ISOLEMENT ET PURIFICATION DES MICROBES
C. Isolement par divers moyens. — Chauffage à 909, 100°. Seuls les microbes sporulés résistent.
Inoculation à un animal sensible (Exemple : souris pour le pneumocoque, cobaye pour le bacille tuberculeux).
D. Isolement des anaérobies (voir chapitre xL). — Le procédé le plus employé, à cause de sa simplicité, est celui de Veillon. Il faut se servir de tubes à essai de grande taille : 22 centimètres de long sur 15 millimètres de diamètre. Ils sont remplis, sur une hauteur de 10 centimètres environ, avec une gélose transparente, à 1 ou 2 p. 100, à laquelle on ajoute 1, 5 p. 100 de glucose, On fait fondre une dizaine de tubes en les plaçant dans de l’eau qu’on porte à l’ébullition pendant 10 minutes (de façon à bien chasser l’air). Ils sont ensuite refroidis au bain-marie à 40e.
À l'aide d'une pipette stérilisée, verser une goutte de semence dans un premier tube ; après avoir agité, prélever avec une nouvelle pipette une goutte de gélose ensemencée qu'on porte dans un second tube, et ainsi de suite jusqu’à la fin de la série.
On peut aussi, avec un fil de platine, ou avec une pipette effilée, non ouverte, toucher la semence et les laver successivement dans les tubes sans les recharger.
Lorsque l’ensemencement est terminé, les tubes sont plongés dans l’eau froide, puis portés à l’étuve à 37°.
Les tubes de culture sont examinés tous les jours pendant un temps prolongé, certains anaérobies ne poussant qu'au bout de 8 à 10 jours.
Les colonies d’anaérobies s'arrêtent à 1 centimètre de la surface, car la partie supérieure de la gélose a dissous de l'air pendant le refroidissement.
Si le pus ensemencé contient des anaérobies facultatifs ou des aérobies stricts, on peut trouver des colonies dans la zone aérée.
On prélève les colonies au moyen d’une pipette eflilée et stérilisée qui joue le rôle d’emporte-pièce. Pour les repiquer, il suffit de souffler la colonie qui a été ainsi emportée dans un tube de gélose glucosée. Le prélèvement est facilité en adaptant, à la partie supérieure de la pipette, un tube de caoutchouc souple de 0 m. 40 de longueur, dont l'extrémité libre, munie d’un embout, est reçue dans la bouche.
Lorsque le produit à ensemencer contient des formes sporulées, on peut, comme pour les aérobies, les séparer au moyen de la chaleur.
L'inoculation aux animaux sensibles (cobayes) s'emploie spécialement pour l'isolement du bacille tétanique.
E. Purification des colonies isolées. — Il est rare qu'à la première séparation une colonie isolée soit pure. Les microbes d’impureté sont généralement masqués par le développement rapide du microbe principal. Dans les repiquages ultérieurs, quand les tubes sont conservés un certain temps, ces microbes peuvent prendre le dessus.
Il est donc prudent de faire, à deux ou trois reprises. de nouvelles séparations par épuisement sur tubes de gélose inclinée, ou par dilution et ensemencement sur plaques de gélose.
Pour les anaérobies, faire une nouvelle séparation en tubes de gélose glucosée, comme il a été indiqué.
F. Conservation des souches microbiennes. — Conservation des cultures vivantes.
Les cultures de microbes conservent généralement assez longtemps leur vitalité et leur virulence lorsqu'on les maintient à l'obscurité, à basse température et en tubes scellés, à l'abri de l'air. Toutefois les conditions de conservation sont très variables suivant les espèces. Certaines cultures en milieux liquides doivent être maintenues en tubes eflilés et scellés à une température inférieure à 0°, ou mieux à 7°,et continue, obtenue par exemple au moyen de la machine Audiffren-Singrün, très commode pour les laboratoires qui disposent de force électrique. D’autres s’accommodent mieux de repiquages plus ou moins fréquents par simple piqûre dans des tubes droits de gélose peptone ou de gélose glucosée ; d’autres encore ne se conservent bien que dans le sang ou dans les liquides albumineux additionnés « ou non de carbonate de chaux stérile.
La formule suivante a été PR ne
Sérum formolé.
Ajouter à 500 centimètres cubes de sérum de cheval un centimètre cube de formol du commerce, mélanger. Après quelques instants de contact, ajouter un centimètre cube
