très encombrantes, aussi ai-je abandonné leur usage pour le procédé suivant que je tenais de Sabouraud.

Au lieu de transporter la lamelle (fig. 16, L) sur une lame creuse, on la

(1) Pour les cultures en gouttes suspendues des trichophytons ou du microsporum, j'emploie le bouillon dont voici la formule : -

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dépose sur l’extrémité d’un tube à essai (fig. 16, é) rempli d’eau jusqu’à 2 centim. de son orifice et maintenu bien vertical dans un flacon ou dans un vase à large ouverture rempli d’ouate (fig. 16, V).

Les bords de ce tube ont été préalablement enduits de vaseline. La lamelle adhérant à l’orifice du tube enduit de vaseline, la culture se développe dans une chambre humide. |

Elle reste pure si l’on a opéré aseptiquement et si le tube à essai est maintenu bien vertical, car la culture demeure au centre de la lamelle, ne touchant ni à ses bords, ni aux parois du tube.

Ces cultures en goutte seront placées à l’étuve à 200; à une température

F1G. 16.— Disposition des cultures en gouttes suspendues pour l'étude mycologique.

plus élevée, en effet, les vapeurs, qui se forment dans la chambre humide, soulèveraient la lamelle et feraient glisser la culture.

Lorsque l’on veut examiner le champignon; on enlève la lamelle et l’on essuie avec soin la vaseline adhérente à ses bords, puis on dépose cette lamelle sur une goutte d'acide acétique cristallisable, sur une lame de verre et l’on examine au microscope. L’acide acétique fixe les spores et les éléments du parasite, aussi doit-on lui donner la préférence sur toute autre substance pour l'examen mycologique. Comme l'acide acétique s’évapore rapidement, la préparation ne peut être conservée, on devra donc dessiner immédiatement, à la chambre claire, les parties intéressantes de la préparation, et mesurer au micromètre les différents éléments du champignon (1).

(1) On peut conserver ces préparations en laissant évaporer l'acide acétique puis B. 16

En pratiquant ainsi une série de 15 ou 20 cultures en gouttes suspendues et en sacrifiant chaque jour l’une d'elles pour l'examen microscopique, on peut suivre ainsi le développement complet des trichophytons dans leur vie de mucédinée.

40 Inoculations expérimentales.

Je n'ai pas pratiqué les inoculations expérimentales des trichophytons à d'autre espèce animale que le cobaye, sur cet animal elles sont d’ailleurs assez facilement positives. Voici la méthode d’inoculation qui m'a donné les meilleurs résultats :

19 Dans 1 centim. cube d’eau stérilisée ou de bouillon stérile, broyer, avec une baguette de verre flambée , une parcelle de la culture à inoculer de façon à détacher les spores et à les répartir dans le liquide.

20 Charger avec ce liquide une seringue de Roux stérilisée.

30 Épiler et raser la région à inoculer puis la nettoyer soigneusement, d’abord à l’eau chaude et au savon, puis avec un mélange à parties égales d'alcool et d’éther.

40 Introduire dans la peau l'aiguille de la seringue en lui donnant une direction oblique de façon à ce que la pointe reste dans les couches épidermodermiques, sans pénétrer dans le tissu sous-cutané. Enfoncer ainsi l’aiguille de 1 centim. à peu près.

5° Retirer l'aiguille de la seringue en pressant doucement le piston de façon à introduire le liquide dans tout le petit canal creusé par l’aiguille.

Il faut faire ainsi plusieurs inoculations distantes de 1 centim à 1 centim. et demi les unes des autres.

Sabouraud indique une autre méthode d’inoculation également bonne ; elle consiste à introduire les spores de trichophytons dans une petite phlyetène produite par une brûlure superficielle, dans la sérosité alcaline de la phlyctène

le trichophyton se développe très facilement. = On peut badigeonner simplement une surface scarifiée avec de l’eau stérilisée, contenant en suspension les spores de trichophyton ; ce procédé ne réussit toutefois que pour certaines espèces trichophytiques très virulentes, par exemple le trichophyton, Pyogène, à cultures blanches, du cheval.

en montant dans la glycérine après coloration par l'éosine ou mieux par une solution aqueuse d’un bleu que M. le D' Delacroix m'a indiqué récemment et qui se trouve dans le commerce sous le nom de Bleu coton G. L. B.