III. Stérilisation par filtration sur bougies poreuses
Les bougies filtrantes qui sont employées pour la stérilisation des eaux destinées à l’alimentation servent, dans les laboratoires de bactériologie, à séparer, des corps microbiens, les toxines produites par [a culture des microbes en milieu liquide (toxine diphtérique, toxine tétanique) ou à stériliser les milieux de culture qui pourraient être altérés par la chaleur.
Les bougies Chamberland sont de deux types : 1° les grosses bougies marquées F ou B. Ces dernières sont moins perméables que les précédentes. La marque F sert à filtrer les cultures microbiennes pour en séparer les toxines ; 20 les bougies de laboratoire sans embase, numérotées L;, L; bis, L:, Ls, La L:,etc... L; correspond, comme porosité, à la grande bougie F ; L; égale celle de B. Les bougies marquées L; et L,; sont les plus perméables. On peut s'en servir pour la filtration des solutions diastasifères telles que les liquides de macération de cultures d’Aspergillus niger. Toutefois, il faut s4voir que beaucoup de diastases sont partiellement retenues par la porcelaine poreuse, süurtout lorsqu'elles sont en solutions acides. Il faut done toujours neutraliser les Hquides avant la filtration.
Les bougies, de L,; à L;, sont traversées par les microbes dits virus filtrants.
La filtration peut sopérer par pression Où par aspiration. Dans le premier cas, on se sert de la bougie Chamberland B ; dans le second de la bougie F.
D’autres filtres que les bougies Chamberland peuvent être utilisés, telles les bougies en terre d’infusoires (bougies Berkefeld) et les bougies d'amiante qui sont très perméables, mais, offrent moins de sécurité parce qu'elles présentent plus souvent des fissures.
Avant leur emploi, les bougies seront éprouvées avec soin. Les immerger dans une éprouvette remplie d'eau et y insuffler de l'air au moyen d'une poire en caoutchouc. Si
STÉRILISATION, =NRILTRATION Li
des bulles d'air, partant d'un même point, s’échappent dans l'eau, la bougie est fissurée et doit être rejetée.
Dans la filtration. l'emploi des tests microbiens permettra de déceler la même cause d'erreur. On emploie généralement comme test le microbe du Choléra des poules qui est très petit et rapidement cultivable.
La filtration ne doit pas être de trop longue durée et la pression atteinte doit toujours être notée.
Nettoyage, régénération et stérilisation des bougies Chamberlarnd.
La calcination des bougies doit être évitée, car elle provoque la formation de sédiments adhérents, qui colorent les bougies, les fendillent et diminuent leur porosité,
Il faut, après usage, les tremper dans un récipient en verre rempli d'eau chaude additionnée de 1 à 2 p. 100 de chlorure de chaux en poudre.
Ce bain a pour effet de gonfler et de ramollir le dépôt superficiel. On passe ensuite les bougies sous un filet d'eau en les brossant avec une brosse en crin, puis on les plonge dans un bain d’eau froide contenant 1.000 à 1.500 grammes de chlorure de chaux pour 10 litres d’eau. On les laisse ainsi immergées pendant 30 minutes. Le chlore détruit les matières organiques à l'intérieur des pores.
Ensuite on rince de nouveau sous le robinet et on plonge les bougies dans un autre bain d’eau froide contenant 1.000 à 1.500 grammes d'acide chlorhydrique dans 10 litres d’eau. On les y laisse pendant 30 minutes. Les sédiments extérieurs et le calcaire sont ainsi solubilisés.
Il ne reste plus qu’à rincer une dernière fois fortement sous le robinet et à laisser tremper les bougies dans de l’eau distillée qu'on change plusieurs fois jusqu'à ce qu'elle ne fournisse plus aucune réaction acide au tournesol.
Si les bougies sont colorées, on peut les plonger dans un bain concentré de bisulfite de soude avant le dernier lavage. Lorsqu’elles sont bien propres, on les laisse sécher à l'air et on les conserve dans de larges flacons bouchés à l’'émeri ou au liège.
On stérilise les bougies en les plaçant une à une dans un
MICROBIOLOGIE 2
gros tube à essai au fond duquel on a versé quelques gouttes d'eau et qu'on bouche à l’ouate. On les porte alors à l’autoclave et on chauffe à 115° pendant 20 minutes. Les bougies stériles peuvent ensuite rester dans le tube qui les renferme, jusqu'au moment où l’on doit les employer.
CGHAPLPFER EESTI
ISOLEMENT ET PURIFICATION DES MICROBES — CONSERVATION DES SOUCHES MICROBIENNES
A. Isolement à l’aide de milieux solides. — Séparation par dilution et ensemencement en plaques de gélatine ou de gélose.— Lorsqu'on se propose d’isoler les germes d’une culture en milieu liquide, d’abondance moyenne, ou d'un pus assez riche en microbes, on prélève une anse d'environ un millimètre de diamètre de ces produits et on la dilue dans 10 centimètres cubes d’eau physiologique. Après agitation, une goutte de cette dilution est portée, à l’aide d’une pipette Pasteur, dans un tube de gélatine fondue. Bien mélanger en inclinant, puis en redressant brusquement le tube et en le tournant entre les deux mains. Faire un prélèvement dans ce premier tube de gélatine avec une nouvelle pipette et porter trois gouttes dans un second tube. Après brassage, prendre avec une autre pipette quelques gouttes dans ce dernier tube et en déposer six dans un troisième tube de gélatine.
Chacun des tubes de gélatine est alors coulé dans une boîte de Pétri stérile. Pour cela, enlever le coton du tube à essai, et flamber rapidement l’orifice, soulever le couvercle de la boîte et y verser la gélatine en ayant soin de la répartir sur toute la surface. Poser ensuite les boîtes horizontalement sur une table froide, puis, quand la gélatine a fait prise, les porter à l’étuve à 22°. |
Au lieu de gélatine, on peut se servir de gélose. Il est alors nécessaire de maintenir les tubes qui contiennent la gélose fondue à une température de 40°, pour éviter qu'elle fasse prise avant la coulée dans les boîtes de Petri. Cellesci seront placées à l’étuve à 37° après avoir été retournées, afin que l’eau de condensation ne souille les cultures.
Lorsqu'on veut procéder à la séparation de microbes qui
ont poussé sur milieu solide, il faut émulsionner la culture dans de l’eau stérilisée, puis on procède comme nous venons de l'indiquer.
Séparation par épuisement sur milieux solides (gélose, sérum).
Procédé de Roux et Yersin. — La semence est étalée à la surface de 3 ou 4 tubes de gélose inclinée ou de sérum. à l'aide d’un fil de platine ou d’une spatule, sans les recharger. Eviter de toucher l’eau de condensation. La semence s'épuise peu à peu et, dans les derniers tubes ensemencés, le nombre des colonies est peu élevé. Cette méthode est très pratique dans le cas où la semence n’est pas très riche en germes ou lorsqu'on se sert d’un milieu électif, commele sérum pour le bacille diphtérique. |
Au lieu de tubes de gélose ou de sérum inclinés, la séparation par épuisement peut être faite en tubes à faces plates de Legroux ou en boîtes de Roux remplis des mêmes milieux préalablement coagulés. Dans ce cas, l’ensemencement doit être fait avec une pipette coudée qu'on essuiera sur le milieu sur toute sa longueur, ou avec un petit rouleau qui sera préparé de la façon suivante :
On plie par le milieu, à angle aigu, un fil d'aluminium, de fer ou de cuivre, de 10 à 15 centimètres de long et de 2 millimètres de diamètre environ ; ou fait ensuite un coude à 10 ou 15 millimètres de chacune des extrémités et on introduit un tube de verre de 2 centimètres de long sur 5 millimètres de diamètre (tubes dont on fait les pipettes Pasteur) à extrémités mousses, entre les branches phées. Le tube roule doucement sur la surface de la gélatine sans l'égratigner.
Procédé de Veillon. — Epuiser successivement la semence dans l’eau de condensation de plusieurs tubes de gélose ou de sérum. Incliner ensuite ces tubes pour que l’eau de condensation vienne les ensemencer.
B. Isolement par ensemencement sur milieux électifs. — Exemple : Ensemencement sur sérum coagulé pour le bacille diphtérique, sur milieu de Dieudonné pour le vibrion cholérique.
