CHAPITRE XIA

A. — Analyse microbiologique de l'air.

Les deux procédés de choix pour l'analyse bactériologique de l'air sont la méthode de Miquel; basée sur l'emploi des bourres solubles, etla méthode de Laveran, basée sur l'emploi du barbotage.

Méthode des bourres solubles de Miquel.

Miquel utilise comme bourre le sulfate de soude desséché. Ce sel est chauffé à 200. I] se dissout d’abord dans son eau de condensation, puis se solidifie à nouveau et se dessèche. Le sulfate desséché est pilé grossièrement au mortier et tamisé.

On étrangle un tube de verre ouvert aux deux extrémités ; on tasse sur l’étranglement un tampon de coton et on verse au-dessus 1 ou 2 grammes de sulfate, préparé comme il vient d’être dit. Boucher aux deux bouts avec du coton et stériliser à sec.

Pour se servir de l'appareil ainsi préparé, on place le tube verticalement, en ayant soin que le sable soit en haut. On débouche l'extrémité inférieure et on la relie à un aspirateur. On ôte le bouchon de coton qui obture l'extrémité supérieure et on met en marche l'aspirateur. On fait passer un certain nombre de litres d’air, 10 litres habituellement. Lorsque l’opération est terminée, on verse la bourre soluble dans 10 centimètres cubes d’eau stérile et on 1 fait des plaques de gélatine ou de gélose.

Cette méthode est la seule pratique lorsque l'analyse bactériologique ne peut pas être faite sur place.

Méthode de Laveran basée sur l’emploi du barbotage.

L'appareil de Laveran est formé de deux tubes à essai de

grande dimension, verticaux, réunis au niveau de leur tiers supérieur par une branche horizontale. Ils sont obturés par un bouchon de caoutchouc portant une pipette qui plonge au fond. L'un des tubes porte un trait de jauge à 10 centimètres cubes. On y verse 10 centimètres cubes d’eau. Dans l’autre tube, la pipette est graduée en dixièmes de centimètres cubes. On garnit d’ouate les extrémités supérieures des pipettes et on stérilise l'appareil à l’autoclave.

Pour s’en servir, on débouche la pipette graduée et on la relie à un aspirateur. On enlève le coton de l’autre pipette et on fait fonctionner l'aspirateur. L'air passe par la pipette non graduée, barbote dans l’eau et s'échappe par la pipette graduée. Quand 10 litres d'air ont traversé l'appareil, on arrête l'aspirateur, on rince avec l’eau la pipette par laquelle l'air est arrivé et le tube correspondant, puis par la branche horizontale on la fait passer dans le tube qui contient la pipette graduée. Avec cette dernière, on aspire l’eau et on la répartit dans les milieux de culture.

Le nombre de germes est rapporté au mètre cube. Connaissant le volume d’air quia passé dans l’appareil, la quan: tité d’eau ensemencée et le nombre de colonies obtenues sur les plaques, il est facile d'en déduire le nombre de germes par mètre cube d'air.

B. — Analyse bactériologique du sol.

Pour les prélèvements faits à la surface du sol, recueillir l'échantillon de terre avec une cuiller ou une spatule stérilisées.

Pour les prélèvements à faire en profondeur, se servir d'une sonde à cuiller, pourvue d’une fermeture automatique, telle que la sonde de Fraenkel.

Quand l'échantillon de terre aura été recueilli, le broyer finement dans un mortier stérile et le diluer dans une grande quantité d’eau stérile. Agiter fortement et, avec cette émulsion, faire des plaques de gélatine ou de gélose.

Connaissant le poids de terre .diluée dans un volume d’eau déterminé, la numération se fait comme pour une analyse d’eau.

G. — Milieux de culture pour les ferments du sol.

FERMENTS NITREUX, NITRIQUES, DÉNITRIFICATEURS ET FIXATEURS DE L'AZOTE ATMOSPHÉRIQUE

a) Milieux d'Oméliansky pour la culture des ferments nitreux

Eau: distillée LPS MORE ENT Ent e 000 ec:

Sulfate d’ammoniaque. . . . . . . 2 gr.

Chlorure'de sodium PE RER 2 gr.

Phosphate de potasse. . . . . . . 1Sgr:

Sulfate de :magnesie PRE RENE 0 gr. 50 Sulfate ferreux EN RE NE 0 gr. 40

On met 50 centimètres cubes de ce liquide dans un vase d'Erlenmeyer de 250 centimètres cubes, à moitié rempli de scories concassées (Boullanger et L. Massol). On ajoute 0 gr. 5 de carbonate de magnésie sous forme d’un lait stérile et on ensemence avec un peu de délayure de terre de jardin. On fait des passages successifs très nombreux et on élimine ainsi les microbes étrangers. On isole finalement sur plaques de silice gélatineuse.

Pour préparer celle-ci, verser lentement dans 125 centimètres cubes d'acide chlorhydrique à 13° Baumé,un volume égal d’une solution à 8° Baumé de silicate de potasse bien pur. On verse sur un dialyseur en parchemin animal, bien débarrassé de chaux par lavages à l'acide chlorhydrique étendu, puis à l'eau distillée. La dialyse doit se faire dans un courant très lent d’eau distillée, jusqu’à ce que le liquide ne donne plus qu'une réaction imperceptible à l’azotate d’argent.

Après 48 heures de dialyse, on prélève toutes les 3 ou 4 heures un petit échantillon qu'on chauffe à 120° jusqu'à ce qu'on n'observe plus de coagulation. On arrête alors la dialyse, on stérilise à 1200, on répartit en tubes stériles par fractions de 10 centimètres cubes et on ajoute à chaque tube :

Sulfate d’ammoniaque à 4 p. 100. . 0 cc. 5

puis, 0 cc. 5 de : -

Chlorure de sodium. . . 4 gr.

Soi d Phosphate de potassium. 2 gr.

Rue / Sulfate de magnésie. . . IFgr:

MEausdustullée MERE 100 cc.

puis encore :

0 cc. 5 d’une solution de sulfate ferreux à 0,8 p. 100

et enfin :

Lait de carbonate de magnésie à 10 p. 100,1 cc. (très léger et bien tamisé).

On coule en boîtes de Petri aprés avoir ensemencé chaque tube avec une gouttelette de ferment nitreux purifié comme il a été dit ci-dessus. La silice faitprise en quinze à quarante-cinq minutes. On maintient les boîtes, dans une cloche humide pour éviter la dessiccation de la silice, à la température de 300 et on voit apparaître, au bout de 8 à 10 jours, de petites colonies réfringentes qu'on repique avec un fil de verre stérile pour les ensemencer dans le milieu d'Oméliansky. Le bouillon de viande ensementé avec ces colonies doit rester stérile, les ferments nitreux ne s’y développent pas.

Dans le milieu d'Oméliansky, les cultures pures donnent la réaction des nitrites (Tromsdorff, voir chap. xvur, 3°) du 3e au 5° jour.

b) Milieu de Winogradsky pour la culture du ferment nitrique.

(Nitrobactérie.) Isoler d’abord par le milieu d'Oméliansky ci-dessus, en remplaçant le sulfate d’ammoniaque par du nitrite de soude, tous les autres sels restant les mêmes ; puis par la silice gélatineuse, dans laquelle on remplace également la solution à 4 p. 100 de sulfate d’ammoniaque par une solution à 4 p. 100 de nitrite de soude. Les colonies sont ensuite ensemencées dans l’un des milieux suivants :

/ Nitrite de potasse . NT Sulfate de magnésie. OEST25 Phosphate de potasse. O-gr. 5 Milieu Carbonate de soude calciné. (Er liquide, Chlorure de sodium. 0 gr. 5 DUlfAte der er EN NP RERRR 0 gr. 4 MEautdistiliée mc ne en. 000 Tree.

Nitrite de soude. . . . . . 2 gr.

Carbonate de soude... . . . LEE Milieu Sulfate de magnésie . . . . traces solide. Phosphate de Ro Ads traces | (eélose nn na PSC 15 gr.

Eau du robinet . , . . . 1.000 cc.

MICROBIOLOGIE 14

Ensemencer d’abord des scories stérilisées (en vase d'Erlenmeyer) et mouillées de liquide d'Oméliansky avec un peu d’eau de délayure de terre ou, mieux, avec le produit de lavage d’un fragmentde scorie de la surface d'unlit bactérien. On opère ensuite, comme pour les ferments nitreux, l'isolement sur plaques de silice gélatineuse.

Les colonies ne se développent qu'après 2 semaines, sous forme de petits corps ronds ou ovales, brillants, brunâtres à l’air. On peut augmenter leur grosseur en déposant à leur voisinage une goutte de solution à 2 p. 100 de nitrite de soude. Les repiquer et les réensemencer en tubes ou en matras en milieu liquide ou solide.

c) Milieux de culture pour les ferments dénitrificateurs.

EAU ME RE Le O0DECC:

Nitrate de potasse. SFA E TIQUE 10 gr.

Acide citrique. PARTS IR GTE

Asparagine. 5 gr.

Liquide Phosphate de potasse 5 gr.

de { Sulfate de magnésie. 5igre Gayon. Chlorure de calcium 0 gr. 5 Sulfate d'alumine. 0 gr. 02 Silicate de soude. . 0 gr. 02 Sulfate de fer. OYsr200

| Ammoniaque q.s. pour ‘faible réaction alcaline.

Répartir en couche épaisse dans des tubes ou des matras et recouvrir le liquide d’une mince couche d'huile de vaseline. Ensemencer avec un peu de fumier de cheval et porter à 35°. La culture se dénonce par un dégagement gazeux abondant. On fait une <érie de passages Fans ce sation liquide et on isole ensuite sur le même milieu, gélosé à 15 p. 100, en anaérobiose.

d) Milieux de culture pour les microbes fixateurs de l'azote

atmosphérique, Milieu Eau. CP Rue rl; 006:

de Bredemann Asparagine. Arts D ÉATN 10 gr.

pour Closiridium | Saccharose OP E 20 gr.

et Ammnlobacter A: Glucose” US 16 gr.

Filtrer après dissolution et ajouter :

Phosphate de potasse. . . . 1 gr.

Chlorure de calcium. . , . d'sru Sulfate de magnésium. . . . 0 gr. 3 Chlorure de sodium. . . . 0 gr. 1 Pérchlorure de’fer, 70e CPgr.-01

Neutraliser par carbonate de soude.

Milieu Favtidishilées 2e NS 100 ce.

de Beyerinck ÿ Mannite. . RE Den sé 2Hor.

pour Phosphate monopotassique. 0 gr. 02 Azotobacter CÉIDS ER RO LE 1 gr. 5

Ensemencer avec terre de jardin.

Milieu de Zikes Phosphate tripotassique. . . ONsr.025 pour les algues | Sulfate dé "magnésie nn 0 gr. 37 fixatrices * Chlorure de sodium. . . . 0 gr. 20

de l’azote, type Traces de sulfate de calcium et chlorella vulgaris \ de phosphate de fer. . . . 0 gr. 20

Dans des vases d'Erlenmeyer contenant une mince couche de sable siliceux, on imprègne ce dernier du liquide. On ajoute, suivant les conditions de l'expérience, un peu de sucre avec ou sans nitrates.

e) Milieux pour la culture des microbes des nodosités des Légumineuses.

Milieu de Beyerinck (modifié par Mazé).

Infusion de haricots blancs (sans? aller jusqu'à la cuisson complète). . . . . 100 gr. p. 1.000 cc.

Filtrer, ajouter :

Gliorurerdefsodium CPR Tr 10 gr.

Bicarbonate de soude . . Re TS ÈS traces Saccharose . . ES LE Re Ee v à 20 gr.

GÉlOSe LL ER CR NM RL Tee 15 gr.

Répartir en couche mince dans des vases d'Erlenmeyer. Ensemencer avec l’intérieur d’une nodosité. On obtient de petites colonies ressemblant à une goutte de stéarine.

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