COLORATIONS ÉLECTIVES. - MÉTHODE DE NISSL
4° Diffévenciation : avec un mélange d'alcool et d'huile d'aniline, jusqu'à ce que le liquide dilTérenciateur n'absorbe plus de bleu de méthylène.
Alcool à 'J6 degrés DO gianiines.
Huile d'aniline incolore 10 —
(Ce mélange doit être conservé dans une bouteille de verre foncé, à l'abri de la lumière.)
5" Montage. — Chaiiue coupe, transportée sur une lame porte-objet, est séchée avec du papier-iiltre. On la recouvre rapidement d'huile de cajeput destinée à l'éclaircir, on sèche encore avec du papier-iiltre ; puis on met (juelques gouttes de benzine rt d'un mélange spécial de colophane et benzine. Mais, pour empêcher que la matière colorante ne dittuse dans la coupe, on doit solidiher aussi vite que possible la colophane, dans ce but, on passe la coupe dans la ilamme d'une lampe à alcool, la benzine s'enilamme, on éteint tout de suite la flamme et l'on recommence jusqu'à disparition complète de la benzine et solidification de la colophane.
Avec cette méthode, la substance chromatique des cellules nerveuses, (cellules somatochromes en particulier), le nucléole et la membrane nucléaire, sont seuls colorés en bleu pâle.
Des modifications très nombreuses ont été successivement apportées à cette méthode primitive de Nissl, et l'on pourrait presque dire que chaque tiavail a été fait avec un procédé spécial, tout en suivant les principes généraux de la mélhode (fixation rapide des pièces fraîches; coloration par un colorant basique d'aniline).
On a employé, comme fixateurs : Valcool (ori; — la solution de formol à 20 pour lïio, à 10 pour 100, à 2 et 3 pour 100;— le sublimé corrosif (solution aqueuse saturée, ou additionnée de chlorure de sodium à6 pour 100);
— le liquide de Lang (bichlorure de mercure, 5 grammes; chlorure de sodium, G grammes; acide acétiiiue, 5 grammes; eau, 100 grammes); —la solution d'Ewing (solution de formol à 5 pour 100, saturée de sublimé); — la solution de Van Gehuchlen (alcool absolu, GO grammes; chloroforme, 30 grammes; acide acétique glacial, 10 grammes); — la solution de Ileld (sublimé, 1 gramme; acétone, 10 grammes; eau, lUO grammes).
r.ien des auteurs emploient Vinclusion, celloïdinée ou paraffinte, indispensable pour la confection des coupes très minces et en séries. — Les colorants basiques ont été à peu près tous employés (bleus de méthylène, rouge Magenta, bleu de toluidine, thionine, bleu polychrome d'Unna, etc.).
— Les liquides différenciateurs varient beaucoup suivant chaque auteur : alcool absolu; —alcool aniline; — solution d'acide acétique à 1 pour 100
' (Sadowsky); — solution de Cothard (créosote, 50 centimètres cubes; huile de cajeput, iO centimètres cubes; xylol, 50 centimètres cubes ; alcool absolu, 160 centimètres cubes), etc.
h. — Autres méthodes (Substances chromatique et achromatique).
Bien des essais ont été tentés dans le but d'obtenir la coloration élective de la substance achromatique, coloration isolée ou associée à celle des chromatophiles. S'il est possible de colorerez masse cette substance achromatique, aucun procédé n'est capable de révéler le réticulnm ouïes fibrilles avec une sécurité suffisante, surtout dans les recherches d'histologie pathologique chez l'homme. Les procédés suivants ont été employés avec plus ou moins de succès, surtout en histologie normale ;
a. — Procédé ancien de Flemming.
1° Fixation dans la solution ordinaire de sublimé corrosif. Inclusion à la celloïdine ou à la paraffine ;
2" Coloration par la safranine, le violet de gentiane; ou mieux par l'hématoxyline de Delafield en solution étendue pendant quelques heures.
(Procédé destiné à montrer les fibrilles de la substance achromatique.)
p. — l'aocÉDÉ RÉCENT DE Held (1897) (doublc coloration, par colorants basiques et acides).
1° Fixation :
Solution de Van Geliuchten :
Alcool absolu 60 grammes.
Chloroforme 30 —
Acide acétique glacial 10 —
ou dans la solution :
Sublimé corrosif 1 gramme.
Acélone 40 granunes.
Eau ... lUO " —
2" Inclusion à la paraffine.
o" Colorations. Les coupes (1-10 p.) sont colorées (une à deux minutes avec léger chauffage) :
Érjtlirosine pure 1 gramme.
Eau distillée 100 grammes.
Acide acétique glacial il gouttes.
Les coupes, devenues roses, sont lavées à l'eau et surcolorées avec la double solution :
a) Solution aqueuse d'acétone (1 : 20) ) - ,. , ,
,\ ri.- , u , 1 -xi !• /ivt' 1. • i' parties égales.
b) oolulion de bleu de méthylène (Nissi)... \ ' °
(On chauffe énergiquement jusqu'à disparition de l'odeur d'acétone.)
Après refroidissement, les coupes sont différenciées dans une solution d'alun à 0,10 pour 100, jusqu'à réapparition de la coloration rosée (quelques secondes à quelques minutes).
4" Lavage. Alcool absolu, xylol, colophane et benzine (procédé primitif de Nissl).
Les chromatophiles de la substance chromatique sont bleus ou légèrement violets, avec les nucléoles. La substance achromatique est d'un rouge vif, ainsi que la membrane nucléaire et la masse du noyau. Ce procécé est avant tout une modification de la Méthode de Nissl.
■)-. — Procédé récent de Cox (1896).
1" Fixation (2 à 3 jours) :
Solution :
Solution saturée de sublimé corrosif 30 grammes.
Chlorure de platine (.5 pour 100) 15 grammes.
Acide osmique (1 pour 100) 10 —
Acide acétique 5 —
2» Inclusion à la paraffine.
COLORATlOiNS ÉLECTIVES. — MÉTHODE DE GOLGI 745
3" Les coupes (5 y.) sont collées et passent 8 heures dans une solution de tannin à 20-25 pour 100. Lavage. 4° Coloration :
a. Avec le bleu d'Indoine :
5 à 10 minutes dans une solution de tartre stibié à 5 pour 100. Lavage pendant 10 minutes ; puis, 12 à 18 heures dans le mélange :
Solution d'alun, 5 pour 100 10 grammes.
Solutionde bleu d'Indoïne B.B. (Mcrk), SpourlOO. 20 —
b. Avec le bleu de méthylène :
5 à 10 minutes dans une solution à 2,5 pour 100 de sulfate de fer ammoniacal. Lavage pendant 10 minutes. Puis, 12 à 18 heures dans le mélange :
Solution d'acide pliénique, 2 pour 100 15 grammes.
Solution alcaline de bleu de méthylène 1 à 2 —
Cette dernière solution est préparée comme suit :
Bleu de méthylène 1 gramme.
Carbonate de potasse 1 —
Eau distillée 100 grammes.
(Solution à faire bouillir 5 minutes.)
(Tous les mélanges des solutions colorantes doivent être pratiqués au moment d'en faire usage.)
5" Montage : Les coupes colorées sont mises sur la lame porte-objets et séchées; puis, placées dans l'alcool-xylolé (2 : 3), et montées dans le baume de Canada.
Ce procédé est plus spécialement destiné à montrer la structure fibrillaire de la substance intercalée entre les chromatophiles de Nissl.
C. ^ Autres méthodes pour les cellules nerveuses et leurs prolongements.
Toutes ces autres méthodes (Golgi ; Hamon y Cajal; Ehrlich; Apathy; Belhe) n'ont eu, jusqu'à aujourd'hui, que des applications exceptionnelles et restreintes en histologie pathologique; avant tout, ce sont des méthodes d'histologie normale.
1" MÉTHODES DE GOLGI (1871-1873-1885).
A. — Méthode lente ou primitive de Golgi (1873).
1" Fixation et durcissement : Pièces très petites (2 à 8 millimètres). Solution très abondante de bichromate de potasse à 2 pour 100 d'abord ; puis, progressivement concentrée jusqu'à 5 pour 100 (15 à 45 jours, suivant la température ambiante; 8 à 10 jours à l'étuve, d'après Weigert).
2" Imprégnation métallique : 'Pièces mises directement, sans lavage, dans : solution de nitrate d'argent à 0,75 pour 100 (pendant quelques jours); ou solution de sublimé corrosif de 0,25 à 0,5 pour 100 (pendant 2 à 3 semaines, à condition d'être renouvelées tous les jours).
3° Coupes faites au rasoir mouillé avec de Peau distillée, perpendiculairement à la circonférence (les toutes premières coupes ne valent rien,
740 HISTOLOGIE PATHOLOGIQUE DU SYSTÈME NERVEUX G£NTr.AL
habituellement. Examiner les suivantes au microscope. Choisir les meilleures; les laver soigneusement une à cinq minutes).
4." Déshydratation. — Eclaircissement dans la ci'éosote pure (deux à cinq minutes). Lame porte-objet et résine Danimar, sans lamelle couvreobjet. A conserver à l'abri de la lumière, dans un endroit sec.
B. — Procédé rapide {Golgi, Ram on y Cajal).
1° Fixation et durcissement : Pièces très petites. Solution :
Solution lie bichromate de potasse à 3 pour 100 4 parties.
Solution d'acide osmique à 1 ]iaur lOl) 1 partie.
(A laisser dans l'obscurité; deux à trois jours pour la névroglie; trois à cinq jours pour les cellules nerveuses; cinq à sept jours pour les libres nerveuses. Solution à employer par grandes quantités (volume 10 à 50 fois supérieur à celui des pièces) ; solution fraîchement préparée.
2" Imprégnation métallique : Après avoir été rincées dans l'eau, les pièces sont mises (deux à six jours) dans : solution à 0,6 ou 1 pour 100 de nitrate d'argent.
(Suspendre les pièces dans ce liquide,)
3" Enrobage rapide à la celloïdine. Coupes. Déshydratation. Eclaircissement dans la créosote. Montage dans la résine Danimar, sans lamelle couvre-objet.
Cette méthode rapide ne peut être faite qu'avec des pièces provenant d'embryons ou de sujets nouveau-nés, recueillies immédiatement après la mort.
« Sur des préparations bien réussies, les fibres et les cellules se présentent à la vue dans leur intégrité : les premières jusqu'aux librilles terminales; les dernières avec tout leur développement protoplasmique et leur prolongement nerveux; on distingue tous leurs caractères, aussi nettement que pourrait le faire une préparation oii Visolement serait parfait. » (Von Lenhossèk.)
2" MÉTHODES d'Ehhuch (1886). Coloration des tissus vivants.
A. — Méthode primitive d'Ehrlich.
C'est une véritable coloration élective de tous les éléments nerveux, des centres ou de la périphérie, obtenue sur Vaninial vivant par l'injection, intra-vasculaire ou lymphatique, d'une solution de bleu de méthylène.
1° Injection : Chez la grenouille, injecter la solution colorante dans le sac lymphatique dorsal. Chez les autres animaux, injecter dans un gros vaisseau.
Solution :
Bleu de méthylène 4 grammes.
Chlorure de sodium ()'J',G.
Eau distillée 100 grammes.
2° Autopsie (l'animal, le plus souvent, succombe après l'injection; autrement, il est sacrifié immédiatement; après autopsie rapide, les organes, qu'on veut examiner, sont exposés à l'air, jusqu'à production d'une teinte bleuâtre).
3" Fixation : Dogiel a réalisé un grand progrès en imaginant de fixer la
MÉTHODES D'EHRLICH. — MÉTHODES DAPATUY ET DE BETHE 747
coloration, jiisi[ue-là instable avec la méthode primitive d'Elirlich, à l'aide d'une solution aqueuse concentrée de picrate d'ammoniaque laite à froid, i» Couper avec le microlome à congélation.
B. — Procédé de Bethe (1897-1898).
Ce procédé, imaginé par Bellie, constitue une modification heureuse, apportée à la technique primitivement donnée par Elulieh, en ce sens que les résultats sont plus certains par suite de la suppression de la congélation, et surtout par suite de la fixation du colorant à l'aide des molybdates et phosplio-niolybdales qui forment avec le bleu de mélhvlène des composés fixes et insolubles.
1" Injections sous-cutanées d'une solution de bleu de méthylène (saturée à 37», 5 à G pour 100).
(On fait une injection de 2 centimètres cubes tous les quarts d'heure; trois à six injections.)
2» Fixer les pièces, de volume aussi petit que possible, dans : solution aqueuse concentrée de picrate d ammoniaque, jusqu'à production d'une coloration violette (dix à quinze minutes).
3» Fixer plus complètement, sans laver, dans l'une des solutions suivantes (une à douze heures).
