BACILLE TUBERCULEUX — PSEUDOTUBERCULOSES, LÈPRE.— MORVE

A. — Coloration du bacille tuberculeux dans les produits tuberculeux (crachats, pus, etc..…).

a) Méthode de Ziehl-Nielsen (méthode de choix). — Les préparations de frottis ou de crachats, fixées par la chaleur, sont immergées dans un bain de fuchsine de Ziehl contenu dans un tube large, à recouvrement, de Borrel, ou dans tout autre récipient qu'on porte à l’étuve à 37° pendant deux heures. Ou bien, si l’on est pressé, on verse directement sur la lame quelques gouttes de colorant filtré et on chauffe sur la veilleuse d’un bec Bunsen ou au-dessus de la flamme d’une lampe à alcool, jusqu’à ce que le liquide émette des vapeurs, et ce, pendant au moins deux minutes.

On lave un instant à l’eau froide pour enlever l'excès de couleur et on verse sur la lame une dilution d'acide azotique (1 partie d'acide pour 3 parties d’eau distillée), ou bien une dilution d’acide acétique au tiers dans l’alcool à 95°. On laisse en contact 20 secondes ; on lave à l'alcool à 60° jusqu’à ce que la préparation soit bien. décolorée. On la passe à l’eau.

On recolore pendant 30 secondes avec le bleu phéniqué de Kühne. On lave finalement à grande eau sous le robinet pendant 2 ou 3 secondes ; on sèche ; on laisse tomber sur la préparation une goutte d'huile à immersion et on examine directement, sans lamelle.

Si la lame doit être conservée, on la lave au xylol après l'examen pour enlever l'huile, et on sèche. Elle peut alors être reprise ultérieurement et recolorée s’il est nécessaire, car à la longue les bacilles se décolorent.

Les bacilles tuberculeux se détachent nettement colorés en rouge sur fond bleu. |

Au lieu d'employer l'acide azotique au quart ou l’alcool acétique comme agent décolorant après l’action de la fuchsine phéniquée, on peut se servir d’une solution de chlorkydrate d’aniline à 2 p. 100 dans l’eau. Ce réactif est beaucoup moins brutal, moins nuisible aux éléments histologiques qui accompagnent le bacille tuberculeux. On le fait agir pendant environ 30 secondes, puis on achève de décolorer par l'alcool à 95° ; on lave à l’eau et on recolore au bleu de méthylène comme il a été dit ci-dessus.

b) Méthode de von Betegh. — Verser sur le frottis quelques gouttes d'acide azotique à 15 p. 100 et chauffer quelques instants.

Laver et colorer par un mélange à parties égales de bleu de méthylène alcalin de Lœffler et de fuchsine phéniquée de Ziehl. Chauffer de nouveau 1 à 2 minutes.

Décolorer par l'alcool à 60° et recolorer le fond pendant 1 à 2 minutes par une solution aqueuse saturée de vert malachite. Laver. Les bacilles apparaissent rouges et leurs granulations prennent une teinte bleu sombre sur fond vert.

c) Méthode d'Herman.— Colorer à chaud par un mélange de solution à 3 p. 100 de crystal-violet dans l’alcool absolu et de trois parties de solution aqueuse à 1 p. 100 de carbonate d’ammoniaque.

Décolorer 2 à 5 minutes dans l’acide azotique à 10 p. 100 ; laver à l'alcool à 900 jusqu'à coloration bleu pâle ; recolorer le fond soit avec la vésuvine, soit avec la safranine en solution aqueuse à 1 p. 100.

Les bacilles sont bleu intense, le fond rouge ou brun suivant le colorant de fond emplové.

d) Méthode de Much. — (Pour les granulations gramophiles.) Colorer 24 à 48 heures par la solution suivante :

Sol. alcool. concentrée de violet de méthyle BN. . . UNE Saba aride phenique 4 2 p.100. 2,2" 2% 100:cc.

Traiter 12 minutes par la solution iodo-iodurée de Gram- Lugol, puis sans laver, 1 minute parunesolution à 5 p. 100 d'acide azotique et 10 secondes par une solution à 3 p. 100 d'acide chlorhydrique.

Laver à l’alcool-acétone (parties égales) jusqu’à ce que toute la couleur soit éliminée.

Recolorer avec une solution de fuchsine diluée ou par une solution aqueuse de safranine à 1 p. 100, 5 à 10 secondes. Laver à l’eau et sécher.

e) Méthode de Fontès (pour les granulations gramophiles). Colorer 2 minutes à chaud par la fuchsine de Ziehl. Laver à l'eau. Colorer au crystal-violet phéniqué, 2 minutes. Couvrir la lame (sans laver) de solution iodo-iodurée de Gram- Lugol qu'on verse et renouvelle 3 fois.

Traiter par l'alcool-acétone jusqu'à décoloration complète. Laver à l’eau. Recolorer rapidement au bleu de méthylène phéniqué. Laver à l’eau, sécher ; examiner dans l'huile à immersion. Le bacille, dans les cultures comme dans les crachats, paraît alors constitué de deux parties : une enveloppe protoplasmique teinte en rouge et des granulations colorées en violet foncé, en nombre d'autant plus grand que les bacilles sont plus âgés. Les jeunes bacilles ne présentent ordinairement qu'une seule granulation chromatophile centrale.

f) Méthode de coloration des bacilles de Koch et de leurs granulations (Blanco) :

1° Fixer la lame par la chaleur;

20 Colorer au Ziehl pendant 5 à 10 minutes en chauffant seulement une fois jusqu’à émission de vapeurs ;

3° Décolorer avec alcool absolu contenant 3 % d'HCI ;

4 Bien laver à l’eau;

5° Différencier pendant 10 minutes avec une solution d'orange Î obtenue en ajoutant 1 centimètre cube d’une solution aqueuse saturée de ce colorant à 99 centimètres cubes d'eau ;

6° Incliner la lame et colorer seulement la moitié inférieure de la préparation avec une solution faible de bleu de méthylène pour teindre le fond.

B. — Coloration des coupes.

Fixer les pièces à l’alcool ou au formol. Traiter 2 à

5 minutes par l'hématoxyline pour colorer le noyau des cellules. Colorer au Ziehl deux heures à 37° ou 24 heures à la température du laboratoire. Décolorer au chlorhydrate d’aniline, puis à l'alcool à 95°; laver à l’eau, colorer le fond en jaune par l'acide picrique (solution alcoolique saturée).

C. — Homogénéisation des crachats ou produits tuberculeux pour la recherche et la culture des bacilles.

a) Procédé à la soude. — Méthode de Pétrof. — Les crachats sont recueillis dans un flacon stérile à large goulot, fermé par un bouchon de caoutchouc. On les additionne ensuite de solution stérile de soude à 4 p. 1.000, parties égales si les crachats sont muqueux et fluides, ou 3 ou 4 parties de solution sodique pour une partie de crachats s'ils sont épais et purulents. On agite vigoureusement et on porte à l'étuve. Après une demi-heure on agite et on laisse de nouveau le mélange à l’étuve pendant 30 minutes. On centrifuge pendant un quart d'heure à grande vitesse, puis on décante le liquide. Si l'opération a été bien conduite, le sédiment doit se présenter sous l’aspect d’une pâte homogène, exempte de grumeaux. Pour rechercher les bacilles de Koch qu’il contient, on l'émulsionne dans une petite quantité d'eau physiologique et on l’étale sur des lames de verre préalablement lavées à l’acide chlorhydrique et séchées. On fixe par la chaleur et on colore ensuite suivant la méthode de Ziehl-Nielsen.

On peut également ensemencer, sur le milieu spécial de Pétrof dont il sera question plus loin, le culot de centrifugation des crachats traités par la soude. Pour cela, après avoir décanté la liqueur sodique commeil vient d’être indiqué, on émulsionne le sédiment dans 4à 5 gouttes d’acide chlorhydrique à 5 p. 100. La réaction doit être légèrement acide ; on la vérifie en prélevant avec une fine pipette stérile une gouttelette de l’émulsion qu'on déposesur du papier de tournesol bleu. Il ne reste plus qu'à ensemencer le sédiment sur trois ou quatre tubes de milieu spécial à l'œuf au moyen d'une pipette stérile et à porter à l'étuve à 37-38, les tubes ensemencés, coiffés d'un capuchon de caoutchouc.

Suivant la richesse des crachats en bacilles, la culture apparaît du 8° au 15° jour sous l'aspect de petites colonies isolées ou confluentes, blanc jaunâtre, qui s'étendent peu à peu pour former unemembrane presque continue, sèche, mamelonnée.

b) Procédé à l'antiformine. — On mélange, dans un flacon, 20 à 30 centimètres cubes de crachats ou de pus, ou de fèces avec la même quantité d’une dilution d’antiformine dans l’eau à 15 p. 100. On bouche le flacon et on agite fortement pendant quelques minutes. On laisse en contact 2 à 5 heures. On verse dans un ou plusieurs tubes centrifugeurs stériles. On centrifuge 10 minutes et on sépare, par décantation, le culot, pour l’étaler sur lames.

Pouréviter les mousses, on peut ajouter quelques centimètres cubes d'alcool ou quelques gouttes d'’éther à l’antiformine avant d’agiter.

À défaut d’antiformine on peut employer l’eau de Javel ou la liqueur de Labarraque pure. Il faut alors prolonger le contact de 1 à 2 heures.

c) Procédé de Bezançon et Philibert. — A 5 centimètres cubes de crachats, on ajoute 25 centimètres cubes d’eau distillée et V gouttes de lessive de soude à 0,2 p. 100 (D : 1. 33) soit une goutte par centimètre cube de crachats. On chauffe doucement ce mélange à 60° dans une capsule de porcelaine en agitant constamment; on ajoute de nouveau 25 centimètres cubes d’eau distillée et on chauffe pendant 10 minutes. On laisse refroidir et on détermine la densité du mélange au moyen d'un densimètre gradué de 950 à 1.100. Si cette densité dépasse 1.004, on ajoute un peu d'alcool à 50° jusqu’à ce qu'elle soit retombée à 999 ou 1.000.

On prélève de quoi garnir 2 ou 4 tubes à centrifuger et on centrifuge pendant 3/4 d'heure ou pendant une heure. On décante le liquide et on étale le culot sur plusieurs lames de verre qu'on fixe et colore par la méthode de Ziehl-Nielsen.

d) Concentration des bacilles tuberculeux dans les crachats fluidifiés à l'étuve (Bezançon, Mathieu et Philibert).

On verse 5 à 10 centimètres cubes de crachats suspects dans un tube à essai que l’on porte à l’étuve à 37°. Les cra-

chats se fluidifient peu à peu pendant que les bacilles se déposent dans le fond du tube. La concentration atteint son maximum du 4° au 7° jour. On décante alors le liquide, on fixe par la chaleureton colore, par les méthodes habituelles, le culot étalé sur des lames de verre. On peut également centrifuger toute la masse, décanter et étaler le culot.

D. - Homogénéisation du sang pour la recherche des bacilles.

On extrait à la seringue, d’une veine du pli du bras, 10 centimètres cubes de sang qu'on projette aussitôt dans un tube contenant 10 centimètres cubes de solution stérile de citrate de soude à 2 p. 100 dans l’eau salée physiologique. On ferme le tube avec un bouchon de caoutchouc stérile ; on le retourne 3 ou 4 fois et onle porte à la glacière pendant 24 heures. On décante ensuite le liquide avec précaution eton recueille le sédiment à la pipette. Ce sédiment est étalé en couche épaisse sur lames de verre, séché à l'étuve, puis débarrassé des hématies par immersion dans . l’eau distillée stérile, et coloré pour examen au microscope. On peut aussi le laquer par l’eau distillée, le centrifuger et inoculer le dépôt à des animaux.

E. — Milieux de culture pour le bacille tuberculeux (pHt:6,8 à°7,2):

a) Sérum de bœuf glycériné à # p. 100 et coagulé par chauffage à 729 en position inclinée ; la culture doit être faite dans une étuve bien réglée à la température constante

de 382.

b) Pomme de terre glycérinée à 4 ou 5 p. 100. — Dans des tubes de Roux, à étranglement. On remplit le tube, jusqu'à la partie étranglée, avec de l’eau glycérinée ou avec du bouillon glycériné, de telle sorte que l'extrémité de la tranche de pomme de terre touche au liquide.

c) Bouillon ordinaire légèrement alcalin et glycériné à # ou

à p. 100. Surce milieu, le bacille tuberculeux doit êtreensemencé avec précaution, en surface, au moyen d’un fragment de voile prélevé sur une autre culture jeune. Si la semence est noyée dans le liquide, la culture ne se développe pas.

d) Bouillon de pomme deterre ( Vaudremer).— On fait bouillir 500 grammes de pommes de terre pelées dans un litre d’eau. On filtre. On ajoute de la soude jusqu’à réaction neutre au tournesol et on stérilise à 120° pendant une demiheure. Les bacilles de Koch ensemencés sur ce milieu non additionné de glycérine forment un voile assez rapidement. Ïls sont plus longs que les bacilles tuberculeux cultivés sur les milieux ordinaires, leur acido-résistance est faible surtout quand ils proviennent de la périphérie du voile.

e) Milieu à l'œuf, de Dorset. — Onlavedes œufs de poule à l’eau bouillie et on les brosse soigneusement. On les immerge pendant quelques minutes dans une solution phéniquée à 5 p. 100. On les saisit entre deux feuillets de papier buvard stérile. On flambe leurs deux pôles et, avec une pince pointue flambée, on pratique sur chacun de ces pôles (au-dessus de la flamme de la veilleuse d'un bec Bunsen), une ouverture. Au moyen d'un tube de caoutchouc stérile portant un filtre à coton stérilisé, on souffle par l’ouverturesupérieure, detelle sorte que le contenu de l'œuf tombe de l'ouverture inférieure dans un matras d'Erlenmeyer stérile et préalablement taré. On introduit ensuite, dans le matras, une quantité d’eau stérile correspondant à 10 p. 100 du poids d'œuf et on agite pour assurer le mélange homogène du jaune, du blanc et de l’eau, sans faire de bulles d'air. On jette ensuite le tout dans un entonnoir portant une tarlatane stérile (sous un couvercle en papier buvard stérile) et on répartit aseptiquement Ja masse filtrée dans des tubes à essai. On coagule à 70° pendant 2 heures, en position inclinée, et on porte le tube à l'étuve à 37° pendant trois jours, afin de rejeter ceux qui seraient contaminés. On les obture ensuite avec des capuchons de caoutchouc et onles conserve en position verticale jusqu'au moment de leur emploi. Ce milieu convient à l’isolement des bacilles tuberculeux d’origine bovine. Le bacille humain n'y pousse que très faiblement.

f) Milieu à l'œuf glycériné, de Lubenau. — Même prépara-

tion en remplaçant l’eau de dilution de l’œuf par 30 p.100 (du poids de celui-ci) de bouillon alcalin glycériné à 5 p. 100. Ce milieu permet la culture du bacille d’origine humaine.

g) Milieu à l'œuf, de Pétrof. — À 250 grammes de viande fraîche de veau, hachée au hachoir stérile, on ajoute 212 grammes d’eau distillée et 37 grammes 5 de glycérine stérile. On place le tout à la glacière pendant une nuit et on filtre sur gaze stérile.

On désinfecte ensuite les œufs frais en les immergeant pendant 15 minutes dans l'alcool à 70° et on les casse, en les manipulant avec des gants de caoutchouc stériles. Après avoir mélangé intimement blancs et jaunes et filtré sur gaze stérile, on ajoute 200 centimètres cubes de filtrat de viande à 400 centimètres cubes de filtrat d'œuf, et on additionne ce milieu de solution alcoolique de violet de gentiane à 1 pour 100 d'alcool à 95°, dans la proportion de 1 centimètre cube de solution colorante pour 100 centimètres cubes de milieu. Mélanger de nouveau et répartir en tubes.

Faire coaguler ensuite en position inclinée en chauffant à

85° pendant 30 minutes le premier jour 759 — 30 — le deuxième jour 75° — 30 — le troisième jour

Le milieu obtenu présente une belle coloration violette, homogène, qui permet d'observer facilement les colonies blanches ou jaunâtres du bacille tuberculeux. Il convient particulièrement à l'isolement de ce microbe à partir des crachats préalablement traités par la soude. Pour les repiquages ultérieurs, on utilise le même milieu non additionné de violet.

h) Milieu de Heyden-Hesse :

Nitrqede Heydén,. RAS ANUS DOTE.

AR a M ee A, 50 ce.

après dissolution, ajouter :

Chlorure de s0diun. 7200 PER 5 gr.

GINSérINSPEIPMOE E ULA etre VAS 30 gr.

(OlOSE PE EN EME IR SRE 10 à 20 gr.

Solution décinormale de soude. , , . 5 cc.

haudistiliéennoss SUR. ERA 950 cc.

1. Le nutrose de Heyden provient de la fabrique Heyden, à Radebeul, près Dresde, On peut lui substituer la Somatose ou le Tropon.

MICROBIOLOGIE 26

Porter 15 minutes à l’autoclave à 1002, filtrer, stériliser à 115° en tubes contenant chacun la quantité de milieu nécessaire pour une boîte de Pétri.

(Convient plus particulièrement à l'isolement initial des bacilles tuberculeux.)

i) Pomme deterre biliée (Calmette et Guérin). — On immerge les tranches de pommes de terre coupées à l'emporte-pièce dans de la bile de bœuf pure, filtrée et stérilisée, à laquelle on a ajouté 5 p. 100 de glycérine. On porte le tout au bainmarie à 75° pendant 3 heures. Les pommes de terre sont ensuite réparties en tubes de Roux qu'on FAUIE jusqu'à l’étranglement avec de la bile pure glycérinée à 5 p. 100. On stérilise 30 minutes à 120?.

Sur ce milieu, le bacille tuberculeux donne des cultures très épaisses, abondantes, lisses et luisantes, de couleur café au lait et ressemblant aux cultures de morve.

j) Milieux minéraux. — 1° Milieu de L. Massol et M. Breton :

Eau distillée. . . CE AT CO REA 1e 1 litre Carbonate de soude. Se nie Me ue 1 gr.

Sulfatelerreux PEER NP REE 0 gr. 040 Sulfate de magnésie 0 gr. 050 Phosphate de potasse MR 178r, Ghiorare de ‘sodium 0 RER EN 8 gr. 9 Glucose tas run abs RE OL ETRE. 10 gr.

Giycénine ec PRET 40 gr.

ASDATAGIDE OPERA RES ER ES PEER 2 gr.

20 Milieu de Sauton.

Asparagines2i tee TOVEMEAN-OPTRUERCUE 4 gr.

Glycérine F1 SO Cet 2 -cCUEEr Acide citrique. . SAME 20 SA De nc 2 gr.

Phosphate bipotassique. TRS AUULC NE 0 gr. 5 Sulfate de magnésie ME CRE 0 gr. 5 Citrate de fer ammoniacal. . . . . . . 0 gr. 05

aus CNRS ER ERREUR CN AS IT TU, 1.000 cc.

Après 20 jours de culture, le poids de bacilles secs obtenu sur ce milieu est de 1 gramme environ pour 100 centimètres cubes de liquide, tandis que sur le bouillon glycériné il n'est que de 0 gr. 65.

3° Milieu d'Armand Delille, Mayer, Schaeffer et Terroine.

FAURE ESSOR, SAR DO Er:

Chlorure de sodium. . . . . . . . 1 gr. 25 Phosphate monopotassique. . . . . . 1*gr, 25

thholemiermagnesie. fl its 210"1e 0 gr. 60

RUPOS SN Ca RAA: ie 1 gr.

MNT RENE A Ne led, lu, 10 gr.

ET PPT ROSES © EN 6 AN EEE EX 1 gr.

Arginine. RTS run Pire de 0 gr. 50

Solution de soude à 1 pour 100. . . . 1 cc. après neutralisation préalable.

En douze jours, les bacilles fournissent sur ce milieu un voile complet, épais, gaufré, grimpant le long des parois du vase.

F.— Culture des bacilles contenus dans les crachats

Le milieu à l’œuf de Petrofetla gélose nutrosée de Heyden, ci-dessus indiqués, sont très favorables à l'isolement initial des bacilles tuberculeux contenus dans les crachats ou dans les organes.

La méthode de Uhlenhut à l’antiformine est également très recommandable.

Dans un flacon stérile, taré ou gradué à 100 centimètres cubes, on introduit 20 à 30 centimètres cubes de crachats, 15 centimètres cubes d’antiformine et une quantité d’eau distillée stérile suffisante pour porter le volume total à 100 centimètres cubes. On agite vivement pour bien mélanger et on laisse en contact 2 à 5 heures. On verse ensuite le liquide dans des tubes centrifugeurs stérilisés ; on centrifuge, on décante le liquide clair ; on lave une ou deux fois (en centrifugeant de nouveau) le culot avec de l’eau salée physiologique stérile ; on le recueille enfin et on l’ensemence sur plusieurs tubes de sérum gélatinisé glycériné, sur pommes de terre biliées glycérinées et sur les milieux différentiels à l’œuf, de Dorset, de Lubenau ou de Besredka.On porte à l'étuve à 37-382.

G. — Tuberculine.

a) Préparation de la tuberculine brute de Koch. — On stérilise à la vapeur à 100°, pendant une heure, des cultures de bacilles tuberculeux en bouillon glycériné à 4 p. 100, âgées

de 6 semaines. On les évapore ensuite au bain-marie dans des capsules de porcelaine jusqu’à réduction au 1/10 et on filtre le liquide concentré à travers un double filtre de papier épais (papier Chardin) qui retient la plus grande partie des corps microbiens. Une dose de O cc. 1 à O0 cc. 8 de cette tuberculine doit tuer en 6 à 24 heures les cobayes infectés depuis 4 semaines par l'injection sous-cutanée de 1 centigramme de bacilles tuberculeux, quantité ordinairement suffsante pour amener la mort de ces animaux en 8 à 10 semaines. A l’autopsie de ces cobayes on trouve, au point d’inoculation des bacilles et aux alentours, une infiltration rouge, œdémateuse qui s'étend aux ganglions correspondants. La rate, le foie, les poumons et l'intestin grêle présentent des taches de couleur rouge foncé ressemblant à des ecchymoses. Les capsules surrénales sont augmentées de volume et congestionnées.

b) T'uberculine purifiée (Calmette et Massol). — On obtient des produits faciles à purifier en partantde cultures en milieu liquide sans peptone, tel que celui dont la composition a été indiquée ci-dessus (milieu de Massol et Breton). On les concentre dans le vide à 45° jusqu’à réduction au cinquième du volume primitif. On précipite ce liquide par 20 volumes d’un mélange à parties égales d'alcool à 95° et d’éther sulfurique ; on redissout le précipité dans un faible volume d’eau et on le soumet, pendant 6 à 12 heures au plus, à la dialyse à l’eau distillée courante, froide, sur parchemin animal ; puison précipite une deuxième fois par 10 volumes d'alcool absolu. La poudre blanche (tuberculine CL) qu'on en retire après dessiccation est environ dix fois plus active que celle fournie par la précipitation alcoolique de la tuberculine ancienne. Le rendement est d'environ 0 gr. 75 pourun litre de culture.

c) Préparation des émulsions bacillaires pour l’inoculation des animaux de laboratoire. — Il est indispensable de préciser, pour chaque expérience, le poids de microbes employés. Pour peser les bacilles, on prélève, avec une spatule de platine flambée, une petite quantité de culture qu’on essore par pression sur plusieurs feuillets de papier filtre et qu'on porte ensuite sur un petit carré de papier Chardin

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taré, dans un verre de montre, à la balance de précision. On en prend ainsi 10 mgr. par exemple.

Ces bacilles sont ensuite introduits, avec la spatule, dans un petit ballon de verre de 100 à 150 cc., stérile et contenant des billes de verre de 2 à 3 millimètres de diamètre sur une hauteur de 1 centimètre environ. On agite vivement pendant 1 ou 2minutes de façon à bien dissocier les microbes. On verse ensuite 1/2 cc. d’eau physiologique avec une pipette graduée stérile. On agite de nouveau pendant 2 ou 3 minutes et on ajoute 9 cc 5 d'eau physiologique en remuant constamment pour obtenir une émulsion bien homogène titrant 1 milligramme de bacilles par centimètre cube.

Pour préparer des émulsions titrant 0 mgr. 1, O0 mgr. 01, 0 mgr. 001, etc., par centimètre cube, il suffira de diluer, dans un verre stérile, ? centimètre cube de l’'émulsion mère dans 9 centimètres cubes d’eau physiologique, d’agiter soigneusement en aspirant et refoulant avec la pipette le liquide à plusieurs reprises dans le récipient ; puis de diluer 1 centimètre cube de cette émulsion titrant 0 mgr 1 par centimètre cube dans 9 centimètres cubes d’eau physiologique, et ainsi de suite.

On peut également préparer l’émulsion mère en déposant les bacilles dans un mortier d’agate stérile et en les dissociant peu à peu avec une solution stérile de carbonate de soude au dix-millième ajoutée d’abord goutte à goutte à la pipette, ou avec 2 ou 3 gouttes de bile de bœuf stérile, ou encore avec 2 ou3 gouttes de jaune d'œuf frais. Mais le premier procédé donne des émulsions plus homogènes et plus pures.

H. — Modes d’inoculation ou d'infection expérimentale des petits animaux de laboratoire.

a) Inoculation du cobaye par vote péritonéale (cultures ou produits suspects purs). — Le cobaye étant immobilisé par un aide, le ventre dirigé horizontalement en haut, on coupe les poils un peu à droite ou à gauche de l’ombilic sur une étendue de 2 à 3 centimètres carrés. On badigeonne de

teinture d’iode et, quand l’alcoolest évaporé, on pique verticalement la peau et la paroi musculaire d'un coup sec, en faisant pénétrer l'aiguille d'environ 1 centimètre dans la cavité péritonéale. On s'assure que la pointe est mobile en tous sens, on pousse doucement l'injection, on retire l’aiguille et on touche de nouveau la petite plaie avec de la teinture d’iode.

Avec des bacilles de virulence moyenne injectés à la dose de0 mgr. 1 pesés à l’état frais, la mort survient, en général, en 3 ou 4 semaines. |

b) /noculation intravasculaire (cultures pures). — Se fait très aisément, chez le lapin, dans la veine marginale de l'oreille. Chez le cobaye, on injecte les émulsions virulentes dans la veine saphène, la jugulaire ou la carotide mise à nu par section de la peau. Chez le rat et la souris, on choisira une des veines latérales de la queue et on injectera les émulsions bacillaires au moyen d’une aiguille très fine, semblable à celles qu'emploient les dentistes pour les injections intragingivales. L'injection intracardiaque est facilement réalisable chez le lapin et lecobaye (quantité maxima de liquide à injecter 1/2 à 1 centimètre cube suivant la taille pour ce dernier animal.

c) /noculation intracranienne (voir chapitre xv). d) /noculation par voie intraoculaire (voir chapitre xv).

e) Inoculation par instillation oculaire (Calmette, Guérin, Grysez) (cultures et crachats). Le cobaye étant solidement immobilisé par un aide et tenu horizontalement, on écarte les paupières en les soulevantlégèrement et,au moyen d’une pipette tenue à courte distance de l’animal, on dépose une goutte d'émulsion virulentedans le cul-de-sac conjonctival. On ferme ensuite doucement les paupières à deux ou trois reprises et on remet le cobaye en liberté.

f) Infection par les voies digestives (cultures et produits bacillifères). Mélanger les produits bacillifères à une petite quantité d'aliments, du pain de préférence. On peut aussi les faire absorber à la pipette en ouvrant légèrement la bouche et en faisant couler doucement le liquide contre la joue, vers la base de la langue qui doit rester libre (quantité ma-

xima de liquide : 1 centimètrecube pour le lapin ; 0 ec. 2 et 0 cc. 5 pour le cobaye ). La sonde œsophagienne est employée quand on veut introduire directementles bacilles' dans l'estomac. On se sert d’une sonde uréthrale de petit calibre en gomme ; les mâchoires de l'animal étant maintenues écartées au moyen de deux lacets plats, la tête dirigée en haut, on fait glisser doucement le bec de la sonde le long du voile du palais. On est sûr d’avoir pénétré dans l’œso- : phage si les mouvements respiratoires restent réguliers et s'il ne se produit pas d'effort de toux.

g) Infection par voie transcutanée (cultures et produits bacillifères). Raser une étendue variable de peau sur la partie supérieure du cou de telle sorte que l'animal ne puisse se lécher, etétendre, avec une spatule ou un tampon de coton fixé à l'extrémité d’une baguette, les produits virulents : culture, crachats ou tissus réduits en pulpe.

ÏJ. — Réactions tuberculiniques diagnostiques.

a) Réaction thermique. — Parmi les petits animaux de laboratoire, le lapin sain supporte sans dommage jusqu’à 0 cc.5 de tuberculine brute injectée dans la veine, en solution dans 4 cc. 5 d’eau physiologique. Chez les lapins tuberculeux, au contraire, l'injection intraveineuse de 0 cc. 01 à0 cc. 02 de la même substance provoque une réaction thermique déjà manifeste vers la 3° heure et persistant pendant environ 12 heures en diminuant progressivement à partir de la 5° ou 6° heure.| Une élévation de température supérieure à 008, persistant pendant 4 à 6 heures, autorise à conclure à l'existence de la tuberculose chez l’animal éprouvé. Une dose supérieure à 0 cc. 1, injectée par la même voie, est généralement mortelle pour le lapin tuberculisé depuis au moins trois semaines.

L'injection sous-cutanée donne des résultats peu satisfaisants dans le diagnostic de la tuberculose chez le lapin etle cobaye. La voie la plus favorable chez ce dernier animal est la voie péritonéale. On injectera 0 cc. 02 à 0 cc. 03 de tuberculine brute en solution dans 1 centimètre cube

d’eau physiologique et on prendra la température toutes les deux heures jusque vers la douzième heure. Une réaction thermique supérieure à 0°8 et persistant pendant 4 à 6 heures, à partir de la troisième, est l'indice de la tuberculose.

b)/ntradermo-réaction. —Cetteméthodeconsisteà injecter, dans l'épaisseur même du derme, une quantité donnée de tuberculine. Chez les animaux de laboratoire, le cobaye en particulier, Ch. Mantouxrecommandel'épreuvede l’intradermo-réactior par l'inoculation d’une goutte dela solution mère, à 4 pour 10, de tuberculine précipitée de l'Institut Pasteur. La région d’élection est la face externe des pattes postérieures qu'on dépile préalablement. On fixe la peau contre le plan ostéo-musculaire sous-jacent entre les doigts et on injecte ensuite la solution dans le derme.

La réaction positive consiste en une infiltration œdémateuse du derme, blanche ou rosée, de 12 à 18 mm. de diamètre, accompagnée souvent d’une suffusion hémorragique. Elle atteint son complet développement 48 heures après la piqûre. Quand la réaction est négative, toute trace a disparu à la fin du deuxième jour.

D'après Blanco, la région des lombes ou des flancs conviendrait mieux. On la dépile au moyen d’un mélange à parties égales de sulfure de baryum et de carbonate de chaux et, le lendemain, on injecte dans le derme 0 cc. 1 d'une dilution au 1/5 de tuberculine ancienne de Koch en sérum physiologique (soit 0 cc. 02 de tuberculine brute). La réaction spécifique doit durer 48 heures et la rougeur doit être très apparente dans les 24 heures. Les réactions faibles ou fortes s’observeraient du 7° au 15° jour après l’infection.

c) Culti-réaction. — Très inconstante dans ses résultats, cette méthode est peu employée pour le diagnostic de la tuberculose chez les petits animaux de laboratoire.

d) Ophtalmo-réaction. — Réussit mieux chez le lapin tuberculeux que chez le cobaye. On instille une goutte de tuberculine brute, ou une goutte de solution au 1/ 100 de tuberculine purifiée, dans l’angle interne de l’un des yeux de l'animal suspect. Quand la réaction est positive, on observe,

déjà après 5 ou 6 heures, un peu de rougeur de la conjonctive, puis l’œil devient larmoyant, l’inflammation de la muqueuse augmente et une sérosité trouble s’accumule dans le cul-de-sac conjonctival. Au bout de 2 jours, cette inflammation locale s’atténue puis s’efface.

J. — Réaction de sédimentation des globules rouges.

— Dans le sang rendu incoagulable par addition de citrate de soude, les éléments figurés se sédimentent en 3 couches : les globules rouges dans la partie inférieure, les globules blancs dans la partie moyenne et le plasma citraté qui surnage. La rapidité de cette sédimentation varie selon les conditions physiologiques et pathologiques du sujet. Elle est fonction : 1° de la composition du milieu plasmatique et des proportions relatives de ses protéines ; 2° du nombre, du volume et de la composition physico-chimique des globules ; 3° de la tension superficielle, des forces capillaires et dela charge électrique des éléments en présence:

Technique de Fabreus-Westergreen. — Dans une seringue contenant une solution de citrate de soude à 3 p. 100, on recueille du sang par ponction veineuse dans la proportion de 1 partie de sang pour 4 parties de solution citratée. On agite le mélange et on en remplit, jusqu’à la marque 200 millimètres, des tubes de 300 millimètres de haut sur 2 mm. 5 de diamètre qu’on place ensuite verticalement. On examine après 1,2 et 24 heures et on note les résultats. Chez l’homme normal, le niveau de sédimentation, à la fin de la première heure, est de 3 millimètres ; chez la femme, de 5 à 10 millimètres. Ces chiffres sonttoujours plus élevés dans la tuberculose pulmonaire, et d'autant plus que son évolution est plus défavorable. Sans doute la méthode de sédimentation n'est-elle pas strictement spécifique ; cependant elle permet, dans certains cas douteux, d’exclure l'hypothèse de tuberculose pulmonaire ou la présence de lésions actives. Elle peut donc fournir des renseignements diagnostiques et pronostiques utiles.