CHAPITRE NT TLDE
TECHNIQUE DE FIXATION ET DE COLORATION DU SANG ET DES PROTOZOAIRES SANGUICOLES
A. Méthodes de fixation des frottis de sang.
1° Par l'alcool absolu (la plus pratique, mais l'alcool doit être rigoureusement absolu) ; le conserver en petits flacons bouchés à l’émeri et contenant, dans un sachet de toile, quelques cristaux de sulfate de cuivre déshydraté (par calcination).
Temps : une demi-heure d'immersion (20 minutes au moins).
2° Par l'alcool-éther (parties égales) : 10 minutes. Bon pour l'emploi du Giemsa, mais inférieur au précédent.
3° Par l’alcool méthylique seul, 5 minutes (procédé recommandé).
40 Par l'alcool méthylique-acétone (parties égales) : 2 à o minutes.
59 Par le chloroforme : quelques secondes suffisent.
6° Par l'acide chromique (Malassez), solution à 1 p. 100 : 5 à 10 minutes, laver ensuite à l’eau distillée. Très bon fixateur.
7° Sublimé iodé (Dominici et Lenoble). On prépare le bain suivant :
Temture diode iraiche RER 10 ce.
Solution aqueuse saturée de sublimé. . . 90 «ec.
Il se forme un précipité. On filtre, et c’est dans le filtrat jaune clair qu’on plonge les lames pendant 25 secondes.
Laver à l’eau courante. Le mélange ne se garde pas au delà de quelques heures.
8° Par les vapeurs osmiques : 10 secondes.
9 Par le formol. Vapeurs ou immersion dans solution alcoolique de formol à 1 p. 100. Durée d'action : 1 minute.
109 Par le Flemming (Jolly). Le liquide de Flemming se
compose de :
Acide chromique à 1 p. 100. .. . . . . 15 vol. Acidelosmique à 2 p100 4 vol Acide acétique cristallisable. .. . . . . 1 vol.
10 minutes en plongée. Laver ensuite à l'eau courante. Très bon fixateur pour la coloration de la chromatine des noyaux.
11° Par la chaleur (pour la coloration au triacide d'Ehrhich).
B. Coloration du sang.
a) Méthode au triacide d'Ehrlich.
Le triacide d'Ehrlich est composé de deux colorants acides et d’un neutre (vert de méthyle). On peut se le procurer tout préparé chez Cogit, à Paris, ou le préparer soimême comme il a été dit au chapitre vu, E.
Durée d'action : 30 minutes sur lames fixées par la chaleur.
Résultats : hématies couleur brique.
Noyaux bleu pâle, peu visibles.
Granulations neutrophiles très nettes sous forme de poinüllés violets.
Granulations éosinophiles oranges.
Hématoblastes gris violet, à peine visibles.
b) Méthode de Dominici : Bleu de toluidine, éosine, orange.
Traiter d'abord par une solution en parties égales à 1 p. 100 d’éosine et d’orange pendant 2 à 5 minutes. Laver.
Faire agir une solution aqueuse à 1 p. 200 de bleu de toluidine pendant 2 à 5 minutes.
Sans laver, passer dans l'alcool à 60° rapidement, puis dans l’alcool à 900, puis dans l'alcool absolu. Sécher et examiner.
Cette coloration met en évidence : noyaux, protoplasma et granulations.
Hématies apparaissent roses ou oranges.
Noyaux bleus.
Granulations éosinophiles roses ou orangées.
Granulations neutrophiles violet rose.
Hématoblastes bleu pâle.
c) Méthode de Romanowsky.
Fixation à la chaleur à 105-110°. Coloration 1 ou 2 heures dans :
Sol. aqueuse saturée de bleu de méthylène. 2 parties Solution aqueuse d'éosine à 1 p. 100. . . 5 parties
Ne se conserve pas. Laver à l’eau courante, sécher. d) Méthode de Laveran au bleu Borrel.
On prépare séparément :
Une solution aqueuse d’éosine à 1 p. 1.000.
Une solution aqueuse de tanin à 5 p. 100
Pour colorer, on mélange au moment de s’en servir, en filtrant les deux premières sur un petit entonnoir :
Solution aqueuse d'éosine à 1 p. 1.000. . 4 cc. BlensBorrohe et se D NTIC at rec:
ÉAuidistllée Me RE L'ART 0e 6 ce
On place la lame dans le bain en position verticale pour éliminer le précipité qui se forme. Colorer 20minutes ; laver à grande eau. Faire agir la solution de tanin 1 minute. Laver à l’eau distillée, sécher.
Laveran emploie aussi l’azur II de Grübler au lieu du Bleu Borrel. Solution aqueuse saturée d’azur IT, 1 centimètre cube (filtrer au moment de s’en servir), verser dans :
Solution aqueuse d’éosine à 1 p. 1.000 Ut LEO PE PRE PAPA TRE ET 21cc- EAU GISI RER PRO AN 0 otcc:
Colorer 10 minutes, laver, passer au tanin, laver, sécher.
e) Méthode de Giemsa.
Fixer par l'alcool absolu 30 minutes.
Au sortir de l'alcool, les lames étant encore un peu humides, les plonger dans le bain colorant, inclinées, de telle sorte que les précipités ne se déposent pas sur la préparation :
Solution de Giemsa (1).. 1 partie Eau ordinaire (préalablement ‘additionnée
de 2 gouttes d'un mélange à parties égales
d'alcool PAU et de Lens ine pure
par cent. cube. . ls 9 parties
1. La solution de Giemsa, marque RAL concentrée et glycérinée, se conserve pendant très longtemps. On peut se la procurer toute préparée à Paris, chez Poulenc.
Colorer 20 à 30 minutes, laver à grande eau ‘et sécher. Éclaircir s’il y a lieu par lavage rapide de quelques secondes à une minute dans une solution à 1 p. 100 d'acide borique suivie de lavage à l’eau.
r . . . °, A . ) Le
La dilution du Giemsa doit être faite au moment de l'usage, car elle perd très vite sa puissance colorante. Pour l'étude des filaires il faut employer une dilution faible, à 1 p. 40.
f) Méthode de R. Ross et Ruge. (Pour la recherche des hématozoaires et des embryons de filaires.)
Au lieu d’étaler le sang en couche mince, on en dépose une grosse goutte au milieu d’une lame et on laisse sécher à l’étuve pendant environ deux heures, à l'abri des mouches. Lorsqu'elle est sèche, on la traite pendant 5 à 10’ par un mélange de :
Formols 20 Re EC RSR 2 cc.
Acide acétique OP EE RE RE 1e Eau SU E NN ERNRENRRR ARRENR ec
Ce mélange fixe le sang et dissouten même temps l’hémoglobine.
On lave à l’eau.
On colore ensuite par le Giemsa (1/2 heure à 1 heure) ou par la méthode de Laveran à l’éosine-bleu Borrel, ou encore par l’'hématoxyline (filaires).
Lorsque les hématozoaires sont rares danse sang, cette technique permet de les découvrir avec plus de facilité.
g) Coloration vitale du sang. Méthode de Pappenheim.
Sur un porte-objet on dépose, avec l'extrémité d’une pipette, une gouttelette de solution alcoolique à 1 p. 100 de l’un des colorants ci-après :
Brillant Crésylbleu (Grübler) ou Azur II, ou Soudan.
On laisse sécher, puis, immédiatement à côté, on dépose une gouttelette de sang frais qu'on recouvre d’une lamelle. Le sang s'étale sous celle-ci jusqu’à atteindre de dépôt sec de matière colorante, qu’il dissout de proche en proche. On peut aussi se servir d'une solution de violet de méthyle dans l’eau salée physiologique à 8,5 p. 1.000 et dont on mélange une gouttelette à une goutte de sang frais, directement sur lame.
C. Coloration des protozoaires et parasites inclus dans des cellules.
a) Fixation au Bouin :
Solution aqueuse saturée d'acide picrique. 75 cc. HONOR ES Re RS C0 ANT ERES 20 cc.
Acide acétique!glacials . . .. LL...” 5 cc.
Pour les frottis, amibes, etc., 30 minutes d'immersion ; laver à l'eau 5 minutes.
b) Coloration.
Mordançage des frottis (amibes, protozoaires) pendant 15 minutes dans une solution d'alun de fer ammoniacal à 3 p.100.
Poser la lamelle sur lame recouverte de la solution et maintenir celle-ci sur platine chauffante à 40° au plus pendant 15 minutes.
Passer à l'eau. Colorer pendant 15 minutes en chauffant encore à 40e avec la solution d’hématoxyline à 5 p. 100. Les préparations deviennent noires. Décolorer très progressivement à froid, sous le microscope, avec une solution d’alun de fer à 1 p. 100. Laver à l’eau. Monter. À aucun moment ne laisser la préparation se dessécher.
c) Coloration des coupes d'intestin pour la recherche des amibes ou infusoires.
Colorer les coupes par la technique ci-dessus à l'hématoxyline au fer. Après décoloration et lavage à l’eau, colorer 1/4 d'heure dans solution éosine-vert-lumière. La préparation est rouge. Différencier à l'alcool absolu acétique à 10 p. 100 jusqu'à l'apparition des teintes vertes du tissu conjonctifet du mucus. Les muscles et les épithéliums demeurent roses. Substituer directement le xylol à l'alcool absolu acétique et monter au baume.
D. Coloration des coupes de tumaurs cancéreuses.
a) Méthode de Borrel (modifiée par Coca) sur coupes de 9 microns d'épaisseur, provenant de fragments fixés au Zenker, voir chap. 1x et enrobés en paraffine.
Immersion pendant 10 minutes dans une solution alcoolique d’iode à 1 p. 100.
Lavage rapide avec alcool à 90° pour enlever l'excès d'iode. |
Lavage à l’eau.
Immersion pendant une heure dans une solution aqueuse saturée de Magenta.
Lavage à l'eau.
Immersion pendant 5 minutes dans la solution suivante :
Indigo carmin (ou sulfo-indigotate de
soude). . AE Te JA PER D 0 gr. 75 Ehu:disullée ur Ni ME e MER)
Filtrer et ajouter :
Eau distillée saturée d'acide picrique . . 100 cc.
Différencier par lavage à l'alcool à 95° (avec le flacon compte-gouttes) sans lavage préalable à l'eau.
b) Méthode à l’éosine bleu.
Immersion pendant 10 minutes dans la solution alcoolique d’iode à 1 p. 100.
Lavage rapide à l'alcool à 95° pour éliminer l'iode.
Lavage à l'eau.
Immersion pendant 45 minutes à à température de 55° dans une solution aqueuse d’éosine à 5 p. 100.
Lavage à l’eau.
Immersion pendant 20 minutes dans la solution suivante, diluée àraison de 5 p. 100 dans l’eau distillée :
Carbonate de potasse. . WLESSR Iner, Bleu de méthylène ina MERE ar.
Eat en re Ce Re MELUN
Différencier par l'alcool à 95°.
E. Fixation et coloration des frottis de tumeurs : Épithélioses, Clavelée, Vaccine, etc. (d'après Borrel).
Etaler le frottis en couche mince sur lame et, avant toute dessiccation, passer rapidement celle-ci dans une solution de tanin à 5 p. 100 qui produit instantanément l'adhérence de la pellicule.
On verse ensuite le fixateur sur la lame (fixateur acétoosmochromique de préférence) (voir chap. 1x, À, e.)
Il se produit un léger précipité de tannate d’osmium que l’on entraine par un excès de fixateur.
Fixer environ 1 heure.
Laver à l’eau.
Colorer par la méthode Rouge Magenta-picro-indigocarmin, indiquée ci-dessus en D.
