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Les chevaux déjà antitoxiques avaient toujours été traités par de la toxine jeune provenant du barille Américain Park-Williams n° 8, bacille qui est utilisé dans tous les Instituts pour la production de la toxine diphtérique, Au moment où on a commencé de pratiquer des injections bacillaires, leurs sérums n'avaient pas d'action agglutinante marquée sur le bacille Américain,

Au fur et à mesure qu’il acquérait des propriétés agglutinantes pour le bacille qui leur avait été injecté, le sérum devint en même temps capable d’agglutiner à un taux assez élevé le bacille Américain, Cette coagglutination pouvait être supprimée par saturation du sérum avec le bacille Américain.

Indiquons que le sérum de cheval normal ou immunisé contre la toxine tétanique, le méningocoque ou le bacille dysentérique, a souvent agglutiné certains bacilles diphtériques au taux de 1/12 à 4/25, très rarement à 1/100 dans les conditions habituelles,

Le sérum de cheval immunisé par des injections de toxine diphtérique jeune, n’a jamais agglutiné à un taux plus élevé que les sérums normaux.

IT. Agglutination.

Émulsion microbienne. — Le premier temps, qui est loin de ne présenter aucune difficulté, consiste à obtenir une suspension homogène des bacilles diphtériques, qui poussent le plus souvent en grumeaux ou même en voile sur bouillon. L'agitation

fréquente, voire même continue par une machine à agiter, peut rendre assez homogènes les cultures en bouillon. Le procédé ne réussit qu'après plusieurs générations ; il est peu pratique quand on doit manipuler un grand nombre de cultures ; enfin, il n’est pas intaillible.

Le chauffage à 100°, suivant le premier procédé Martin, nous a donné de bons résultats, à côté d’autres moins bons; de plus, une série d'expériences nous a montré que ia spécificité et le taux élevé de l’agglutination étaient un peu moindres avec des bacilles chauffés qu'avec des bacilles vivants.

Nous avons encore obtenu des résultats variables avec des cultures de 24 heures sur gélose pomme de terre de Dopter. La culture est souvent très abondante. Après raclage et émulsion en eau salée à 9 °/,,, la suspension est très souvent stable.

Les deux procédés auxquels nous avons eu le plus souvent recours sont les suivants :

Partant de cultures en bouillon, de 24 heures de préférence, on les centrifuge et le culot est soigneusement émulsionné dans une très faible quantité d’eau salée, en roulant un fil de platine contre les parois du tube qui contient les microbes. On ajoute ensuite quelques centimètres cubes d’eau salée, de façon à obtenir une émulsion contenant environ 1! à 3 centigrammes de bacilles par centimètre cube (quantité appréciée d'abord par comparaison avec un étalon, puis à l'œil). Le tube est alors placé une nuit à la glacière, en position verticale. Le lenilemain, on décante le liquide homogène qui surnage

le dépôt et on le dilue avec de l’eau salée de façon à obtenir une émulsion de 1 à 2 milligrammes par cc.

On peut encore partir d'une culture de 24 heures sur boîte de Pétri de sérum fraichement coagulé à 80°-90°. La culture raclée est émulsionnée dans une petite quantité d’eau salée par aspirations et rejets successifs à travers l'effilure fine d’une pipette Pasteur. La suspension, amenée à 1,2 ou 3 cgr. par centimètre cube, est mise à sédimenter à la glacière et traitée comme précédemment.

Malgré la technique indiquée, il arrive assez souvent qu'un microbe se sédimente complètement en quelques heures, laissant au-dessus du dépôt le sérum physiologique complètement clair. Ce peut être là un accident passager, dû quelquefois à une insuffisance de broyage de la culture contre les parois du tube. Parfois aussi, un échantillon se refuse à tout coup à fournir une émulsion stable.

Dilution des sérums. — L'émulsion stable une fois obtenue et amenée à 1 ou 2 mgr. par cc., est mélangée à la dose de 0 cc. 5 avec même volume d'une dilution de sérum. Comme l'agglutination par les sérums de chevaux normaux ne dépasse jamais 1/200, on se contente parfois de mélanger 0 ce. 5 de microbes avec 0 cc. 5 de sérum dilué à 1/200, ce qui donne le taux de 1/400.

D'autres fois, on pousse l’agglutination plus loin, en général aux taux de 1/400, 1/800, 1/1600, 173200, 1/6400. Ces taux successifs sont facilement obtenus de la facon suivante : On dispose 6 tubes à agglutination sur un porte-tube et l’on verse dans chacun

d'eux, sauf le premier, 0 cc. 5 d’eau salée. Ayant préparé une dilution à 1/200 du sérum à essayer, on en met 0 cc. 5 dans le premier tube, vide, et 0 cc. 5 dans le second tube contenant déjà O0 cc. 5 d’eau salée, ce qui donne, après agitation, 1 ec. de sérum: à 1/400. On reprend 0 ce. 5 dans ce tube, que l’on porte dans le troisième, ce qui donne 1 cc. de sérum à 1/800 et l’on continue ainsi jusqu’au sixième tube compris. Quand on a obtenu dans ce dernier 1! ec. de sérum à 1/3200, on en rejette la moitié. On distribue alors uniformément 0 cc. à de microbes dans tous les tubes, ce qui, après agitation, donne les taux 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, 1/6400. Dans le sixième tube, l’'émulsion bacillaire diluée par du sérum physiologique servira de témoin. On peut d’ailleurs y remplacer le sérum physiologique par 0 cc. 5 de dilution à 1/50 de sérum de cheval normal. La même technique est naturellement suivie avec des taux plus bas pour les sérums de lapins.

Séjour à l’étuve et lecture des résultats. — L'ag-

glutination du bacille diphtérique est relativement lente. Elle ne se fait que très incomplètement à la températureordinaire au bout de vingt-quatre heures, et est rendue difficile à apprécier dans ces conditions lorsque la sédimentation spontanée du bacille est quelque peu marquée.

Elle se fait mieux à la température de 37°. Elle débute alors vers la troisième heure, devient complète de la cinquième à la septième heure, le liquide s'étant complètement éclairci ou laissant nager de gros grumeaux. Il est bon, dans ces conditions, de

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lire les résultats après huit heures, alors qu'aucune sédimentation n’a eu le temps de s’effectuer.

Le mieux, toutefois, est d'opérer entre 45° et 55°. La température de 45 à 48° est très facilement obtenue en se servant de porte-tubes en bois dont la base, épaisse de 12 à 15"*., est placée sur le fond en cuivre d'une étuve à gaz de Roux, grand modèle. L’agglutination est plus rapide, encore plus nette, et appréciable au premier coup d'œil après six heures.

L’agglutination est dite positive et marquée + quand les grumeaux très gros ont une tendance évidente à se rassembler pour laisser le liquide clair ou même se sont complètement ramassés au fond du tube. Elle est dite incomplète et marquée + quand les grumeaux sont plus petits, quoique très nets à l'œil nu, et ne paraissent gagner que très lentement ou pas du tout le fonds du tube.

Parfois, avec les sérums d'animaux insuffisamment immunisés, l’agolutination est incomplète dans trois ou quatre tubes successifs, et ne se délimite pas, même par un séjour plus prolongé à l’étuve. De tels sérums sont inutilisables et l’immunisation des animaux doit être poursuivie.

Une agglutination incomplète dans plusieurs tubes peutse produire encore avec le sérum de chevaux injectés à la fois avec la toxine du bacille Park n° 8 (dit Américain ou Am.) et avec un bacille d’un autre groupe que ce dernier, lorsqu'on met en présence du sérum un bacille du groupe du B. Américain.

Cette coagglutination incomplète disparaît par saturation de ces sérums avec le B. Am.

Dans tous les autres cas, la limite supérieure de l’agglutination est très tranchée, un tube négatif faisant suite à un tube positif, ou n'en étant séparé que par un seul tube où le phénomène est incomplet.

A signaler qu’il peut ÿ avoir une limite inférieure à l’agglutination, surtout si l’on a essayé des concentrations relativement fortes de sérums. Ainsi, un microbe complètement agglutiné à 1/6400, 1/3200, 41/1600, 1/800, 1/400 ne le sera qu'incomplètement à 1/200 et pas du tout à 1/100. Nous n’avons jamais vu se produire ce phénomène, rare d’ailleurs, qu'avec des microbes agglutinables à un taux très élevé, et cette limite inférieure à rarement atteint 1/400.

Certains microbes sont nettement agglutinables par un sérum, mais à un taux peu élevé, 1/400 ou 1/800, alors que ce sérum agglutine d’autres souches à 1/6400. Parfois, ils restent peu agglutinables, quelques-uns le deviennent après un certain temps de séjour au laboratoire sur milieux artificiels. Nous avons cherché si une série de repiquages pouvait augmenter l’agglutinabilité d’un microbe peu agglutinable par un sérum donné. Trois échantillons que la saturation des agglutinines nous avait montrés appartenir au type V et qui étaient respectivement agglutinés à 1/600, 1/400, 1/200, par un sérum homologue, furent repiqués quotidiennement pendant un mois. [ls ne se montrèrent pas plus agglutinables au trentième qu'au premier de ces repiquages.

Inversement, des souches plus nombreuses, puisque nous en avons rencontré une dizaine, peuvent perdre avec le temps une agglutinabilité qu elles

avaient nettement manifestée. Ainsi le microbe Bat... est agglutiné au moins à 1/3200 le 26 janvier. Il ne l’est plus qu'à 1/1600 en mai de la même année et même pas à 1/400 un mois plus tard. Cette perte de l’agglutinabilité, sans perte du pouvoir de fixer les agglutinines, a été rencontrée dans un certain nombre de bacilles, appartenant au même type et isolés à peu près à la même époque.