IV. — Globules rouges

23. Lavage des globules rouges. — Du sang défibriné pris à l'abattoir (ou le sang provenant du dosage de la fibrine, voir n" 49) est mélangé avec une grande quantité d'une solution saline diluée, n'attaquant pas les globules (solution NaCl à 1 p. 100, — la solution saturée de NaCl contient environ 33 p. 400 de sel), et abandonné au repos dans une capsule. Après dépôt des globules, on recueille ceux-ci en décantant le liquide surnageant. On peut répéter le lavage une ou deux fois.

24. Dissolution des globules rouges dans l'eau. — Dans chacun des deux tubes à réaction A et B, placez 5 centimètres cubes de sang défibriné, ou un peu de bouillie de globules. Achevez de remplir A avec de l'eau distillée, et B, avec une solution diluée de chlorure de sodium (à 4 p. 400 par exemple). Le liquide du tube A devient transparent comme une laque, par suite de la dissolution des globules; le mélange reste opaque dans le tube B, les globules ne s'y dissolvant pas.

Pour faire une solution d'oxyhémoglobine, il suffit donc de dissoudre le dépôt des globules obtenu au fond de la capsule, dans l'opération n° 23.

25. Spectre de l'oxyhémoglobine. — Diluez la solution d'oxyhémoglobine, de manière qu'elle présente une coloration rouge cerise. Versez-en dans un tube à réaction juqu'à mihauteur, et achevez de remplir avec de l'eau distillée, en évitant de trop mélanger les deux liquides. La partie supérieure doit tout au plus avoir la couleur rose, fleur de pêcher. Examinez les différentes régions du tube au moyen d'un spectroscope à vision directe ; observez dans la partie supérieure les deux bandes de l'oxyhémoglobine (III, fig. 74) ; dans la partie moyenne (II, fig. 74) vous n'apercevez que du rouge Qt du vert, et dans le bas du tube, du rouge seul (I, fig. 74).

Refaites dans trois tubes, trois solutions de concentration croissante, et correspondant chacune à une des apparences spectroscopiques I, II, III.

LE SANG ET LES MATIÈRES ALBUMINOIDES

Coloi-iez d'après nature à l'aquaruile, ou au crayou de couleur, les spectres de la ligure 74.

La position de la raie D est facile à déterminer dans le spec-

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Oxyhémoglobine .

Hémoglobine.

V'ig. 74. — Spectres d'absorption des matières colorantes du sang.

T, Oxyhémoglobine en solution concentrée. — II, Oxyhémoglobine en solution diluée. — lU, Oxyhémoglobine en solution très diluée. — IV, Hémoglobine eu solution concentrée. — V, Hémoglobine en solution diluée. — VI, Hémoglobine eu solution très diluée. (D'après Fredericq et Nuel, Physiologie.)

tre. Il suffit d'introduire dans la flamme éclairant le spectroscope, un fil de platine recourbé en anse, et que l'on vient de plonger dans du chlorure de sodium en poudre : apparition de la raie D du sodium.

26. Spectre de l'hémoglobine réduite. — Ajoutez au tube qui a servi à la première expérience du n" 25, 3 gouttes de sulfure d'ammonium; mélangez, versez une partie du liquide, et remplacez-la avec précaution par une petite colonne d'eau distillée, dans le haut du tube ; attendez quelques minutes. Faites les mêmes observations que tantôt (n° 25), au moyen du spectroscope à vision directe. Dans le haut du tube : bande unique de l'hémoglobine réduite (VI, fig. 75) ; dans le bas, vous n'apercevez que la région rouge du spectre, et peut-être un peu de vert (IV, fig. 75).

Agitez vivement le liquide avec de l'air, pour faire réapparaître les bandes de l'hémoglobine oxygénée, et diluez s'il y a lieu.

Frederico- — Manip. de physiol. 7

27. Spectre de l'hémoglobine oxycarbonée. — Faites barboter du gaz d'éclairage pendant une heure, à travers du sang ou une solution d'hémoglobine (dans un flacon laveur), et examinez au spectroscope la solution diluée, présentant la

aBC

Yig. 75. — Absorption spectrale de l'oxyliéiuoglobine (à gauche), et de l'héuioglobine (à droite) à différents degrés de concentratioii. (D'après Beaunis, Physiologie.)

teinte fleur de pécher : bandes d'absorption analogues à celle de l'oxyhémoglobine fleur de pêcher. Notez que la bande la plus étroite ne touche pas D, mais laisse visible la région jaune du spectre, tandis que, pour l'oxyhémoglobine, cette région jaune est recouverte par la bande d'absorption la plus étroite.

28. Comparaison de deux spectres superposés. — Faites la comparaison directe des deux spectres : A. oxyhémoglobine et B. Jiémoglobine oxycarbonée^ au moyen d'un petit spectroscope à deux prismes, qui superpose les deux spectres. Notez que la bande d'absorption la plus étroite et la plus voisine de D s'éloigne davantage du rouge, dans la direction du vert, pour l'hémoglobine oxycarbonée B, que pour l'oxyhémoglobine A. Il y a par conséquent plus de jaune visible dans le spectre de l'hémoglobine oxycarbonée. Ces bandes des deux spectres ne sont pas sur le prolongement vertical l'une de l'autre.

Ajoutez quelques gouttes de sulfure d'ammonium aux deux tubes A et B : la réduction s'opère dans le tube A (bande uni-

LE SANG ET LES MATIÈUES ALBUMINOIDES.

que de l'hémoglobine réduite), tandis que le tube B continue à montrer les deux bandes de l'hémoglobine oxycarbonée.

29. Carmin et picrocarmin. — Examinez pareillement au speclroscope une solution ammoniacale de carmin (ou de picrocarmin), en la comparant à une solution d'oxyhémoglobine, et en faisant agir un corps réducteur : les deux bandes d'absorption persistent.

30. L'oxyhémoglobine se réduit par la conservation en vase clos, mais ne se détruit pas par la putréfaction, à l'abri de l'air. — Introduisez avec précaution dans un tube («, fig. 76) au moyen d'un entonnoir très effilé (c, fig. 76), un peu de solution d'oxyhémoglobine modérément diluée; scellez-le à la lampe (6, fig. 76V Au bout de quelques jours, observez le changement de teinte, et la bande unique d'absorption correspondant à la réduction spontanée de l'hémoglobine.

Refaites la même expérience avec la solution oxycarbonée. Cette solution conserve sa belle teinte rouge, et son spectre caractéristique, malgré sa conservation à l'abri de l'air. Etiquetez les tubes, et mettez-les de côté.

Toutes les expériences de spectroscopie sont répétées au moyen d'un grand spectroscope, installé à demeure dans la chambre obscure, et devant lequel on place successivement les solutions d'hémoglobine, d'oxyhémoglobine et d'hémoglobine oxycarbonée, à différents degrés de concentration. La méthémoglobine, l'hémochromogène et l'hématine, en solution acide et en solution alcaline, présentent également des spectres d'absorption intéressants.

31. Cristaux d'hémoglobine. — Chaque étudiant reçoit sur un porte-objet, trois gouttes d'une solution concentrée d'hémoglobine (1) de cobaye, que l'on conserve au laboratoire dans des

Fig. 76.

a, introduction de la solution d'hémoglobine dans un tube à conserver. — 6,1e même tube rempli et scellé.

(1) Sang de cobaye défibriné, soumis à la congélation, puis introduit après dégel dans des tubes de verre et conservé à l'abri de l'air (tubes scellés à la lampe). Il suffit de casser la pointe d'un des tubes et de l'incliner, pour laisser écouler à l'extérieur une goutte de sang.

tubes scellés. Cette hémog'lobine passe au contact de l'air à l'état d'oxyhémoglobine, et commence à cristalliser. Recouvrez chaque goutte de sang d'une lamelle, et examinez au microscope à un grossissement moyen, tant à la lumière ordinaire

Fig. 77. — Spectroscope disposé pour l'examen du spectre d'absorption de l'oxyhémoglobine (D'après Landois, Physiologie).

Les rayons lumineux émanés de la lampe E traversent la solution rouge coutenue dans le vase à faces parallèles D (hématinomètre de Hoppe-Seyler), entrent dans le tube B, par une fente étroite, sont dispersés et réfractés par le prisme, et arrivent à l'œil de l'observateur par la lunette A. La lampe F sert à éclairer uue échelle graduée contenue dans le tube C. L'image de cette échelle se réfléchit à la surface du prisme et vient se peindre à côté du spectre d'absorption. (D'après Landois, Physiologie.)

qu'à la lumière polarisée (prisme de Nicol polariseur sous la platine du microscope, Nicol analyseur au-dessus de l'oculaire — interposez une plaque de gypse au-dessus du polariseur, et faites tourner l'oculaire analyseur — les cristaux d'hémoglobine prennent des tons pourpres, bleus, orangés, etc., du plus bel effet; ces cristaux sont biréfringents).

On peut aussi déposer sur le porte-objet, une goutte de sang de cobaye, obtenue en faisant une légère coupure au pavillon de l'oreille ; la laisser sécher sur les bords, ajouter une goutte d'eau et recouvrir d'une lamelle au bout de quelques

LE SANG ET LES MATIÈRES ALBUMINOIDES

minutes . La cristallisation s'établit souvent tardivement. 32. L'hémoglobine contient du fer. — Une partie de la bouillie do globules (n" 25) est dessécbée dans une capsule au bainmarie, puis incinérée avec précaution, dans un petit creuset (sous la cage d'évaporation). Il reste un résidu couleur de

Fig. 78. — Grislaux d'oxyhémoglobiue de cobaye (tétraèdre simple et tétraèdres modifiés). (D'après Fredericq et Nuel, Physiologie .)

Fig. 79.

Hémalinomètre.

Fig. 80. — Cristaux d'oxyhémogloJ^ine

* a, homuie et chien. — 6, cobaye. — c, chat. — d, homme (veiue splénique). e, hamster. — /", écureuil. (D'après Funke).

rouille (oxyde de fer). Laissez refroidir, ajoutez quelques gouttes d'acide chlorhydrique, pour dissoudre l'oxyde et y rechercher la présence du fer. A cet effet, diluez avec quelques centimètres cubes d'eau et divisez en deux portions. A l'une, ajoutez quelques gouttes de solution de ferro-cyanure de potassium = précipité de bleu de Prusse. A l'autre, ajoutez quelques gouttes de sulfo-cyanure de potassium := solution rouge. 33. L'hémoglobine se transforme à l'air en méthémoglobine. — Projetez quelques gouttes de sang sur du papier

à filtrer. Au bout de quelques heures, l'hémoglobine prend un ton brunâtre sale (méthémoglobine).

34. L'hémoglobine transporte l'ozone de l'essence de térébenthine a la résine de gayac. — Faites dans un tube à réaction un mélange, à parties égales, d'essence de térébenthine (ozonisée : essence vieille) et de teinture de gayac fraîche (dissoudre un morceau de résine de gayac dans quelques centimètres cubes d'alcool); agitez vivement. Versez quelques

Fig. 81. — r.alcination de l'hémoglobine daus un petit creuset en platine. L'opération se fait également dans un creuset en porcelaine (Jungfleisch).

gouttes du [liquide trouble ainsi obtenu, sur un morceau de papier^à filtrer; attendez que le liquide ait été bu par le papier et se soit évaporé en partie. Laissez tomber sur le papier une ou plusieurs gouttes de sang (ou de solution d'hémoglobine) : chaque goutte de sang s'entoure d'une auréole bleue, et finit par bleuir elle-même complètement.

Ajoutez quelques gouttes de sang au tube qui contient le reste du mélange de gayac et d'essence, et agitez vivement; la masse prend d'abord une coloration brun verdàtre sale, puis franchement bleue.

Il est plus difficile d'obtenir la coloration bleue par l'action

LE SANG ET LES MATIERES ALBUMINOIDES

du sang seul (sans essence de térébenthine) sur la teinture de gayac.

35. Dosage colorimétrique de l'oxyhémoglobine, au moyen de riiémoglobinomètre de Gowers (fig. 82).

L'instrument se compose :

a) D'une pipette très étroite, munie d'un tube aspirateur en caoutchouc, et destinée à mesurer 20 millimètres cubes de sang (aspirer jusqu'à la marque transversale);

b) D'un tube gradué, dans lequel on introduit les 20 millimètres cubes de sang, qu'on dilue par addition d'eau, jusqu'à ce que la teinte du mélange paraisse semblable à celle du liquide coloré contenu dans le tube étalon^;

c) D'une pipette à eau servant à dihier le sang à l'intérieur du tube h\

d) Du tube étalon rempli d'une solution de picrocarmin, correspondant comme teinte à du sang humain normal, dilué au centième;

e) D'un bloc de liège percé de trous ; c'est dans ce bloc que l'on fixe verticalement, l'un à côté de l'autre, le tube gradué b et le tube étalon d.

On place le tout sur fond blanc, devant une fenêtre.

Les divisions du tube gradué correspondant chacune à un volume (20 mm.) de sang ; elles indiquent par conséquent le nombre de volumes d'eau qu'il a fallu ajouter à un volume de sang, pour que la teneur en hémoglobine soit la même que celle d'une solution de sang humain normal, au centième.

36. Hématine. — Yersez de l'acide acétique dans une solution d'oxyhémoglobine : celle-ci est décomposée en albumine acide et en hématine, qui colore le liquide en brun café. La même réaction s'établit, quoique plus lentement, avec l'oxyhémoglobine et la potasse.

37. Hémochromogène. — La solution brune d'hématine, obtenue par l'action de la potasse sur l'oxyhémoglobine, est intro-

Fig. 82. — Hémoglobinomètre de Gowers.

a, pipeUe de 20 mm. c.

— h, tube gradué pour le mélange du sang. — c, pipeUe pour diluer. — d, tube étalon, renfermant du picrocarmin correspondant à la dilation au 100^ du sang normal.

duite dans un tube, scellée (voir fig. 76, n" 30), et conservée à l'abri de l'air: elle ne tarde pas, au bout de plusieurs jours, à se réduire, en se transformant en hémochromogène, qui est rouge. Cassez la pointe du tube, versez le liquide rouge sur fond blanc (assiette ou capsule de porcelaine), pour observer l'oxydation de l'hémocliromogène et sa transformation en hématine brune. Versez dans un grand tube une solution d'oxyhémoglobine ou de sang, introduisez-y également un second tube plus petit ouvert supérieurement, contenant une solution de soude, en évitant de mélanger les deux liquides. Scellez le grand tube à la lampe. Attendez quelques jours jusqu'à ce que l'hémoglobine se soit réduite spontanément, puis retournez le grand tube, de manière à provoquer le mélange de l'hémoglobine réduite et de la soude. Il se forme de l'hémocliromogène (rouge), qui se transformera en hématine (brune), si vous ouvrez le tube, et si vous laissez le liquide exposé à l'air.

38. Hémine ou chlorhydrate d'hématine. — Pulvérisez dans le mortier un petit fragment de sang desséché ; déposezen une très petite pincée

< "^ ^ Mi -«K^ dans un verre de montre; ^ ^ Y ajoutez quelques gouttes

d'acide acétique glacial, et dissolvez à une douce chaleur au bain-marie. Renou- Fig. 83. - Cristaux d'hémine en prépara- yglez au besoin une OU deux tion microscopique. — rort grossissement.

{Beanaïs, Physiologie.) fois l'acide acétique; éva-

porez jusqu'à consistance sirupeuse, puis versez une goutte du liquide épaissi, sur un porte-objet ; recouvrez d\ine lamelle, et examinez à un fort grossissement : cristaux d'hémine. La préparation se conserve indéfiniment.

39. Détermination de la quantité totale de sang. — Un petit chien de 6 kilos, anesthésié par la morphine (injection sous-cutanée de 15 centigrammes de chlorhydrate de morphine) et le chloroforme (en inhalations), est fixé sur le dos dans la gouttière d'opération. On prépare la carotide et la jugulaire droites. Le bout périphérique de la carotide est lié, et une canule est introduite dans son bout central. On recueille

GAZ DU SANG ET UESClHATIOiN. lOo

directement, par la saignée de la carotide, la plus grande partie du sang (environ 300 c. c), que l'on mesure dans un cylindre gradué, après l'avoir défibriné.

Au bout d'une dizaine de minutes, la canule carotidienne ne fournit plus une goulle de sang. A ce moment, on la relie au moyen d'un long lube de caoulcliouc, formant siplion, avec une grande bouteille remplie de solution physiologique (NaCl à 0,7 p. iOO) et placée sur une console, à une hauteur de 2", 50 au-dessus du corps de l'animal. Cette solution lave tout l'appareil circulatoire du chien, et entraîne avec elle le sang qui restait dans les vaisseaux. Pour recueillir ce mélange de sang et d'eau salée, on introduit, par la jugulaire droite, jusque dans le cœur droit, un tube de verre, auquel on rattache extérieurement un bout de tube de caoutchouc, conduisant les liquides de lavage dans un vase ad hoc.

Pour déterminer le degré de dilution des eaux de lavage, on a recours à un dosage colorimétrique d'hémoglobine (Voir: Ilémoglobinomètre de Gowers, n° 35, fig. 82). On recueille, par exemple, 3 litres de liquide sanguinolent; ce liquide doit être additionné de 12 litres d'eau pour présenter la même teinte qu'une solution de sang au centième (10 c. c. de sang défibriné-|- 990 c. c. d'eau =: 1 litre). Ces IS litres de liquide correspondent à 150 c. c. de sang.

L'animal, qui pesait 6000 grammes dans l'exemple choisi, contenait donc 300 4- 150 = 450 c. c. de sang, soit environ

■777 de son poids.