X G X ^ X To

On suppose dans cette expression que la pipette donne 25 gouttes par centimètre cube.

Toute l'analyse quantitative se trouve résumée dans ces quelques lignes.

Je n'ai pas à dire comment on distingue les colonies bactériennes des colonies dues aux moisissures; un exercice de quelques jours peut fixer à cet égard l'opérateur; cependant il est des cas douteux qui réclament le secours du microscope pour trancher définitivement cette question.

Les bactéries qui se développent sur les plaques sont des êtres aérobies, indifféremment aérobies, ou anaérobies; il est parfois important de doser également les eaux en organismes anaérobies, c'est-à-dire ne pouvant se développer qu'à l'abri absolu de l'ox}gène, comme le vibrion septique et le bacille du charbon symptomatique. On a vanté pour cela beaucoup de méthodes : la culture des plaques dans des gaz inertes, dans l'azote ou l'hydrogène; quelques auteurs se sont même adressés au gaz d'éclairage et à l'acide carbonique, comme si ces deux derniers gaz n'étaient pas toxiques pour les bactéries; on a essayé le vide, qui donne encore de très bons résultats. De mon côté, j'ai décrit, pour la culture des espèces anaérobiennes, un procédé beaucoup plus pratique, qui consiste à se servir de la gélatine ou du bouillon, séparés de l'atmosphère ambiante par une couche suffisamment épaisse d'une substance fusible à 4o°, formée d'un

mélange de vaseline et de paraffine. J'emploie pour cela des tubes à essais étranglés pleins de bouillon ou de gélatine fondue jusqu'au milieu de l'étranglement, qui reçoivent ensuite une couche d'un hydrocarbure fusible et le système est placé à l'autoclave, à la température stérilisante de iio^, qui expulse également tout l'air dissous. Les huiles employées par quelques bactériologistes ne peuvent rendre le même service.

Bien que les êtres anaérobies parfaits soient relativement rares dans les eaux de source et de rivière, on les rencontre assez abondamment dans les eaux souillées par les résidus des fermentations industrielles (cuves à indigo, fabriques d'amidon, tanneries, etc.), dans les eaux d'égouts et de vidanges : aussi peut-on tirer quelques renseignements utiles de leur dénombrement.

A cet effet, on fait fondre dans un bain d'eau porté entre 40° et 4'^° la gélatine et la couche isolante des tubes étranglés, puis, au moyen d'une pipette graduée et flambée à pointe très fine, on introduit au sein du liquide la quantité d'eau pure ou diluée qu'on désire doser en bactéries anaérobiennes; enfin les vases sont exposés à 20-22°. Au bout d'un temps plus ou moins long, on peut voir apparaître dans la masse de la gélatine des colonies schizophytiennes offrant la forme habituelle des colonies aérobiennes; parfois ces colonies sont surmontéesd'une bulle gazeuse plusoumoins volumineuse. Après i5 jours d'incubation, les colonies devenues apparentes sont comptées à travers le verre comme s'il s'agissait de bactéries écloses sur plaques. Quand on désire étudier les espèces nées à l'abri de l'air, on se trouve ici dans la nécessité de sacrifier le tube ; on fera donc mieux de réserver ces

instruments pour le simple comptage des anaérobies et d'employer les vases que je décrirai plus tard pour leurétude parliculièie.

Il me reste à décrire, en terminant ce paragraphe, rétuve glacière fiiiej'ai fait construire pour mon laboratoire à l'effetHefonserver leseauïàla température

rig. i3.

Ktute glacière el à basses températures.

de o". Comme \a. Jlg, i3 l'Indique, cet appareil consiste en deux boites : Tune intérieure E', destinée à placer les échantillons devant âlre maintenus à o", et l'autre E, servant d'enveloppe à la première. L'élu veE' possède o", 26 de largeur sur o'", 22 de profondeur el o",ao de hauteur; elle communique avec l'air eitérieur au moyen d'un couloir muni de deux portes P'

et P, la dernière porte P adaptée sur Tenveloppe extérieure.

L'étuve réfrigérante E repose sur un faux fond C muni d'ouvertures, de façon à laisser écouler l'eau de fusion de la glace qui s'échappe par le tube T, et eoipêche cette eau de fusion de se mettre en contact avec l'étuve intérieure.

La boîte E destinée à contenir la glace, large de o™,5o sur o™,5o de profondeur et o°^,4o de hauteur, est entourée d'un feutre isolant et d'un couvercle G à double paroi dans l'intérieur duquel on place de la sciure ou de la poudre de charbon de bois ; un thermomètre T traverse ce couvercle et pénètre dans l'étuve intérieure, protégé par une gaîne métallique.

Quand on veut s^ servir de l'étuve, on la remplit de blocs de glace, et l'on fait en sorte de maintenir le niveau de la glace en morceaux, au moins à la hauteur de l'étuve intérieure E'. La température marquée par le thermomètre est rigoureusement égale à o°.

Cet appareil peut également servir d'étuve froide pour les températures comprises entre o° et 25°, quand , au moyen d'un tube muni d'une pomme d'arrosoir S, on fait couler, avec plus ou moins d'abondance, soit de l'eau de canalisation pour les températures comprises entre i4° et 20°, soit pour les températures plus froides, un filet d'eau glacée, qui permet d'obtenir les températures de l\° à i5°.

On peut d'ailleurs, au moyen des régulateurs pour le froid, tels que j'en fais exécuter par M. Adnet, constructeur de cette étuve, maintenir avec beaucoup de fixité la température de la chambre intérieure entre 4° et 20°, lorsque la température ambiante s'élève à 20** ou au-dessus.

DE l'analyse quantitative. 81

V, — Procédés approximatifs.

A côté de ces procédés d'analyse micrographique des eaux, il en existe d'autres que j'ai antérieurement décrit, dont l'exactitude est moindre au point de vue qualitatif et quantitatif, mais qui possèdent une valeur comparative, pouvant se prêter à de simples rapprochements.

Les gelées végétales de lichen, les mucilages de semences de coings, de graines de lin et de gomme adragante nutrifîés avec de la peptone se prêtent aux genres de recherches que je vais exposer.

Premier procédé. — On introduit dans une série de ballons bitubulés de loo*'*^ de capacité {\o\rJlg, i4)

Fig. 14.

Flacon à gelées de liclieo et mucilageâ stérilisés.

3o*'*' à t\o^ de gelée de lichen peptonisée, puis ces ballons sont stérilisés à Tautoclave à 110° pendant une demi-heure. D'autre part, on purge de germes, soit au bain d'air, soit dans la vapeur sèche, un système formé d'une cloche tubulée à capuchon rodé C surmonté d'une cheminée {Jig^ i5). Cette cloche s'applique très exactement sur une plaque de verre usée

à Témeri, supportant une lame de verre très épaisse soutenant une feuille de papier bristol carrée ou ronde PP, dont les bords sont relevés de façon à former une petite cuvette.

Le moment de Tanalj^se venu, la gelée de lichen est fondue à 4o°, puis versée par la tubulure de la cloche sur le papier bristol; dans le moment même on ajoute à cette gelée Feau qu'on veut doser en bactéries, en

Fig. i5.

Vase incubateur pour plaques sur papier.

répartissant aussi régulièrement que possible cette eau à la surface de la gelée de lichen, à laquelle on imprime finalement quelques mouvements de flux et de reflux. La prise s'opère bientôt et l'appareil est alors abandonné à l'étuve chauffée à 3o®, pendant quinze à vingt jours.

Au bout de ce temps, le papier, enlevé de sous la cloche, est rapidement séché dans une étuve à courant d'air chaud et sec, ou à froid, à l'abri des poussières, dans le vide sur un cristallisoir rempli de chlorure de calcium desséché. Il ne reste plus qu'à colorer les colonies développées sur le papier, puis enfin à les compter.

On prépare aisément, comme je l'ai dit, de la gelée

DE l'analyse quantitative. 83

de lichen en faisant macérer pendant plusieurs heures, dans du bouiJlon de bœuf ou du bouillon de peptone filtré et chauffé vers son point d'ébullition, du lichen blaoc {Fucus crispus) retenu dans un sachet de toile fine ; la dose de lichen à employer est de Ôos"^ par litre. La coction achevée, le liquide filant ainsi obtenu est filtré à chaud à travers une étamine ou une bourre de coton hydrophile. Quelle que soit la limpidité au filtrat um, la gelée de lichen, en se prenant, devient opalescente ou un peu louche, ce qui ne présente ici aucun inconvénient.

Second procédé. — Cette seconde méthode repose sur la faculté que possède la gelée de lichen d'absorber promptement un volume d'eau considérable après qu'elle a été desséchée en lames minces sur une feuille de papier. Ce terrain, infertile à l'état sec, récupère ses facultés nutritives et peut, après avoir été convenablement humecté, nourrir des bactéries qui se développent sur les deux faces du papier.

Ainsi donc, l'analyse micrographique des eaux par les papiers nutritifs est de la plus grande simplicité. Le papier nutritif, taillé en rectangle, muni d'un fil suspenseur en platine, est enveloppé de papier Joseph, introduit dans un autoclave et chauffé une heure à 1 lo**; le papier sort de l'appareil sec et purgé de tout germe.

Au moment de l'analyse, on le pend par son fil sus-penseur en platine dans une éprouvette bouchée à l'émeri (voir fig, i6), on le tare et on le plonge dans l'eau à doser; les couches nutritives gonflent rapidement, et au bout de cinq minutes l'opération est terminée. 11 reste à connaître le poids de Teau absorbée,

ce que donne une seconde pesée, et à placer le tout à Tétuve sous une cloche dont l'air est lui-même saturé d'humidité.

Les colonies ne tardent pas à se développer en taches diversement colorées sur le papier nutritif : tantôt elles sont très confluentes si l'eau est impure, tantôt elles sont rares quand l'eau est pauvre en bactéries et en mucédinées. Au bout de 8 à 1 5 jours, lorsqu'on s'est

Fig. i6.

Flacon incubateur pour bandes de papier nutritifié.

assuré que le nombre de taches n'augmente pas sensiblement, le papier est retiré du vase incubateur et porté dans une étuve à air chauffée vers 43°; quand le papier est tout à fait sec, on colore par le procédé suivant les colonies microphjtiques devenues presque invisibles, lorsqu'elles n'appartiennent pas aux espèces chromogènes.

Technique de la coloration, — A. Le papier nutritif, récent ou ancien, sec ou humide, couvert de taches microbiennes ou de, moisissures, est plongé pendant quelques minutes dans une solution aqueuse d'alun cristallisé, puis dans de l'eau ordinaire.

Cette opération préliminaire a pour double bu td'in-

DE l'analyse quantitative. 85

solubiliser légèrement la gelée et de mordancer les surfaces à colorer.

B. La bande de papier, bien lavée, est alors immergée pendant vingt à trente secondes dans une solution de sulfate d'indigo titrant 2S'' d'indigotine pure par litre. Ce bain se fait de la façon suivante : 26'' d'indigotine cristallisée sont mis à digérer pendant vingtquatre heures avec ^o^^ à 5os^ d'acide sulfurique fumant de Saxe, et le mélange qui en résulte, devenu soluble, est jeté dans i*>' d'eau; on neutralise partiellement la liqueur très acide, et l'on a ainsi la solution prête pour l'usage.

Au contact de la liqueur sulfindigotique, le papier et les bactéries se colorent promptement; on pousse au noir la teinte des colonies et des moisissures, qui se détachent très visiblement sur la teinte moins foncée acquise par la gelée.

G. Il s'agit maintenant de remplacer le fond bleu clair de la gelée par un fond blanc; on y arrive en introduisant, après un lavage soigné, la feuille dans un bain de permanganate de potasse à i pour 1000; la gelée bleu clair passe au violet, ensuite au rose; on lave une troisième fois et l'opération est terminée. Il importe de suivre attentivement cette dernière manipulation, qui dure environ une demi-minute : l'action trop prolongée du permanganate affaiblirait la teinte des colonies; si l'expérimentateur commettait cette faute, le mal serait aisément réparable, il suffirait de replonger le papier dans l'indigo.

D. Pour donner plus de blancheur aux épreuves et M. H

arrêter immédiatement Taction décolorante du permanganate resté en excès sur la gelée, on peut laisser séjourner quatre-vingts secondes la bande de papier dans un bain faible d'acide oxalique (de 3 à 5 pour i oo) , puis enfin on lave à grande eau.

Les bactéries et les moisissures apparaissent finalement en beau bleu sur fond blanc; en séchant, les couleurs acquièrent une plus grande intensité.