CHAPITRE II

MALARIA : EXAMEN MICROSCOPIQUE DU SANG

Avant de commencer l'étude du sang paludique, il est bon que le débutant se familiarise avec l'aspect microscopique du sang normal, à la fois dans les préparations fraîches et colorées. 11 devra apprendre à reconnaître les diverses variétés de leucocytes ; à apprécier les différences de couleur, de dimension et de forme des hématies ; à distinguer les taches, les vacuoles, les formes dentelées et tous les aspects produits artificiellement. La possession de ces détails, dès le début, évitera bien des sources d'erreur et procurera l'expérience nécessaire pour tout ce qui concerne cette étude (1).

Pour bien comprendre les principes d'après lesquels on fait des examens de sang pour la recherche et l'étude de l'hématozoaire, il est nécessaire d'avoir présent à l'esprit que le parasite est intraglobulaire. Pour le voir à l'aide du microscope, il est donc nécessaire, surtout pour le débutant, de s'arranger de façon qu'une partie des globules, dans la préparation, reposent à plat sur la lame, en une seule couche, et présentent à l'observateur leur surface et non leurs bords (fig. 15). C'est en grande partie par ignorance de ce principe fondamental que tant d'observateurs ne réussissent pas à trouver l'hématozoaire.

Préparation de sang liquide. — Pour arriver à disposer ainsi les globules dans les préparations de sang frais, nous recommandons le procédé suivant qui doit être observé scrupuleusement dans tous ses détails.

Nettoyez complètement à l'alcool trois ou quatre lamelles minces et , autant de lames; recouvrez-les immédiatement à l'aide d'un récipient convenable de manière à les mettre à l'abri de la moindre poussière en suspension dans l'air. Nettoyez à l'alcool l'extrémité d'un doigt du malade et

(1) L'auteur indique au lecteur anglais les ouvrages de Coles, Cabot et da Costa pour se perfectionner dans la technique hématologique.

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essuyez-la. Piquez la pulpe du doigt avec une aiguille propre et enlevez en l'essuyant la première goutte qui s'écoule. Alors doucement, avec l'index et le pouce, pressez la pulpe du doigt et faites sourdre une seconde gouttelette de sang ; celle-ci doit être très petite, pas plus grosse qu'une tête d'épingle. Touchez légèrement la gouttelette avec le centre d'une lamelle, en ayant 5oin que celle-ci ne vienne pas au contact de la peau, et renversez

rig. 15. — Micro-photographie montrant la disposition nécessaire des globules rouges pour la recherche de l'hématozoaire. A droite du globule blanc, dans le centre de la préparation, on aperçoit un globule rouge aux trois quarts rempli par un hématozoaire de fièvre tierce. (D'après une micro-^ ihclogrnphie du D'' Cosens.)

immédiatement la lamelle sur une lame. W'exercez aucune pression pour étaler le sang. Si les verres et le doigt sont tout à fait propres, le sang s'étendra aussitôt de lui-raiême en une mince couche. Il est quelquefois plus <;ommode de prendre du sang au lobe de l'oreille, ou, chez les enfants, au gros orteil.

Il faut faire plusieurs préparations ; on obtiendra chaque fois du sang en exerçant à nouveau une faible pression sur l'extrémité du doigt.

Après avoir attendu quelques minutes, pour permettre au sang de se répandre complètement entre la lame et la lamelle, il est bon de luter la préparation avec de la vaseline. On arrêtera ainsi tout mouvement, toute évaporation du sang et, par suite, les globules ne seront pas trop comprimés et l'examen sera grandement facilité.

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En- préparant les lames, ayez soin de stériliser l'aiguille que vous emploierez, pour éviter de graves accidents. Il n'est évidemment pas nécessaire de stériliser les lames et lamelles employées.

Caractères d'une préparation réussie. — En exposant à la lumière une préparation réussie, une ou plusieurs régions, composées chacune de trois zones (chacune de ces zones empiétant sur la voisine) peuvent être aperçues à l'œil nu. Chaque région renferme une zone périphérique d'une teinte rougeâtre, une zone moyenne ayant un aspect irisé et une zone centrale absolument incolore. On reconnaîtra qu'une préparation est réussie à la présence de ces zones. On doit rejeter les préparations qui ne présenteraient pas cet aspect; on perdrait son temps à les examiner.

En examinant au microscope des préparations réussies, on verra que la zone ou région centrale contient peu ou point de globules rouges. On peut la désigner sous le nom de « zone vide ». En partant de cette zone vers l'extérieur, on rencontrera d'abord une région occupée par des globules disséminés, isolés, comprimés et très étendus, « zone des globules disséminés » . Plus loin, les globules deviennent plus nombreux et moins exprimés (fig. 15). En poursuivant l'examen de la lame, on voit que les globules, graduellement, se rapprochent les uns des autres jusqu'à ce que, finalement, ils en arrivent à se toucher par leur périphérie, « zone en couche unique ». Plus loin, bien que les globules soient encore à plat, on les voit s'entasser ou empiéter les uns sur les autres, « zone des globules entassés ». Au delà, les globules sont empilés en rouleaux, « zone des rouleaux ». A l'extrême limite de la préparation, les globules tendent à éclater et à s'accoler entre ' eux de manière à former une bande étroite d'hémoglobine libre, les globules individuels ne pouvant parfois être distingués, « zone de l'hémoglobine libre ». On devra étudier chacune de ces zones, car chacune apporte son enseignement particulier dans l'étude de l'hématozoaire.

Examen microscopique. — Le débutant épargnera son temps s'il peut prendre une ou deux leçons auprès de quelqu'un de familier avec la technique spéciale et avec les formes du parasite dans le sang. La pratique apprend seule à faire vite et bien. C'est

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une bonne chose que de s'exercer -d'abord à faire des préparations avec son propre sang.

On emploiera avec succès pour l'examen un objectif 1/12 à immersion homogène, un oculaire plutôt faible, un condensateur Abbé et un éclairage modéré. Il n'est pratiquement d'aucune utilité de se servir d'un objectif plus faible ou de ne pas employer de condensateur.

On n'a pas toujours le choix du malade, mais, si c'est possible, on prendra de préférence pour les premiers examens un cas de fièvre quarte, ou, à défaut, une fièvre tierce bénigne bien définie. Si l'on ne peut avoir aucun de ces deux cas, on s'adressera avec fruit à un cas ancien de malaria récurrente avec cachexie marquée. Il vaut mieux examiner le sang du malade un peu avant ou pendant la période de frisson. Dans les fièvres quartes et dans les tierces bénignes, on aura, au moment indiqué, peu de difficulté à découvrir de grands hématozoaires ; l'attention, en pareil cas, est attirée sur les parasites relativement volumineux par l'abondance du pigment à gros grains qui y est contenu. Dans le sang des paludéens cache ctiques qui ont des rechutes d'accès fébriles, il est généralement facile de trouver des croissants et des sphères dérivées des croissants, car cette forme du parasite atteint des dimensions considérables, contient beaucoup de pigment et possède une forme frappante et bien définie.

Quand le débutant aura appris à reconnaître une des formes du parasite, il commencera à apprécier quelle sorte de corps il a à rechercher ; ensuite il pourra compléter lui-même son instruction, et découvrir les petites formes et les intermédiaires.

En procédant à un premier examen de sang hquide, le débutant, tout d'abord, portera son attention sur la « zone en couche unique ». Il passera en revue, champ par champ, toute cette zone, examinant très soigneusement l'intérieur de chaque globule rouge, chaque leucocyte et chaque corps pigmenté, même non inclus dans un globule. Il ne doit pas s'attendre à trouver des parasites dans chaque globule, ni même dans chaque champ microscopique ; il ne doit pas surtout s'attendre, comme cela arrive d'habitude aux commençants, à rencontrer sur chaque lame ces formes de segmentation d'une belle régularité ou « corps en rosace » ni les étranges corps à flagelles qui nous ont été rendus famihers par de nombreux dessins. De pareils corps, bien que

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chez chaque malade on en trouve à un moment ou à un autre, sont ceux que l'on rencontre le moins communément parmi toutes les formes de l'hématozoaire ; on les rencontre seulement dans des conditions bien définies, mais non pas d'une manière constante, et un examen clinique ordinaire ne les met pas souvent en évidence.

Dans la plupart des cas, on trouve le parasite dans le premier ou le second champ examiné ; mais parfois on est obligé de passer en revue une douzaine de champs avant de rencontrer un seul hématozoaire. Néanmoins, on ne peut pas affirmer qu'un examen est négatif avant d'avoir au moins passé une demi-heure sur plusieurs lames convenablement préparées.

Les parasites intraglobulaires que l'on rencontre le plus fréquemment se présentent soit sous forme de petites taches de protoplasma pâle, soit sous forme de masses plus volumineuses de protoplasma également pâle, contenant des grains de pigment noir. Un examen minutieux montre que les premières taches sont animées de mouvements amiboïdes actifs et qu'elles changent continuellement de forme et de position dans les globules infectés. Comme ces mouvements sont une preuve importante de la nature parasitaire des corps examinés, il faut les rechercher attentivement. Ces taches de protoplasma ont l'aspect de petits barbouillages de peinture blanche sale qui aurait déteint ; à demi cachées par l'hémoglobine, elles sont parfois difficiles à voir. Leur nature parasitaire est facilement déterm.inée par leurs mouvements, par leur contour imprécis et mal défini, et par ce fait que, d'abord par intermittences, ensuite d'une manière permanente, elles se présentent comme de petits anneaux blancs très distinctement visibles dans l'hémoglobine du globule. Ces caractères permettent de les distinguer facilement des vacuoles non parasitaires, à contour bien défini, claires, sans mouvements (fig. 16). Les autres formes communes — parasites pigmentés intra-globulaires , petits ou grands — occupent des aires variables depuis la sixième partie jusqu'à presque toute la surface des globules infectés. On les reconnaît à leur protoplasma pâle, aux particules noires d^hémozoïne qui y sont éparpillées ou qui, vers la période de frisson, sont concentrées à leur intérieur, et à leurs mouvements amiboïdes plus ou moins actifs. Dans les fièvres quartes et tierces, mais surtout dans les premières, on voit parfois des formes de segmentation en rosace.

Mansom. — Maladies des pays chauds. 3

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Recherche des corps flagellés dans le sang. — Lorsque l'étudiant se sera familiarisé avec ces formes et se sera bien persuadé de ce fait que les formes de segmentation ne se rencontrent habituellement qu'au stade de frisson et immédiatement avant ou après ce stade, il essayera de suivre le premier stade extra-corporel, stade sexué ou stade du moustique. Autant que les préparations ordinaires le permettent, cette phase est le plus facilement étudiée dans la « zone des globules entassés » et dans la « zone des rouleaux », parce que, dans ces zones, le parasite, ne subissant aucune compression, a plus de liberté pour subir sa transformation évolutive en corps à flagelles.

Dans les fièvres tierces et quartes ordinaires on rencontre rarement les corps à flagelles. Dans de pareils cas, le meilleur moment pour les observer serait celui de la période de chaleur de l'accès fébrile. Dans les cas d'infection à croissants, on rencontre beaucoup plus fréquemment les corps à flagelles, car dans cette forme de malaria ils sont plus nombreux, apparaissent à n'importe quel moment du cycle clinique et restent parfois dans la circulation plusieurs semaines après que la fièvre a disparu.

Dans la plupart des cas d'infection à croissants, l'évolution graduelle des corps à flagelles provenant des corps en croissant par l'intermédiaire du corps ovale et de la sphère peut, avec quelque patience, être facilement suivie.

Valeur diagnostique de la « zone de Vhémoglohine libre ». — La valeur de cette zone consiste en ce qu'elle permet au praticien de se prononcer rapidement sur la présence ou l'absence de parasites pigmentés dans le sang. Et cela grâce à la quantité relativement grande de sang dans chaque champ de cette zone, et, par suite, grâce au nombre proportionnellement considérable de parasites dans un de ces champs, et aussi grâce à ce fait que l'hémozoïne est très distinctement visible sur le fond homogène de l'hémoglobine libre.

Phagocytose et leucocytes pigmentés. — On voit souvent des exemples frappants de phagocytose dans le sang paludéen. Aussitôt qu'un parasite de la malaria, soit spontanément, soit par suite de compression, s'échappe du globule rouge dans lequel il s'était développé, il est très facilement attaqué par les phagocytes. Cela s'observe surtout avec les corps à flagelles, qui

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paraissent avoir un pouvoir considérable d'attraction sur les phagocytes, lesquels souvent font de longs trajets pour venir les attaquer.

Les leucocytes pigmentés — c'est-à-dire les leucocytes contenant des grains ou des blocs d'hémozoïne — se rencontrent très souvent ; on peut surtout les voir dans la « zone en couche unique » pendant ou peu après la fièvre. On pourra quelquefois observer des leucocytes en train d'absorber le pigment des corps segmentes qui viennent d'éclater. Souvent leur hémozoïne provient des restes de quelque sphère ou de quelque corps flagellé qu'ils ont absorbé postérieurement à la préparation de la lame. Dans le sang périphérique, on voit rarement, peut-être jamais, les phagocytes attaquer l'hématozoaire tant que le parasite est à l'intérieur d'un globule rouge

Les leucocytes mononucléés et (très rarement) les polynucléés peuvent renfermer du pigment malarique. Il faut prendre bien garde, cependant, lorsqu'on constate du pigment noir dans l'intérieur des leucocytes, d'en tirer de suite une conclusion : si les lames ne sont pas parfaitement propres, des fragments de poussières, que les leucocytes absorbent rapidement, peuvent induire en erreur.

Lymphocytes pigmentés. — D'après Metchnikofï, le lymphocyte n'a aucune action phagocytaire dans la malaria. Cette observation est exacte, à mon avis. Plusieurs écrivains, néanmoins, ont décrit et montré par des figures des lymphocytes contenant ce qu'ils considèrent comme du pigment malarique. Ceci, j'en ai la conviction, est fondé sur une erreur d'interprétation, et provient de l'ignorance de ce fait que, dans tous les sangs, tant normaux que paludéens,. 20 à 50 p. 100 des petits lymphocytes mononucléés contiennent, placés sur l'étroite bande de cytoplasma, un ou deux petits points ronds, d'un noir intense, optiquement indiiïérenciables de l'hémozoïne malarique. Je ne sais pas si cet aspect a été déjà décrit, mais des observations multipUées m'ont convaincu de l'exactitude de mes constatations. Par suite, la présence dans les lymphocytes d'un point paraissant être du pigment noir intense ne doit pas être considérée comme une preuve do l'infection malarienne.

Diagnostic des vacuoles. — Le débutant peut avoir quelque difficulté à déterminer si certaines figures aperçues dans les

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globules sont des parasites ou des vacuoles. Les données suivantes peuvent lui permettre de conclure avec précision. Les vacuoles (fig. 16, a, b, c, d, e, f, h, i, j, k, l) sont claires et ont des bords très nets et bien définis ; elles peuvent changer légèrement de forme, mais ne présentent pas de mouvements amiboïdes vrais, ne contiennent pas de pigment et naturellement ne se colorent pas. Les parasites intraglobulaires, au contraire, sont ternes et, en règle générale, mal définis ; ils ont des bords effacés, mal précisés ; ils présentent des mouvements amiboïdes ; lorsqu'ils sont volumineux, ils contiennent des grains de pigment ; et

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Fig. 16. — Globules rouges crénelés et vacuolés. {D'après Laveran et Blanchard.)

a, b, c, hématies avec vacuole centrale, c est crénelé ; d, e, f, h, hématies avec vacuole centrale contenant de l'hémoglobine fragmentée (quelquefois on rencontre de petites vacuoles ovoïdes avec une tache d'hémoglobine au centre ; on peut les confondre avec des hématozoaires) ; g, hématies crénelées avec plusieurs vacuoles (qui sont parfois des boursouflures non au point) ; t, /, k, l, globules déformés avec lacunes centrales.

naturellement ils prennent les colorants appropriés. Il est à peine nécessaire de noter les points de différenciation entre les leucocytes et les globules rouges concaves, plissés ou crénelés (fig. 16, c, f, g, i, j, l).

Hématozoaires détruits et fragmentés. — Des parasites libres en voie de destruction, parfois fragmentés (fig. 17), sont souvent une source de confusion pour le débutant. On se méprend fréquemment sur leur nature ; on les nomme parfois, par erreur, « corps stériles », expression qui n été souvent appliquée aux sphères dérivées des croissants (gamétocytes). En fait, ce sont des parasites libérés mécaniquement, chassés des globules rouges par la compression à laquelle le sang a été soumis entre la lame et la lamelle. Plus longtemps le sang reste sur la lame — surtout si l'on n'a pas pris la précaution d'empêcher l'évaporation en lutant à la vaseline — plus la lamelle se rapproche de la lame, plus grande sera la compression exercée sur les globules rouges et les parasites,

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et, par suite, plus ces organismes délicats s'amincissent et s'étendent, et plus facilement ils pourront être endommagés. Fréquemment ces parasites artificiellement libérés se rompent en petits fragments. Le parasite entier, aussi bien que les fragments, devenant libres dans le sang, ne tardent pas à prendre une forme sphérique ou discoïde ; en même temps le protoplasma qui les constitue semble devenir diffluent et l'hémozoïne se décompose en un certain nombre de particules pareilles à des grains de poussière, animées de mouvements browniens très actifs. Quelques-uns de ces corps sphériques discoïdes, avec des particules de pigment en mouvement, sont en réalité des sphères dérivées- de croissants ou d'autres formes de gamètes. Ce sont des parasites qui ont quitté les globules de façon normale, mais qui ont été arrêtés dans leur évolution par suite des conditions anormales dans lesquelles

P5g, 17. — Hématozoaires vacuolés en voie de dégénérescence.

ils étaient placés in vitro. D'autres sont les restes de corps à flagelles dont les filaments (microgamètes) ont été expulsés.

L'hématozoaire comme moyen de diagnostic. — Tous ces aspects polymorphes, l'observateur aura à les reconnaître et à les interpréter. Dans cette étude, l'habileté est une affaire de temps, de pratique et de réflexion. Ceci fait, l'étudiant sera non seulement capable de diagnostiquer microscopiquement l'infection malarique, mais il pourra encore reconnaître le type de n'importe quelle infection, la périodicité du cycle fébrile, et peut-être même la gravité probable d'un cas donné. Pour le diagnostic de la malaria, l'habileté dans l'examen microscopique du sang paludique est donc de première importance, et le praticien, dans les contrées impaludées, ne doit épargner aucune peine pour l'acquérir. Dans les cas de paludisme aigu et non traité, on peut trouver pratiquement l'hématozoaire chez tous les malades. Ainsi Thayer et Hewetson — excepté dans deux ou trois cas où le sang du malade fut seulement examiné pendant la convalescence —

MALAlilA.

sur 616 cas trouvèrent toujours le parasite. Les meilleurs auteurs sont également affirmatifs à. ce sujet. Personnellement, je puis assurer que, depuis que je me suis familiarisé avec cette étude, je n'ai jamais manqué de trouver le parasite dans tous les cas de paludisme aigu non traités que j'ai pu examiner au moment favorable. Dans tous les cas de maladie aiguë, attribués au paludisme, où je n'ai pas rencontré l'hématozoaire, il a été établi par la suite que la maladie était d'une tout autre nature.

Influence de la quinine sur le diagnostic microscopique. — On ne cherche pas d'ordinaire dans le sang les formes intra-corporelles après que de fortes doses de quinine ont été absorbées ; le médicament fait rapidement disparaître cette phase du parasite. Mais la quinine n'a aucune influence sur le croissant, et on trouve facilement cette forme dans les cas favorables, même lorsque le malade est depuis plusieurs jours sous l'influence du médicament.

Méthodes de coloration du sang. — D'une manière générale, le débutant ne devra travailler que sur des préparations non colorées de sang frais. Pour qui n'en a pas l'habitude, la coloration est pleine d'écueils. Dans de pareilles conditions, on ne doit pas compter sur cette méthode pour établir un diagnostic. Pratiquée par un bactériologiste expérimenté pour l'étude de la morphologie de l'hématozoaire, la coloration a pourtant une valeur réelle ; bien plus, il faut l'employer quand on veut avoir des préparations permanentes, ou qu'il n'est pas commode d'examiner le sang immédiatement. Je décrirai ici une ou deux méthodes seulement parmi toutes celles que l'on a employées.

Préparation de la lame. — D'ordinaire on étend le sang sur des lamelles; pour plusieurs raisons, je préfère l'étendre sur des lames. Il y a plusieurs manières de préparer les lames ; je puis recommander la suivante :

La méthode probablement la plus simple, et en même temps la plus rapide, est une modification de celle que proposent Christophers et Stephens. Piquez la pulpe du doigt ou le lobe de l'oreille préalablement nettoyés, et exprimez une gouttelette de sang. Recueillez-la légèrement sur une lame de verre bien propre à environ 2 centimètres de l'une des extrémités de la lame. Posez en travers de la lame et dans la goutte de sang la tige d'une aiguille — une aiguille à coudre ordinaire, assez longue (fig. 18)