I. — Hydrolases (diastases hydrolysantes

a) Sucrase (par exemple de la levure pressée de boulangerie). — On mélange dans un mortier, 20 grammes de levure avec 10 à 15 grammes de sable siliceux fin, bien lavé. On ajoute peu à peu 5 centimètres cubes d’eau en broyant pendant 5 minutes, puis, toujours par petites portions, encore 40 centimètres cubes d’eau en continuant à broyer. On laisse en contact 30 minutes en agitant de temps en temps, puis on filtre sur papier Chardin mouillé ou on centrifuge.

On fait agir des quantités variables (par exemple 0 cc. 5, 1 centimètre cube, 1 cc. 5, etc.) de cette solution de sucrase sur 10 centimètres cubes de solution de saccharose à 20 p. 100, en présence de 1 centimètre cube de dilution d'acide acétique à 1,5 p. 100 (acidité optima : 1 p. 1000) à la température de56°(optima), dans un bain-marie à régulateur.

On complète dans chaque tube au même volume avec de l’eau distillée stérile.

Après 30 minutes ou 1 heure, on arrête l’action diastasique en ajoutant à chaque tube quelques gouttes de lessive de soude. On mesure le pouvoir réducteur de chaque tube en comptant le nombre de gouttes nécessaires pour décolorer exactement un mélange bouillant de 2 centimètres cubes de liqueur de Fehling et 2 centimètres cubes d’eau.

b) Amylase et Dextrinase. — On peut les extraire, par exemple, du malt d'orge de brasserie.

On fait macérer 20 grammes de malt, finement broyé au

1. Pour plus de détails voir le Guide pour les Manipulations de Chimie biologique, de Gab. Bertrand et P. Thomas, auquel sont empruntées la plupart des notes de ce chapitre {H. Dunod, édit., Paris).

moulin, dans 100 centimètres cubes d’eau froide, pendant cinq heures, en agitant fréquemment. On centrifuge ensuite et on décante le liquide limpide qui renferme à la fois de l’amylase, diastase liquéfiante, et de la dextrinase, diastase qui saccharifie l’amidon. Si l’on chauffe ce liquide pendant 15 minutes entre 802 et 85°, la dextrinase est détruite tandis que l’amylase persiste. Cette dernière ne perd son activité qu’au voisinage de l'ébullition.

L'amylase liquéfie l’'empois d’âmidon préparé en délayant, par exemple, 6 grammes d'amidon dans 10 centimètres cubes d’eau et en versant le lait ainsi obtenu dans un ballon contenant 90 centimètres cubes d’eau bouillante. On agite vivement. On plonge dans ce ballon un thermomètre et on laisse refroidir à 85°. On ajoute alors 1 centimètre cube du liquide de macération de malt préparé comme il a été dit ci-dessus, en remuant constamment le mélange. La masse se fluidifie bientôt. Lorsque la liquéfaction est totale, on porte à l’ébullition et on laisse refroidir. L’amidon ainsi dissous n’est pas saccharifié. Il bleuit par l’iode et ne réduit pas la liqueur de Febling.

Le liquide de macération de malt liquéfie .et saccharifie simultanément l’empois d’amidon. La température optimum pour cette double action est de 65° à 700.

Pour mesurer le pouvoir saccharifiant, on utilise, de préférence, un empois d’amidon à 3 p. 100 (au lieu de 6 p. 100).

Dans un ballon contenant 100 centimètres cubes de cet empois maintenu à la température de 65° à 70°, au bainmarie régulateur, on ajoute par exemple 2 centimètres cubes de liquide de macération de malt.

Dans un certain nombre de tubes, on a versé d'autre part 10 centimètres cubes d'eau distillée et 2 ou 3 gouttes de solution d’iode à 1 p. 100. Toutes les deux ou quatre minutes (ou davantage suivant l’activité du malt employé), on prélève 1 centimètre cube du liquide du ballon avec une pipette graduée et on le verse dans l’un des tubes. On obtient ainsi une gamme de coloration depuis le bleu au début jusqu’à une teinte nulle, en passant par le violet, le rouge, le marron et le jaune.

Lorsque la teinte est nulle, on s'assure que le liquide réduit énergiquement la liqueur de Fehling à cause de la

formation de maltose. Il reste encore de la dextrine précipitable en blanc par 4 à 5 volumes d’alcool.

L’amylase de la salive saccharifie l'amidon et le glycogène en les transformant en maltose et en dextrine.

On peut mesurer son activité en faisant agir des quantités variables : 1 centimètre cube, 2,5 centimètres cubes, par exemple, sur une quantité fixe de solution préparée en dissolvant 1 gramme de glycogène dans 5 centimètres cubes d’eau distillée tiède à latempérature de 40°, au bain-marie. On arrête la réaction après 1 heure. On cherche dans quels tubes le liquide ne se colore plus par l’iode et on précipite dans tous les tubes la dextrine restant par 2 ou 3 volumes d'alcool.

On obtient facilement de la salive en déposant une goutte d’éther ou de chloroforme sur la pointe de la langue. On recueille la sécrétion dans un verre stérile et on filtre sur papier Chardin mouillé.

Les leucocytes etles sérums normaux renferment toujours une petite quantité d'amylase qu’on peut mettre en évidence en laissant à l’étuve, pendant 24 heures à 37°, dans un vase d'Erlenmeyer, 2 centimètres cubes de sérum, par exemple, mélangés à 50 centimètres cubes d'une solution stérilisée d’amidon à 1 p. 100 qu’on additionne de 1 centimètre cube de solution alcoolique de thymol à 1 p. 5, afin d'éviter les fermentations. Après 24 heures, on ramène (avec de l'eau distillée) au volume de 53 centimètres cubes; on défèque par 5 centimètres cubes de solution de sous-acétate de plomb et on filtre, puis on dose le sucre par la liqueur de Febling titrée de telle sorte que 1 centimètre cube soit réduit par 5 milligrammes de sucre. Avec le sérum normal humain, on trouve ainsi, en moyenne, 152 milligrammes de sucre formé.

La préparation du glycogène s’effectue le mieux en partant des mollusques (moules, huîtres, etc.). On broie leur corps au hache-viande et on en prend 30 grammes, par exemple, qu'on chauffe doucement dans une petite capsule de porcelaine avec 30 centimètres cubes de solution concentrée de potasse (faite avec 60 grammes de potasse en plaques pour 40 centimètres cubes d’eau).

On agite avec une baguette de verre jusqu’à ce que la dissolution soit complète, ce qui prend environ 1 heure. On remplace au fur et à mesure l’eau qui s’évapore pendant le

chauffage. On ajoute ensuite 50 centimètres cubes d’eau et on filtre sur un tampon d'amiante en repassant sur le filtre les premières parties.

À 50 centimètres cubes du liquide filtré, on ajoute 25 centimètres cubes d'alcool à 95°. Le glycogène se précipite. On recueille ce précipité sur un petit filtre en papier Berzélius sans plis, ou mieux on le centrifuge. On le lave avec 10 à 15 centimètres cubes d’alcool à 40°, on l’essore entre deux doubles de papier à filtrer et on sèche à l’étuve, aux environs de 500. Le glycogène ainsi obtenu est soluble dans l’eau tiède. On neutralise sa solution par l’acide acétique. Une goutte de solution d’iode donne une coloration rouge acajou. Ce liquide additionné de 2 ou 3 gouttes d’acide chlorhydrique et porté à l’ébullition pendant quelques minutes réduit la liqueur de Fehling par suite de la transformation du glycogène en glycose.

On dose le glycogène comme l’amidon, en faisant bouillir avec de l’acide chlorhydrique à 1 p. 20 et en déterminant la quantité de glucose formé.

c) Monobutyrinase du sérum. Lipodiastases. — On verse dans cinq tubes à essai, 10 centimètres cubes d’une solution aqueuse saturée de monobutyrine. Dans le premier, on ajoute 1 centimètre cube du sérum à étudier, dilué de 1 centimètre cube d’eau et préalablement chauffé (après dilution) 30 minutes à 80° (tube témoin) ; dans les quatre autres, 1 centimètre cube du même sérum frais. On ajoute à chaque tube, 1 goutte de solution alcoolique de phtaléine et on neutralise avec une solution de carbonate de sodium pur à 0,5 p. 100 jusqu’à teinte rose persistant un moment. Les cinq tubes sont alors portés dans un bain-marie réglé à 3D-370,

Après 15 minutes, on constate que le contenu du témoin est resté neutre. Le tube 1 est devenu acide et on compte le nombre de gouttes de la solution de carbonate de sodium nécessaires pour neutraliser. Soit a ce nombre. Au bout de 15 autres minutes on voit que, pour neutraliser ce même tube, il faut verser à peu près a gouttes de carbonate de sodium : or à ce moment, le tube 2 n’exige qu'un nombre de gouttes b << 2 a, ce qui signifie que l’action n’est pas proportionnelle au temps, mais va en se ralentissant. On le

vérifie de nouveau en examinant le tube 3 après 45 minutes et le tube 4 après 1 heure. Le ralentissement est dû à l'acide butyrique mis en liberté, car si on le neutralise, l’action redevient identique à ce qu’elle était au début.

On peut aussi mesurer l’action de la monobutyrinase du sérum sur la monobutyrine par le compte-gouttes de Duclaux (variation de la tension superficielle du liquide).

Pour cela, après avoir mélangé 20 centimètres cubes de solution saturée de monobutyrine avec 1 centimètre cube du sérum frais à étudier et 3 centimètres cubes d'eau, on aspire le liquide dans le compte-gouttes, on essuie l’ajutage inférieur de celui-ci et on compte le nombre de gouttes qui s'écoule de l’appareil. Ce nombre est voisin de 160 pour 5 centimètres cubes de liquide. Il varie avec la température. On recommence l'opération après 15, 30 et 45 minutes. Les nombres obtenus décroissent régulièrement.

En portant en abscisses les temps et en ordonnées le nombre de gouttes correspondant, on peut construire sur un papier quadrillé la courbe représentative du phénomène.

On doit toujours faire une expérience témoin avec un mélange de 20 centimètres cubes de la même solution de monobutyrine avec 4 centimètres cubes de sérum préalablement dilué à 1 p. 4, puis chauffé à 80° pendant 30 minutes. On peut voir que le nombre de gouttes données par ce mélange ne varie pas avec le temps.

La monobutyrinase du sérum saponifie les divers éthers des acides gras monobasiques (acétate, butyrate, etc., d'éthyle ou d'amyle) avec d'autant plus d'intensité que le poids moléculaire du radical acide est plus élevé. Ainsi le butyrate d’éthyle est saponifié au moins 10 fois plus vite que l’acétate d’éthyle.

Les lipodiastases que renferment en abondance certaines graines, particulièrement les graines de ricin, sont presque inactives en milieu neutre, mais elles agissent plus ou moins énergiquement en présence d’un acide (sol. à 2,5 p. 100 d'acide acétique par exemple).

d) Pepsine. — On dissout 0 gr. 10 de la pepsine à étudier dans 60 centimètres cubes, par exemple, d'acide chlorhydrique à 1 p. 100 et on ajoute 2 gr. 50 de fibrine desséchée à basse température (la meilleure fibrine est celle que l’on

obtient en desséchant dans le vide des caillots de sang de bœuf ou de cheval bien débarrassés de globules rouges par lavage prolongé dans l’eau courante).

Ce mélange est porté dans un bain-marie réglé à 500 et agité de temps en temps. La fibrine ne tarde pas à se gonfler et à se dissoudre. Le liquide donne avec intensité les diverses réactions de précipitation des albumoses ; la réaction du biuret devient de plus en plus intense.

Après 6 heures, on laisse refroidir, on filtre et on prélève 10 centimètres cubes du liquide : celui-ci refroidi à 15° sous un courant d’eau froide ne doit plus se troubler par addition de 10 à 20 gouttes d'acide azotique étendu. Les autres réactions des albumoses ont disparu ; celles des peptones persistent seules.

Hammarsten et Mandel ont fait observer que la fibrine crue se dissout assez facilement sous l'influence des acides seuls. C’est pourquoi ils recommandent d'employer, pour les titrages de pepsine, de la fibrine préalablement soumise à l’ébullition.

Préparation du suc gastrique de porc. — On prend un estomac de porc qu’on a préalablement bien nettoyé et rincé à grande eau. On le cloue sur une planchette par sa face péritonéale eton enlève la muqueuse avec un bistouri et une pince. On coupe cette muqueuse en menus morceaux et on la hache, puis on fait macérer la pulpe ainsi obtenue pendant 24 heures dans un litre d’eau additionné de 8 centimètres cubes d’acide chlorhydrique. On remue fréquemment le mélange. Le lendemain, on décante le liquide clair et on le filtre sur papier Chardin mouillé ou sur ouate hydrophile. Cette solution doit êtreutilisée immédiatement, elle ne se conserve pas.

Réactions du suc gastrique.

Violet de méthyle. — On mélange le suc avec un égal volume d’une solution aqueuse très diluée de violet de méthyle. Coloration bleue (acide minéral).

Phloro-glucine et vanilline. — On mélange le suc avec un égal volume d'une solution de 2 grammes de phloroglucine et 1 gramme de vanilline dans 100 centimètres cubes d’alcool] absolu. On évapore dans un verre de montre sur un bain-marie, sans aller jusqu’à l’ébullition. Il reste une tache rouge qui indique la présence d’un acide minéral.

Tropéoline 00. — On mélangeenviron 5 centimètres cubes de suc avec quelques gouttes de solution alcoolique à 1pour 100 de tropéoline 00, une coloration rose indique la présence d’un acide minéral.

e) Trypsine.—On fait digérer au bain-marie à la température de 509, un mélange de 2 gr. 50 de fibrine sèche avec 60 centimètres cubes de solution de carbonate de sodium à 1 pour 100 dans laquelle on a fait dissoudre 0 gr. 20 de la trypsine à essayer. On agite de temps en temps. La fibrine se dissout et leliquide donne les réactions des albumoses. Au bout de6heures, ces réactions ont disparu : le liquide ne se trouble plus par addition ménagée d’acide nitrique étendu et ne contient plus que des peptones. Si la digestion est continuée, on voit, peu à peu, la réaction du biuret diminuer d’intensité et le liquide refroidi laisse déposer des cristaux de tyrosine faciles à reconnaître au microscope (fines aiguilles blanches groupées en gerbes ou en rosaces).

Les trypsines pancréatiques contiennent toujours une plus ou moins grande proportion de diastase amylolytique dont on peu mesurer l’activité sur l’empois d’amidon (voir (A mylase).

On prépare du suc pancréatique avec un pancréas de porc, ou mieux, de bœuf, qu’on hache finement après l'avoir bien dépouillé de graisse et qu’on fait macérer pendant 24 à 48 heures dansune solution à 2 pour 100 de carbonate de sodium additionnée de quelques gouttes d’une solution alcoolique de thymol pour empêcher la putréfaction. On agite de temps en temps. On filtre à travers une bourre d’ouate hydrophile.

Le liquide ainsi préparéémulsionne très bienles graisses ; il les saponifie et les acidifie. Il peptonise la fibrine et l’albumine en solution alcaline ou neutre. Il hydrolyse l’amidon et le glycogène.

f) Papaine. — L'action de la papaïne croît à mesure qu'on élève la température jusque vers 900. — Dans deux tubes à essai on verse 2 centimètres cubes d’une solution de papaïne à 5 p. 100. L’un de ces tubes est porté à 100° pendant deux minutes.

On ajoute alors dans les deux tubes, 10 centimètres cubes

de sérum frais de cheval ; on mélange et on plonge dans l’eau d'un bain-marie qu’on chauffe jusqu’à ce qu'un thermomètre placé dans le tube contenant la papaïne non bouillie marque 98°. On retire alors les deux tubes. L’un est plein d’un liquide un peu trouble ; l’autre qui contenait la diastase bouillie est coagulé. Le liquide du premier tube, dont le sérum a été rapidement et complètement digéré, donne les réactions des albumoses.

g) Mesure de l'activité protéolytique des cultures de microbes ou des liquides de culture diastasifères. — 1) Méthode des tubes de Mett. — On sépare un blanc d'œuf frais dans un verre conique et on en remplit par aspiration une série de tubes bien calibrés propres étsstériles, longs de 15 à 20 centimètres et del: ou 2 millimètres de diamètre intérieur. On les scelle à une extrémité et on les plonge horizontalement dans de l'eau chauffée à la température de 950. L’albumine se coagule. On coupe ensuite les tubes en tronçons bien égaux de 5 centimètres cubes de longueur. Chacun de ces tronçons forme un test de digestion. Il suffit de l'introduire de telle sorte qu'il ne Ale que par une de ses extrémités dans le tube à essai contenant 5 centimètres cubes, par exemple, de la culture ou du liquide de culture diastasifère, et de porter celui-ci au bain-marie à 389-400 pendant un temps déterminé, soit 10 heures, On mesure alors avec une règle millimétrique la longueur du cylindre d’albumine coagulée qui a été dissoute et digérée à l’intérieur du tube. L'activité trypsique du liquide diastasifère peut être traduite par un chiffre qui représente le carré du nombre de millimètres du cylindre d’albumine dissous. Par exemple, si, dans un cas, 2 millimètres ont été dissous, et dans un autre 3 millimètres, l’activité trypsique des deux liquides est respectivement de #et de 9.

2) Méthode des tubes de gélatine thymolée. — Pour étudier l’action liquéfiante des liquides de culture diastasifères sur la gélatine, on prépare, selon la méthode de Fermi, une so-

lution de gélatine avec : Fauguisullée.,: Re EC PR RTE. 1litre.

CÉIALITE RMS PT PEN NP TE 70 gr:

Lbhymd nie rh le OP Li )22) gr.

On stérilise 1 heure à 1000 et on neutralise en ajoutant 10 centimètres cubes de solution décinormale de lessives de soude et de potasse enparties égales. On la répartit à chaud, après filtration sur papier Chardin, dans des tubes à essai à raison de 2 centimètres cubes pour chaque tube.On ajoute ensuite, suivant les circonstances, des doses variables de solutions faibles de carbonate de soude ou d’acide phosphorique pour alcaliniser ou acidifier légèrement le milieu s'il n'est pas indiqué de le laisser neutre au tournesol. Enfin on verse, dans chaque tube, le liquide diastasifère et on complète partout avec de l’eau distillée stérile, jusqu'au volume de 10 centimètres cubes. Les tubes sont maintenus (en même temps qu'un témoin sans diastase) dans un bain-marie à la température de 35-409 pendant 10 heures. Après quoi, on les plonge verticalement dans un courant ou un bain d’eau froide et on les y laisse immobiles jusqu’à ce que le tube témoin soit entièrement solidifié. On note alors les tubes dans lesquels la gélatine digérée (transformée en proto ou deutéro-gélatose) plus ou moins complètement, n’est plus coagulable par refroidissement. En partant d’une dose fixe de liquide diastasifère, on peut préciser, par exemple, le nombre d'heures nécessaires à la liquéfaction de 8 centimètres cubes de gélatine à 7 pour 100 par cette dose. Il faut toujours faire des tubes témoins avec la diastase détruite par quelques minutes d’ébullition.

Pour apprécier aussi exactement que possible l’activité protéolytique d’une culture microbienne, filtrée ou non, on peut aussi se servir de tubes calibrés de 2 millimètres de diamètre sur 20 centimètres de longueur gradués en millimètres sur 10 centimètres de leur longueur (pipettes graduées, par exemple, dont on a éliminé par un trait de couteau à verre, la pointe conique) et qu'on remplit aseptiquement de gélatine à 20 pour 100 légèrement colorée et neutralisée. On aspire pour cela, au moyen d’un tube en caoutchouc fixé à l’extrémité supérieure du petit tube et l'on ferme avec une pince lorsque la gélatine est montée à la hauteur voulue. Les petits tubes étant remplis et solidifiés, on les remet dans leurs éprouvettes ou on les transporte, suivant les besoins, dans des tubes contenant le liquide diastasique à étudier. La dissolution, de bas en haut,

de la gélatine indique, en millimètres, dans un temps donné, le pouvoir protéolytique.:

3) Méthode de la caséine. Pour étudier l'action coagulante ou trypsique des liquides diastasifères sur la caséine, on peut se servir soit de lait normal (dégraissé par centrifugation) additionné de 2 pour 1000 d’acide phénique, soit d'une solution à 2,5 ou 3 pour 100 de caséine dans l’eau de chaux qu'on ont à la PROCHES avec de l'acide chlorhydrique.

On opère, dans le premier cas, sur une série de tubes contenant chacun 5 centimètres cubes de lait auquel on ajoute les doses variables d'acide phosphorique ou de carbonate de soude dont on veut observer les effets empêchants ou favorisants, et une quantité fixe de liquide diastasifère, par exemple, puisla quantité d’eau phéniquée à 2 pour 1000 nécessaire pour amener le mélange au volume de 10 ou de 15 centimètres cubes. Après 12 heures d’étuve, à 35-40°, les tubes sont retirés et on apprécie alors par les chiffres 1,2, 3, le degré de solubilisation de la caséine en prenant comme 0 le tube témoin qui avait reçu le liquide diastasifère préalablement bouilli.

Lorsqu'on se sert de caséine, on voit se former au fond des tubes, sous l’action des diastases protéolytiques, un dépôt floconneux qui devient pulvérulent (nucléines) et que surmonte une couche de liquide de plus en plus transparent.

h) Extraction du ferment protéolytique des le-

vures, des microbes en général et des leucocytes. — Les levures, particulièrement les levures de boulangerie, produisent en assez grande abondance un ferment protéolytique qu'on peut obtenir de la manière suivante :

5 grammes de levure pressée sont triturés soigneusement dans un mortier avec 30 grammes de carbonate de chaux précipité, pur. On y ajoute 30 grammes de chloroforme. Les cellules delevure s’autolysent ainsi en quelques heures. On verse dans un vase bouché àl'émeri, qu'onlaisse pendant 3 à 4 jours à la température du laboratoire. On passe surun tampon d'ouate hydrophile dans un entonnoir. Le liquide recueilli est additionné de quelques gouttes de toluol et on le porte à l’étuve à 38° pendant 36 heures. On

filtre ensuite sur une petite bougie Chamberland à grand débit (marque L) ou sur un petit filtre Berkefeld en terre d’infusoires. On obtient ainsi une solution toute prête pour l'usage. Il faut l'utiliser le plus rapidement possible.

Beaucoup de microbes (staphylocoque, bac. pyocyanique, etc...) produisent également de grandes quantités de diastases protéolytiques vis-à-vis desquelles les sérums normaux exercent une action antiprotéolytique.

Les leucocytes renferment également une diastase protéolytique dont l’activité ne se manifeste invitro qu'après leur destruction par chauffage prolongé (18 à 24 heures) dans un bain-marie réglé à 50-520.

i) Mesure du pouvoir antiprotéolytique ou antitryptique des sérums normaux ou pathologiques. — Certains sérums pathologiques (pneumonie, néphrite, tuberculose, parfois fièvre typhoïde, etc...) principalement les sérums de malades cancéreux, ont un pouvoir antiprotéolytique beaucoup plus intense que celui du sérum normal.

La meilleure méthode pour mesurer le pouvoir antiprotéolytique de ces sérums est la suivante :

On prépare une série de boîtes de Pétri dans lesquelles on verse une quantité de sérum stérile (de bœuf, de cheval ou de mouton) suffisante pour former une couche de 4 à 5 millimètres d'épaisseur. On dispose ces boîtes bien horizontalement dans une étuve à coaguler, réglée à 720 et, lorsque le sérum est solidifié, on les porte à l’étuveà 379 en position renversée (le couvercle tourné en bas) afin d’en dessécher la surface. Après 24 à 48 heures, on peut les employer. |

Onfait, d'autre part, avec une bonne trypsine commerciale, une solution à 1 pour 100 dans l’eau salée physiologique à 8 grammes 5 pour 1000.

Dans une série de petits tubes à essais, on verse d’abord une même quantité de cette solution : 1 centimètre cube ; puis (sauf dans le 1°" tube qui servira de témoin) on verse, dans chaque tube, une quantité progressivement décroissante du sérum à expérimenter (lequel doit être fraîchement recueilli et non chauffé), soit 1 centimètre cube dans le 2e tube, 0 cc. 8, 0 cc. 5, 0 ce. 4, 0 cc. 2, 0 cc. 1 ou même des dilutions plus étendues, par exemple 0 cc. 08, 0 cc. 06, etc.,

d'une dilution de sérum à 1 pour 10 dans l’eau salée physiologique. On mélange soigneusement par agitation le contenu de chaque tube ; puis, avec une anse de platine (flambée à chaque nouvelle prise), on porte successivement sur divers points d’une même boîte de Pétri, à partir d’un endroit préalablement marqué, d’abord 1 goutte de la solution de trypsine pure (tube 1) etbien séparément les unes des autres, à 1 centimètre au moins d'intervalle, une goutte de chacun des mélanges trypsine sérum. On porte ensuite, pendant 24 heures. la boîte dans une petite étuve réglée à 520 et on lit les résultats qu'on apprécie d’après l'existence ou la nonexistence d’une cupule de sérum digéré sous les diverses gouttes.

Le sérum normal humain est généralement antitryptique à la dose de 1 pour 1, alors que les sérums de cancéreux sont souvent actifs à la dose de 1/8, quelquefois même de 1 /20 de centimètre cube pour 1 centimètre cube de solution

de trypsine.

j) Oxydases et peroxydiastases. — Les oxydases vraies fixent l'oxygène sur les corps oxydables. Telles sont la laccase des arbres à laque (Anacardiacées du Japon), celle d’autres végétaux (luzerne, champignons : Russule, lactaire), la {yrosinase du son de blé, des artichauts, des tubercules de dahlia, de certains champignons (Russule), et celle que l’on trouve en plus ou moins grande abondance dans les cellules leucocytaires, les cellules pigmentaires (particulièrement dans la mélanose, tumeurs mélaniques du cheval, etc.), le pus, la bile etcertains tissus glandulaires animaux.

Pour décelerleur présence, on peut se servir d’un simple tube à essai de 12 ou de 20 millimètres de diamètre sur 200 millimètres de longueur, dans lequel on introduit un autre tube plus petit de 5 millimètres de diamètre par exemple et court (de 50 millimètres de longueur). Dans ce plus petit tube, on met quelques gouttes du liquide à étudier. Dans le gros tube, on verse 50 centimètres cubes d’un réactif oxydable, par exemple une solution de gaïacol à 1 pour 100 dans l’eau distillée, ou une solution de tyrosine à 0,1 pour 100. On introduit avec précaution, en position inclinée à 459, le petit tube dans le grand, de telle sorte

que les liquides ne se mélangent pas. On fixe’alors, sur l’orifice du gros tube, un bon bouchon de caoutchouc percé d’un trou que traverse un tube en verre étranglé légèrementen un point, et relié, d’une part, à une trompe ou à une pompe à vide, d'autre part à un appareil producteur d’acide carbonique. On fait le vide, puis, interrompant la communication avec la trompe, on laisse rentrer dans le gros tube de l'acide carbonique. On fait de nouveau le vide et on renouvelle la rentrée d'acide carbonique deux ou trois fois pour chasser complètement l’oxygène. Finalement, sur le vide aussi parfait que possible on scelle le tube étranglé, entre le bouchon de caoutchouc et la trompe, et on retourne l’appareil, de manière à mélanger le contenu du petit tube à celui du gros tube. Il ne se produit aucune coloration même après plusieurs jours.

Lorsqu'on vient à briser la pointe effilée et qu’on laisse rentrer de l’air au contact duliquide, celui-ci se colore peu à peu s’il renferme une oxydase.

Les principaux réactifs révélateurs des oxydases sont :

19 La teinture de résine de gatac fraîchement préparée et conservée à l'abri de l’air pour éviter l'oxydation rapide de l'acide gaïacolique Bleuissement immédiat.

29 Le gaïacol en solution à 1 pour 100 dans l’eau distillée. Précipité de couleur jaune rougeûtre.

30 L’hydroquinone en solution à 1 pour 100 dans l’eau distillée. Transformation en quinone de couleur jaune brun et d’odeur caractéristique.

40 Le pyrogallol à 1 pour 60 dans l’eau distillée. Précipité rouge orangé, pouvant former des aiguilles (purpurogalline).

Les peroxydiastases ou oxydases indirectes n’agissent qu’en décomposantles peroxydes et en libérant de l'oxygène libre.

SANG. — C’est ainsi que l’hémoglobine du sang renferme une peroxydiastase qui libère une partie de l'oxygène de l'eau oxygénée, de telle sorte que son mélange avec celle-ci développe les réactions des oxydases.

On reconnaîtla présence detraces de sang dans un liquide en ajoutant, à 10 centimètres cubes de ce liquide, 1 centimètre cube de teinture de gaïac fraîche, puis 1 goutte d’eau neutralisée par l’eau de baryte. Il se développe une belle couleur bleu indigo caractéristique.

Lair. — On peut distinguer le lait cru du lait bouilli en ajoutant, par exemple, à 10 centimètres cubes de lait 0 ce 5 de teinture de gaïac etl goutte d’eau oxygénée neutralisée par l’eau de baryte. Le lait cru donne une coloration bleue ; le lait bouilli reste incolore. Mais le lait bouilli doit être refroidi car, à chaud, la réaction peutencorese produire comme dans le lait cru.

On peut remplacerla teinture de gaïac par 4à 5centimètres cubes de solution de gaïac à 1 pour 100 dans l’eau distillée. Lorsqu'on ajoute ensuite 1 goutte d’eau oxygénée neutralisée, le lait cru se colore en rose, le lait bouilli reste blanc.

Essai de Storch (peroxydase). — À 10 centimètres cubes de lait, on ajoute 2 gouttes d’eau oxygénée à 1 pour 100 et 2 gouttes de solution aqueuse fraîche, à 2 pour 100, de paraphénylènediamine. Le lait non chauffé ou chauffé à une température inférieure à 70° prend une coloration bleue. Le lait chauffé reste blanc.

Recherche des catalases du lait. — On introduit dans un uréomètre d’Yvon, 10 centimètres cubes de lait à examiner (bien mélanger au préalable) et 5 centimètres cubes d’eau oxygénée à 10 ou 12 volumes. On obture rapidement en fermantlerobinet. On agite vigoureusement et on attend 10 minutes. On rétablit, sur la cuve à mercure ou sur la cuve à eau, les niveaux de façon à mesurer le volume d’oxygène dégagé sous pression normale. Il faut opérer à une température voisine de 20 à 250.

k) Ferment glycolytique du sang. — Ce ferment transforme en acide lactique le sucre qui existe normalement dans le sang en quantités variables de 0 gr. 5 à 1 gr.5 par litre.

Cette transformation n’a plus lieu si, au sortir des vaisseaux, le sang est additionné de 2 pour 1000 de fluorure de sodium. Elle n’est, au contraire, pas gênée par l’oxalate de sodium à 1 pour 1000 qui rend également le sang incoagulable. Il faut donc se servir du fluorure de sodium si l’on veut doser le sucredu sang. Ce dosage s'effectue suivant la méthode indiquée par Gab. Bertrand et P. Thomas (Guide pour les manipulations de chimie biologique).