C. Analyse microbiologique

Elle doit avoir pour objet la numération et la spécification des germes microbiens contenus dans les eaux. C’est elle qui fournit les renseignements les plus utiles sur la valeur hygiénique d’une eau supposée potable, au moment où elle a été recueillie.

Mais, pour que les résultats obtenus soient comparables, il est nécessaire d'employer des méthodes toujours iden-

tiques. Celles indiquées par l'instruction du service de santé militaire du 13 janvier 1909 paraissent encore actuellement les plus recommandables.

Pour la numération des microbes, elles prescrivent l’emploi d’un milieu simple, facile à préparer : la gélatine peptone à l’eau, sans bouillon, composée comme suit :

Gélatine extra (Poulenc frères). 100 gr. en France (180 gr. dans les pays chauds) Peptone sèche (Poulenc frères). 20 gr.

NAGER RS sr 5 gr.

AU Uri Ra ae + RIT DOUPCE,

Neutraliser, puis alcaliniser très faiblement, répartir en tubes par 10 centimètres cubes et stériliser.

On peut également employer un milieu à l’eau de levure autolysée (P. Diénert et A. Guillerd) qui fournit, pour les numérations totales des germes, des résultats «JR ARnLE à ceux que donne la gélatine peptonée.

Un kilo de levure de distillerie pressée est mis à sec dans un cristallisoir et porté pendant 24 heures à l’étuve à 50°. Après ce séjour, le bloc de levure s’est résolu en un liquide épais que l’on reprend par l’eau, environ trois litres ; on fait bouillir une 1/2 heure, on neutralise jusqu’à abat légère. On colle la préparation avec un blanc d'œuf, comme pour la préparation de la gélatine ou de la gélose, pour faciliter les filtrations ultérieures qui, sans cette précaution, seraient longues et difficiles. Porter à l’autoclave 1/2 heure à 105», filtrer sur Chardin, filtrer une deuxième fois, si cela est nécessaire, sur filtre Laurent.

Les filtrations sont rapides et le magma s'essore seul et complètement. On vérifie définitivement la réaction du milieu que l’on ajuste au pH = 7,5. On complète à 6 litres. Les auteurs appellent cette concentration : dilution normale.

À 10 grammes de peptone du milieu gélatine, peptone, sel, on substitue 100 centimètres cubes de dilution normale d’eau de levure.

On ensemence trois tubes de cette gélatine fondue à 30 degrés avec respectivement, 1,2 et 3 gouttes de l’eau à analyser (ou, s’il y a lieu, avec 1, 2,3 gouttes d’une dilution de 1 centimètre cube de cette eau dans 9 centimètres cubes d’eau stérile) et on coule dans des boîtes de

Petri stériles, de 14 centimètres de diamètre. Dès que la gélatine s’est solidifiée, — ce qu'on peut hâter en plaçant les boîtes sur une surface refroidie, on les porte dans une étuve réglée à 18-20° et on les examine tous les jours à partir du 2 jour etce, pendant 15 jours, pour faire la numération après ce délai, ou dès que le développement des colonies liquéfiantes menace d’envahir une partie du milieu.

Le tableau ci-après représente le coeflicient par lequel doit être multiplié le nombre des colonies constatées, si l’on veut évaluer la teneur approximative de l’eau en microbes après 2, 3, 4, etc., jours jusqu’à 15 jours :

Coefficient.

Di HA Mi ni ji pi be NO CO CO S © © mn ni Lo 01 00 à © © © PB © © © À NN © Où

Par exemple, si la numération des colonies a dû être interrompue au 4 jour et si l’on a compté à ce moment 2.000 colonies, le chiffre approximatif des colonies qui se seraient développées dans les cultures est de : 2.000 >< 5 61 — 119220;

Les moisissures sont comptées à part.

La numération des colonies se fait aisément au moyen d'un numérateur à secteur, quadrillé en centimètres carrés, placé sur un fond noir et sur lequel on superpose la plaque à examiner.

On compte successivement les colonies visibles dans un secteur qu'on délimite sur le verre avec un trait de plume, puis celle d’un second secteur et ainsi de suite jusqu’à ce que toutes les colonies développées sur la plaque aient été dénombrées. On en fait le total et celui-ci correspond au nombre de germes cultivables en gélatine qui se trouvaient dans la quantité d’eau ensemencée. Par un calcul très simple, on évalue dès lors le nombre de microbes

contenus dans un centimètre cube ou dans un litre de l’eau étudiée.

La spécification des germes ne peut se faire avec quelque précision qu'après l'isolement de ceux-ci sur les plaques de gélatine et leur réensemencement sur milieux appropriés.

Toutefois, par l'examen microscopique direct de préparations non colorées et colorées, on peut souvent déterminer les espèces bien connues par leurs caractères morphologiques (cocci, sarcines, spirilles, levures, moisissures, etc.).

On devra mentionner ainsi, dans les rapports d'analyse, certains microorganismes qui proviennent des matières en putréfaction : Bac. fluorescens liquefaciens, Bac. pyocyanique, Proteus vulgaris, Bac. megaterium, Bac prodigiosus et les espèces spirillaires qu'il y aura souvent intérêt à isoler par ensemencement dans l’eau gélatinée peptonée, salée (voir vibrions cholériques, chap. xxxv) pour les mieux étudier.

La détermination du bacille typhique, du bacterium coli et des paratyphiques, des bacilles dysentériques, etc., sera faite d’après les méthodes indiquées, pour chacune de ces espèces, aux chapitres XxxIII et XxXX1V.

Pour la recherche du bactérium coli, l'instruction du service de santé militaire prescrit de l’effectuer, non seulement sur des quantités minimes d’eau (I à XXX gouttes), mais encore sur 2, 5, 10, 20, 50, 100, 150 centimètres cubes et davantage. C’est pourquoi il est nécessaire que les prises d'échantillons portent sur deux flacons de 150 centimètres cubes pour chaque eau à analyser.

On ensemence successivement d’abord I, II, V, XX, XXX gouttes d’eau dans des tubes d’eau peptonée à 1 p. 100, salée à 0, 5 p. 100. On ensemence de même 2 et 10 centimètres cubes dans des ballons contenant 50 et 100 centimètres cubes d'eau peptonée.

Pour les volumes plus considérables, on répartit l’eau (20, 50, 100, 150 centimètres cubes) dans des ballons stériles et on la rend directement nutritive en l’additionnant de proportions variables d’une solution concentrée de pepto-sel :

Peptonessèché «Poulenc. Eu ne 50 er.

RACE 0. ce ee te. “gÉ 25 gr.

Eau disüllée. k . 100 gr.

Cette solution doit avoir été stérilisée d'avance en tubes fractionnés contenant chacun 5 centimètres cubes. Elle est trouble, mais il est inutile de la filtrer.

À la place d’eau peptonée, on peut se servir d'eau de levure autolysée, selon le procédé de Diénert et Guillerd précédemment indiqué.

On emploie :

Eau de levure (dilution normale). . . . . 20 cc Ean stériles rt 0" Hot lifis HSINTTTAE 30 cc. Eau d'ensémencement "0 0e 50 cc.

L'eau de levure, comme on le voit, est employée au 1/5 pour le B. coli. |

En cas d’autolyse défectueuse, qui provient surtout de la température inconstante de l’étuve dans les laboratoires où la pression est variable, on a toujours la latitude d’augmenter la quantité indiquée de levure. |

Le mélange d’eau à analyser et de milieu nutritif doit être tel que le taux de peptone qu'il renferme soit égal à 1 p. 100. Par exemple, pour 20 centimètres cubes d’eau, il faut ajouter 0 cc. 4 de solution concentrée ; pour 50 centimètres cubes, 1 centimètre cube. Pour 100 centimètres cubes, 2 centimètres cubes, etc.

La proportion d’acide phénique qu'il convient d’incorporer au mélange d’eau et de solution peptonée est de 0 gr. 85 p. 1.000.

Pratiquement, on obtient un mélange phéniqué conforme en laissant tomber, à l’aide d’une pipette jaugeant 30 gouttes au centimètre cube, une goutte de solution phéniquée à 5 p. 100 pour deux centimètres cubes du mélange eau à analyser, + eau peptonée; donc, par exemple, 25 gouttes pour 50 centimètres cubes. On agite et on porte à l’étuve à

Il ne faut pas ajouter l’acide phénique aux milieux de culture avant de stériliser ceux-ci, car la teneur en acide varierait beaucoup par suite de l'évaporation à l’autoclave.

Les premières cultures faites à 41°5 sont vérifiées 14 à 16 heures après. D’après leurs résultats, on peut déjà conclure, soit à l’absence du bacterium coli dans l’eau expertisée, soit à sa présence dans 1/20, 1/10, 1/5 ou 1 centimètre cube de l’eau, ou bien dans une quantité plus élevée.

(Pour les eaux très souillées, on opère au préalable une

dilution plus ou moins forte de l'eau, afin de fixer leur teneur en b. coli).

Dès qu'un ou plusieurs tubes ou flacons renfermant le mélange phéniqué d'eau à analyser et de solution peptonée s'est troublé, on procède à un second et, au besoin, à un troisième passage en eau peptonée phéniquée à 4195. Quatre ou cinq heures après, même st cetle deuxième ou troisième culture est encore limpide, on en fait un prélèvement avec l'extrémité du fil de platine et on identifie le microbe en réensemençant :

en bouillon simple,

en bouillon lactosé carbonaté, en bouillon au rouge neutre, en lait tournesolé,

La culture en bouillon simple, qui est elle-même trouble au bout de 4 à 5 heures, sera reportée sur pomme de terre, sur gélose et sur gélatine inclinée.

L'examen microscopique, la non-coloration par le Gram et la recherche de l'indol compléteront les moyens d'identification du bacillus coli.

On peut faire le diagnostic rapide de la souillure des eaux de boisson par le b. coli en employant la technique très simple de À. Braun. Celle-ci utilise le milieu de culture de Savage que l’on prépare comme suit :

Dans un demi-litre d’eau, on fait cuire 125 grammes de viande de bœuf. Après cuisson et refroidissement, on filtre pour séparer les graisses et on ajoute :

PepionctDefresne Re Mode re 10 gr.

SERMPERN IN RE CE es TARN SUR Te 10 gr.

CRC PRET on. nat 2 gr. 50

On ramène au volume de 500 centimètres cubes avec de l'eau. On fait bouillir de nouveau. On décante après refroidissement, puis on ajoute 5 centimètres cubes de la solution suivante :

HUTOANDELITé SL NA TE. +. ANoLe

RE RS CN ce ou ns LOU ‘ec:

On répartit par fractions de 6 centimètres cubes dans des tubes à essai qu’on stérilise à l’autoclave à 115° pendant 30 minutes.

Le bouillon a une couleur rouge rubis. Le développement du bacterium coli lui donne une belle fluorescence verte ou, s’il est très abondant, jaune canari avec reflets fluorescents, sur fond sombre. Le bacille d’Eberth ne produit aucune modification de la couleur du milieu.

Deux tubes de 6 centimètres cubes de bouillon au rouge neutre ainsi préparé sont ensemencés respectivement avec 1 et 10 centimètres cubes de l’eau à étudier. On porte à l’étuve 24 heures à 370. Si l’eau ensemencée renferme du b. coli, il se forme des bulles gazeuses à la partie supérieure du bouillon qui devient fluorescent ou jaune canari, suivant l'abondance du coli.

Si la coloration n'a pas viré après 48 heures d'étuve, on peut affirmer que l’eau ne renferme pas de bacillus coli en quantité appréciable.

Quelques autres microbes peuvent déterminer la coloration vert fluorescent, mais pas le jaune canari. Ce sont d'ailleurs des microbes intestinaux : bacillus mesentericus, b. enteritidis Gaertner, bacillus cloacæ, certaines urobactéries ; les bacilles du tétanos et de l’œdème malin, en culture anaérobie, la déterminent aussi.

Cette méthode est sensible et très pratique.

Anaérobies. — La détermination de l'indice anaérobique, c'est-à-dire du rapport entre le chiffre des anaérobies vrais et celui des aérobies, est utile à faire, surtout pour les eaux de puits, de citernes, de réservoirs et de rivières.

Le milieu nutritif adopté pour la culture des anaérobies est le suivant :

Gélatine.ss nee EE RNA 100 à 200 gr.

(suivant la temp. extérieure).

GIUGOSE ST RME 10 gr.

NaGIL a ie gen SN AR RER 5 gr.

Glycerine, Sr EC OP PER 5 gr.

Eau: te NAT NN CARRE RER ET OOOMGEE

On neutralise en alcalinisant très légèrement et on stérilise en tubes droits, qu'on fait fondre à 309 au moment d’ensemencer et après avoir ajouté à chacun d'eux quelques gouttes de solution stérile de sulfo-indigotate de soude.

Chaque tube contenant 10 ou 20 centimètres cubes de milieu de culture reçoit 0 ce. 1, 0 cc. 2, 0 cc. 5, 1 centimètre cube et 2 centimètres cubes de l’eau à analyser. On

incorpore l’eau au milieu de culture sans trop agiter, pour éviter les bulles d'air, et on aspire le contenu de chaque tube dans de longs tubes-pipettes (pipettes de Vignal) préparés et flambés à l'avance, d’un diamètre intérieur de 3

4 millimètres et d'une longueur de O m. 50 environ. Ces tubes-pipettes sont ensuite scellés à leurs deux extrémités et portés sous un robinet d’eau froide pour solidifier la gélatine.On les maintient ensuite dans une étuve réglée à 18-202.

Après 3 à 6 jours, on peut compter les colonies anaérobies qui apparaissent sous forme de petites masses floconneuses ou granuleuses, avec ou sans bulles de gaz, au milieu de la gélatine décolorée.

Les anaérobies facultatifs donnent des colonies ramassées, denses, opaques, qui n’ont pas la physionomie caractéristique des anaérobies vrais. Ils ne doivent pas être compris dans la numération.

D. — Interprétation des résultats d'analyse.

L'analyse chimique fournit d’utiles indications sur la présence et la proportion de certains éléments qui peuvent résulter de souillures permanentes ou accidentelles, ou qui dépendent de la provenance géologique de l’eau à examiner ; mais l'analyse bactériologique est indispensable pour permettre de conclure si une eau est, au point de vue sanitaire, bonne, mauvaise ou suspecte.

La numération des germes contenus dans cette eau fournit surtout d’utiles renseignements pour la surveillance des appareils de filtration et pour savoir si une eau est plus ou moins parfaitement épurée dans son parcours souterrain. Mais certaines eaux de fleuves ou de rivières peuvent véhiculer un grand nombre de germes inoffensifs provenant des couches superficielles du sol, tandis que d’autres eaux, surtout celles de puits ou de sources, se montrent parfois très pauvres en germes saprophytes etabritent cependant certaines espèces microbiennes particulièrement dangereuses.

La spécificalion des espèces est donc de toute première importance. Les souillures provenant de fumiers, d'infiltrations de fosses d’aisances, etc., sont révélées par

l’abondance des microbes de putréfaction, bacilles liquéfiants, megaterium, proteus, etc., et par la proportion des bactertum coli.

Lorsqu'une eau renferme 100, 500, 1.000 bacterium coli par litre et, a fortiori, un chiffre plus élevé encore, on doit généralement la considérer comme très suspecte et dangereuse pour l'alimentation.

Le taux de 10 à 100 bacterium coli par litre indique que l’eau est en période d'infection légère, peut-être au début ou au déclin d'une contamination plus grave. Elle doit être envisagée comme suspecte.

La présence de quelques b. coli par litre ne suffira jamais à faire considérer une eau comme dangereuse, car ils peuvent provenir de contaminations accidentelles, par des excréments d'oiseaux par exemple. Mais si ces bacterium coli sont accompagnés de nombreux microbes de putréfaction, la suspicion est alors fondée et il faudra soumettre l’eau à une étroite surveillance.

Du reste, pour juger de la valeur alimentaire d’une eau, il est toujours indispensable de faire porter les analyses sur des échantillons prélevés à des intervalles variables en diverses saisons et en périodes de sécheresse ou de pluies prolongées.

Les diverses échelles qui ont été proposées pour établir la pureté chimique et bactériologique d’une eau potable n'ont donc, d’après ce qui vient d’être dit, qu’une valeur toute relative. Voici néanmoins celle qu'on peut considérer comme la meilleure.

Echelle d'appréciation de la pureté chimique et microbiologique d’une eau potable.

Nombre 7 J 4 de germes Nombre Degré Chlorures Nitrates ne e Des en NaCl.

cultivables en ER hydroti- EVA mgr.

E. — Agents chimiques recommandables pour la purification extemporanée des eaux potables.

a) Nitrate d'argent et Fluorure d'argent (ou Tachiol). — 0 gr. 1 de l’un de ces deux sels suffit pour détruire en une demi-heure la plupart des microbes contenus dans 5 litres d’eau de rivière ou d'étang. Le vibrion cholérique est tué en 5 minutes, le bacterium coli et le staphvlocoque doré en 30 minutes ; les chlorures et les matières organiques en excès dans l’eau à stériliser retardent l'effet du sel d'argent, mais on peut corriger ce retard en ajoutant préalablement à l’eau quelques gouttes d’ammoniaque (2 à 5 gouttes pour 5 litres) qui dissout le précipité formé par les sels d'argent.

b) 1ode. — Ajouter, par litre d’eau, 8 à 16 gouttes de teinture d’iode du Codex. Agiter. Laisser en contact 30 minutes. Neutraliser l'iode restant par infusion de thé, de café ou par addition de vin, ou par l’hyposulfite de soude. (Il se forme dans ce dernier cas une petite quantité de tétrathionate de soude, sel inoffensif.)

c) Chlore. Chlorure de chaux. — Normalement, le chlorure de chaux du commerce doit avoir une teneur en chlore actif de 100 litres ou 321 gr. 5 (le poids d’un litre de chlore est de 3 gr. 125) par kilogramme. 10 grammes de chlorure du commerce suffisent donc pour dégager 1 litre de chlore,

Pour stériliser l’eau potable, il faut, suivant la teneur de celle-ci en matières organiques, de 0 mgr. 3 à 1 milligramme de chlore actif par litre, c'est-à-dire 0 gr. 3 à 1 gramme par mètre cube avec trois heures de contact ; ou bien 4 à 8 milligrammes par litre avec 15 minutes de contact. On peut détruire l'excès de chlore par addition d'une petite quantité de bisulfite de soude.

Pratiquement, on emploiera 1 à 3 grammes de chlorure de chaux du commerce par mètre cube, avec un contact d'au moins 15 minutes. En voyage, on peut commodément employer une solution de chlorure de chaux à 1 p. 100,

dont 10 centimètres cubes suffisent pour stériliser en 10 minutes 10 litres d’eau.

d) Eau de Javel (hypochlorite de soude). — Si l’eau de Javel contient 100 grammes de chlore actif par litre, on en emploiera au plus 10 centimètres cubes par mètre cube ou 0 cc. 01 par litre (1 milligramme de chlore actif), soit 10 litres d’eau de Javel par 1.000 mètres cubes d'eau (1 kilogramme de chlore actif).

Le produit ordinaire du commerce ne renferme habituellement guère plus de 60 grammes de chlore actif par litre, quelquefois beaucoup moins. Il faut alors compter, en moyenne, sur une dépense de 18 litres d’eau de Javel (1 k. 800 de chlore actif) par 1.000 mètres cubes et, pour assurer une stérilisation efficace dans les grands réservoirs d’eau d'alimentation, un contact de 1 à 2 heures (0 cc. 018 pour 1 litre, ou pratiquement 2 centimètres cubes d’une dilution d’eau de Javel à 1 p. 100 pour 1 litre d’eau à stériliser).

e) Chlore liquide comprimé. — Très employé en Amérique depuis quelques années. On assure son contact suffisamment prolongé avec l’eau dans une sorte de colonne de Gay-Lussac contenant du coke. La dose moyenne nécessaire pour réduire de 98 p. 100 le nombre des microbes de l’eau de rivière est de 0 gr. 2 de chlore par mètre cube, soit 0 milligr. 2 par litre.

f) Réactif décelant la présence de traces de chlore libre dans les eaux potables stérilisées par les composés chlorés.

Solution d’amidon à 1 p. 100.

Solution d’iodure de potassium à 10 p. 100.

Quelques gouttes de ce réactif ajoutées à l’eau stérilisée dans un verre à expériences développent une coloration bleue lorsqu'elle renferme des traces de chlore libre.

F. — Désinfection de l'eau des puits.

Après avoir établi le volume d’eau contenu dans le puits,

on y versera environ 10 litres d’eau dans laquelle on aura délayé le mélange suivant (dose par mètre cube) :

Permanganate de chaux. . . . . O gr. 5 al gr. ou, à défaut : permanganate de potasse 5 gr.

Duliate d'aitmine ss... 1. 0. 50 gr.

RaGlin AVR Er er sir LV 'ANAIAS sr:

Ne pas pomper d'eau pendant 4 jours, puis pomper jusqu'à ce que l'eau devienne incolore.

Ou bien :

Éatider Javel UE MPCREAT EE PEN : 50 gr. par mètre cube.

On peut encore, plus simplement, éteindre 19 kilogrammes de chaux vive dans 40 litres d’eau et projeter ce mélange dans le puits, en agitant avec une longue perche. On attend 3 jours et on pompe jusqu'à ce que l’eau sorte claire. La chaux restant dans le puits est inoffensive. Il faut pomper néanmoins jusqu'à ce que toute saveur styptique ait disparu.

Noia : La désinfection des puits ne peut être efficace que si ces puits ont été préalablement curés et débarrassés de boues. Sans cette précaution, elle serait illusoire.