II. — Milieux nutritifs

Rien ne peut être plus varié que les milieux nutritifs employés par les bactériologistes pour la culture des micro-organismes. Afin de faciliter l'étude de ces

DE l'analyse quantitative. 49

milieux nous les diviserons en deux grandes classes : 1^ En milieux liquides; 2° En milieux solides.

Milie ux liq u ides.

Ces milieux liquides peuvent eux-mêmes être divisés :

i^ En milieux liquides naturels;

2° En milieux liquides artificiels.

Enfin, comme troisième subdivision, les milieux liquides naturels et artificiels peuvent être stérilisés à froid ou à haute température.

Liquides naturels stérilisés à froid. — Dans ce groupe, on peut comprendre les humeurs de l'économie animale, les sucs de fruits et des végétaux. Parmi les liquides animaux, on a souvent utilisé les urines, le sérum de sang, les liquides séreux épanchés dans les hydrocèles, le lait, la salive parotidienne des animaux, l'humeur aqueuse de l'œil, etc.

Quand on prend les précautions antiseptiques suffisantes, c'est-à-dire quand on retire de l'économie animale ces divers liquides à l'abri des impuretés atmosphériques, ainsi que M. Pasteur l'a fait le premier, ces humeurs restent indéfiniment inaltérées et peuvent être utilisées d'emblée pour la culture de plusieurs micro-organismes. Si, au contraire, le prélèvement de ces liqueurs n'a pas été parfaitement aseptique, il est nécessaire, avant de s*en servir, de les débarrasser des germes qui les ont contaminées.

M. Chaniberland indique, de la façon suivante, les M. 5

ciiAriTiiE m.

moyens de recueillir sur Tanimal vivant et mort le sang contenu dans ses vaisseaux :

« Le procédé consiste à faire passer le sang du corps d^un animal dans un appareil flambé contenant de Tair pur et restant ensuite en communication avec l'air extérieur. On arrive très facilement à ce résultat avec des tubes de verre ayant la forme indiquée par la fig, 8. On flambe ces tubes dans un fourneau à

Fig. 8.

Pipette de M. Chamberland.

gaz après avoir mis un tampon de coton en a\ si Ton dispose d'un animal vivant, on meta nu une veine ou une artère dans laquelle on fait une incision et Ton introduit l'extrémité effilée qu'on vient de couper et de passer dans la flamme. Le sang coule de lui-même ; on peut faciliter son écoulement en aspirant avec la bouche par le tube a; on ferme ensuite l'effilure à la lampe.

» Si Ton ne dispose pas d'un animal vivant, on prend le cœur d'un animal qui vient d'être tué, dans un abattoir, par exemple, on perce la paroi à l'aide d'un scal-

DE l'analyse quantitative. 51

pel flambé et Ton plonge la pointe effilée préalablement coupée et flambée. On aspire par le tube a, etc. »

Il est souvent plus aisé, lorsque le liquide peut filtrer aisément, de le purger de tout organisme, en le dirigeant à travers des substances solides don t les pores sont assez fins pour s'opposer au passage des bactéries. A. cet effet, M. Pasteur a primitivement employé le plâtre, puis la porcelaine dont se sont également servis avec succès MM. Gautier et Ghamberland. De mon côté, j'ai démontré, bien avant le D^ Hesse, que le carton d'amiante, les rondelles de papier filtre accumulés sous une forte épaisseur, jouissaient de même de la propriété de stériliser les liquides (^).

La fig, 9 représente l'appareil qui a servi à mes premiers essais de filtration sur le plâtre ; il se compose d'un ballon à col long et légèrement conique étranglé à son tiers inférieur (voir en A). Au-dessous de l'étranglement on étire à la lampe une pointe capillaire effilée /?, au-dessus de ce même étranglement on dispose une bourre d'amiante convenablement serrée a sur laquelle on coule une couche de plâtre gâché t de 7*"°* à 8**™ de hauteur, dont la formule est la suivante : >

Eau 46

Plâtre à modeler 5i

Amiante broyre 3

Total 100

L'appareil ainsi préparé est séché pendant une ou deu\ semaines à l'étuve maintenue à (\0^^ puis porté lentement à une température comprise entre 170® et

(^) Les Organismes vivants de l'atmosphère, p. 162; i883.

i8o°; cette dernière chaulTe a pour but, d'abord de détruire les germes répandus à la surface interne du ballon, ceux apportés par la bourre d'amiante, le plâtre et l'eau employée au gâchage; ensuite de

Fis- 9-

Filires de plâtre.

recuire le plâtre, c'esl-à-dire de le ramener à l'état de sulfate de chaux, anhydre.

Four mettre en marche cet appareil filtrateur stérilisé, on commence par imbiber d'eau le tampon de gypse recuit, qui sous l'action de ce liquide s'hydrate avec un dégagement de chaleur sensible à la main. Cette humectation préalable a l'avantage de rendre plus parfaite l'adhérence du Tiltre au tube de verre et de chasser l'air des pores du plâtre.

Le filtre convenablement imbibé, la pointe latérale de l'appareil est flambée, cassée et plongée dans un

DE l'analyse quantitative. 53

matras d'eau stérilisée à iio°; par une dilatation ménagée on chasse 4o** à 5o"^ d'air du ballon qui, après refroidissement, sont remplacés par un égal volume d'eau microscopiquement pure.

Cette eau, portée à TébuUition et vaporisée rapidement, s'échappe par la pointe latérale capillaire sous la forme d'un jet de vapeur sifflant et continu ; au bout de quelques minutes, la majeure partie de l'air du ballon est remplacée par de la vapeur d'eau : il ne reste plus qu'à sceller la pointe capillaire /?, ce qui n'offre aucune difficulté. La vapeur, en se condensant, produit un vide considérable : aussi les sucs ou liquides à stériliser amenés dans la tubulure de l'appareil pénètrent-ils dans le ballon b en suintant à travers le plâtre.

hdifig, 9 représente en A un appareil en voie de fonctionnement; un large entonnoir e amène à la surface du plâtre la liqueur à débarrasser de tout germe. La même figure montre en B un second système différant du premier par l'adjonction d'un appareil réfrigérant destiné à suspendre la putréfaction des liquides mis en expérience.

A cet appareil, qui a le tort de saturer le sulfate de chaux des liquides soumis à la filtralion, j'en ai substitué un second (voir fig, lo) formé d'un vase de cuivre rouge argenté très résistant, à large col, garni d'une plaque annulaire de bronze pouvant recevoir, au moyen de huit écrous, une pièce cylindrique B également argentée, terminée à sa partie inférieure par un rebord intérieur destiné à soutenir des diaphragmes métalliques, des tampons divers, des fromages de calcaire d'argile cuite cimentés à la paroi du cylindre par des luts insolubles, inaltérables à 200° ;

la partie supérieure de ce même cylindre peut n un plateau C muai d'une tubulure destinée à conduire le liquide sur le filtre. J'ai fait fabriquer par Golaz, constructeur de cet appareil, des cylindres de rechange, filetés intérieurement et dans lesquels on visse, avec le secours d'une clef puissante, un bouchon

Fig. lo.

Appareil litlrateur à hautes pressions.

de bronze foré, à l'effet de comprimer énergiquement des rondelles de carton d'amiante, de papier filtre ou de toute autre substance poreuse, inaltérable ou a peine loucliée par les températures de i5o° à 180"; le bouchon reste .alors à demeure jusqu'à la fin de la filtration. Deux robinets sont placés sur cette bouteille : l'un R en haut, sur le col, est destiné à pratiquer le vide dans le vase ou ù laisser échapper l'air;

DE l'analyse quantitative. 55

Tautre en bas, R', est affecté à la vidange du liquide filtré. Le cylindre, pourvu de son tampon bien sec, est fixé à la bouteille en interposant entre les surfaces appelées à adhérer, une rondelle de plomb, puis l'appareil est chauffé deux heures, soit vers i8o**, soit à l'autoclave à i io°. Le vase refroidi, la douille du robinet R, garnie d'un tube de caoutchouc et d'un raccord en verre contenant une bourre stérilisée, est mise en communication avec une trompe ou tout autre appareil faisant le vide, tandis qu'on amène le liquide dans le cylindre B à la pression de l'atmosphère ou sous une pression plus élevée, suivant la nature de la substance filtrante et du liquide à stériliser. L'opération terminée, le robinet supérieur R est ouvert avec précaution, puis on distribue dans des ballons stérilisés, par l'intermédiaire d'une canule métallique vissée au robinet R', le liquide filtré destiné à être réparti plus tard dans les conserves à ensemencer.

Il est incontestable que les filtres de porcelaine sont aujourd'hui bien préférables aux divers appareils qui viennent d'être décrits; c'est pour cette raison que j'emploie uniquement la bougie Chamberland dans toutes mes nouvelles recherches. Cet appareil si commode a eu, comme les autoclaves, des détracteurs obstinés; on a reproché aux bougies de biscuits de ne pas filtrer les substances trop épaisses, de laisser passer difficilement le lait; cela ne peut être évidemment contesté, le papier lui-même, dont les pores sont beaucoup plus grands, ne filtre ni la boue, ni les gelées épaisses; mais ou réellement apparaît le côté mesquin de l'esprit des contradicteurs, c'est quand on a affirmé que les bougies de porcelaine ne pouvaient pas retenir les microbes quand elles étaient

fendues ou présentaient des défauts de continuité. Je ne nommerai pas l'auteur de cette découverte extra-

Flj. II.

Appareil liltrateur construit avec une bougie Chamberland.

ordinaire, je préfère lui laisser la gloire de triompher modestement de celte vérité incontestable.

Pour la lîllratiun des liquides par la bougie Chamberland, j'ai adoplé dans mon laboratoire le dispositif reproduit par la yï^, ii.

DE l'analysb quantitative. 57

Comme on voit, ce système se compose essentiellement de deux éprouvettes M et N; Téprouvette M reçoit le liquide à filtrer, Téprouvette N reçoit le liquide filtré ; le robinet R", muni d'une pointe de verre mobile par l'intermédiaire d'un caoutchouc, sert à distribuer le liquide stérilisé à froid dans des vases purgés au préalable de germes, soit à l'autoclave à 1 10", soit dans le bain d'air chaud à i8o<».

Quand on veut entreprendre la stérilisation par nitration d'un liquide altérable, on commence par placer à l'autoclave à i lo® pendant une heure l'éprouvette N unie à la bougie de porcelaine B au moyen d'un tube de caoutchouc à vide. Cette opération terminée et après le refroidissement, on ligature avec des bandes de caoutchouc le tube qui unit la bougie à l'éprouvette, puis, par un débit du liquide du vase V, gouverné par un robinet, on remplit l'éprouvette M et l'on pratique une aspiration énergique par l'intermédiaire du tube de caoutchouc A; le robinet R' à trois voies doit à cet instant occuper la position indiquée dans la figure d'ensemble.

Sous l'influence de la pression atmosphérique, le liquide introduit dans l'éprouvette M traverse la porcelaine, se stérilise et parvient dans l'éprouvette N, qu'il remplit avec plus ou moins de rapidité suivant sa nature; quand cette dernière éprouvette est à peu près pleine, on suspend l'aspiration en A, on ferme le robinet R, et l'on dispose le robinet R' comme cela est indiqué en R'^; à ce moment, la pression atmosphérique se rétablit dans l'éprouvette N, c'est-à-dire que l'air extérieur y pénètre en se filtrant à travers la bourre t\

On procède alors à la distribution du liquide filtré.

après avoir cassé et flambé la pointe de verre mobile du robinet R''. Cette opération effectuée, on scelle de douveau cette pointe, on rétablit l'aspiration, on dispose le robinet R'' comme la figure d'ensemble l'indique, et l'on ouvre enfin le robinet R, en rétablissant bien entendu l'écoulement du liquide du vase V, qui avait été suspendu pendant la vidange de l'éprouvette N. L'éprouvette remplie, on la vide de nouveau, et ainsi de suite. Le côté le plus délicat de cette opération est la construction de cet appareil de manière à éviter toute fuite; si les caoutchoucs ne sont pas ligaturés avec des fils élastiques, si les robinets R et R" ne sont pas soigneusement graissés à la vaseline paraffinée, de même que le gros bouchon de caoutchouc qui ferme l'éprouvette N et le bouchon que porte le robinet R, l'air peut pénétrer par les moindres fissures et apporter des germes dans le liquide filtré à travers la bougie Ghamberland. Les liquides qui peuvent aisément être stérilisés au moyen du dispositif qui vient d'être indiqué sont : les urines, le sérum de sang dilué, Talbumine d'œuf diluée, les liquides lymphatiques, les liquides séreux d'hydrocèles, etc. ; et encore : les sucs de fruits, des plantes herbacées (jus de pommes, de poires, de raisin, sucs de choux, de navets, de carottes), que Ton obtient aisément en coupant les fruits, les herbes, que l'on pile ensuite dans un mortier et qu'on soumet à la presse dans un sachet de toile résistante. Les sucs obtenus sont d'abord passés à Tétamine, ensuite filtrés au papier, et enfin dirigés à travers la bougie.

Je prépare les jus de viande en faisant macérer pendant une heure à 35° poids égal d'eau et de chair musculaire hachée; le tout est ensuite soumis à la

i>E l'analyse quantitative. 51)

presse, le jus recueilli est neutralisé, puis passé à i^étamine fine et soumis à la fîltration à travers la porcelaine; on doit dans ce cas particulier opérer avec une certaine rapidité ou employer des mélanges réfrigérants pour maintenir le liquide destiné à être stérilisé à froid à une température voisine de o°, car au bout de quelques heures il arrive parfois que ce jus présente des phénomènes manifestes de putréfaction.

Quand le liquide à filtrer à travers la bougie Chamberland est trouble ou louche, la porcelaine, qui d'abord fournissait assez rapidement une quantité notable de liquide, s'obstrue, et la liqueur ne tombe dans le récipient stérilisé que goutte à goutte. Pour remédier à cet inconvénient, on suspend l'aspiration, on substitue à l'éprouvette M une seconde éprouvette pleine d'eau claire, et avec le secours d'un écouvillon ou d'une brosse à dents, on lave la paroi extérieure de la bougie, puis, tout étant remis en place, la fîltration recommence et se poursuit avec rapidité. Je ne m'étendrai pas sur les macérations qu'on peut pratiquer d'une façon aseptique, ce sont là des procédés beaucoup moins certains qui n'entreront jamais dans la pratique des laboratoires ; j'en parlerai seulement pour mémoire.

Dans de l'eau privée d'organismes vivants, on introduit directement soit de la chair musculaire enlevée à un animal sain quelques minutes après sa mort, îîoit les parties charnues des fruits, des légumes verts ou tendres, des navets, des pommes de terre, enlevées avec le secours d'emporte-pièces chauffés, dont on vide le contenu avec des liges flambées dans des matras ou des ballons d'eau stérilisée qu'on peut ensuite abandonner ouverts sur un plateau de verre

rodé recoiivei'l d'une cloche (voir fig, la ). Ces expériences sont parfoiï> contradictoires : le liquide des vases se trouble, et la putréfaction se déclare

est aisé de reconnaiti-e dans la plupart des cas qu'il s'agit d'altérations dues à l'ensemencement fortuit d'un microbe; avec un peu d'habitude et de soin, nn arrive cependant à obtenir un nojnbre de succès

Kig. .3.

,\ppareil pour effecluer les macéiulioas sférilts.

-emarquable (gS sur loo). Pour cela il faut opérer en plein air, après un temps pluvieux, loin de toute habitation, et éviter toutes les fautes opératoires, qui pourraient amener les germes qu'on veut précisément écarter. M. Ghamberland a pu de son côté obtenir des infusions de haricots frais retirés directement de leur cosse verte, intacts; bien avant nos e\.périeoces, M. Pasteur avait prouvé que le suc de raisin puisé dans l'intérieur même du grain ne renfermait pas le moindre organisme vivant. Beaucoup plus récemment, dans les Annales de l'InatUut

DE l'analyse ouantitatlve. 61

PasteaVy M. Fernbach s'est livré aux mêmes expériences, avec un dispositif presque semblable à celui que j'ai employé, et ses conclusions sont identiques à celles que j'ai données il y a huit à dix ans, soit dans les Annuaires de Montsouris^ soit dans mon ouvrage sur les Organismes vivants de l'atmosphère.

Liquides naturels stérilisés par la chaleur, — On n'a aucun avantage à stériliser à chaud les liquides sécrétés par les animaux ou les végétaux, car, non soumises à l'action des hautes températures, ces liqueurs, qui contiennent d'habitude des principes albumineux coagulables au-dessus de 60° et 70°, jouissent d'un pouvoir nutritif supérieur à celui qu'ils présentent quand ils ont été fortement chauffés. L'urine est peut-être de tous les liquides sécrétés par l'économie animale celui qui a peu de chose à redouter de l'ébullition et des températures voisines de iio'^.

I/iqueurs nutritives artificielles stérilisées à froid. — Dans cette catégorie de milieux peuvent être rangés les bouillons ou les compositions similaires contenant des substances volatiles (carbonate d'ammonium, alcool, etc.) ou décomposables par la chaleur. Les milieux artificiels qu'on peut préparer en incorporant dans Teau ou le bouillon des liquides albuminoïdes : sérum, lymphe, ou des sucs d'origine végétale, rentrent dans cette catégorie.

Liqueurs nutritives artificielles stérilisées à chaud, — On use dans les laboratoires de bactériologie d'une grande variété de liqueurs nutritives, indiquées sous les dénominations suivantes :

i<* Des liqueurs dites minérales; M. G

62 ciiAriTiiE III.

•i° Des bouillons préparés extemporanément, soit avec l'extrait de viande Liebig, soit avec l'extrait de viande Cibils;

3° Des bouillons de bœuf, de veau, de poulet, de cobayes, de poissons, etc., purs ou associés avec des peptones;

4° Du bouillon de peptone pur;

5® Des décoctions de champignons (levures, champignons comestibles, moisissures, mycéliums);

6° Enfin d'infusions de navets, de choux, de foin, etc.

1° Les premières liqueurs appelées minérales furent préparées par M. Pasteur, pour démontrer, contrairement aux vues de Liebig, que la fermentation dite alcoolique s'effectuait en l'absence de toute matière plastique. En semant des globules vivants de levures dans un liquide ainsi composé :

Parties.

Eau distillée loo

Sucre candi lo

Gendres d'un gramnie de levure 0,075

M. Pasteur se fit fort de préparer une quantité d'alcool aussi considérable qu'on pouvait l'exiger. Cette expérience, si aisée à reproduire, porta un coup funeste aux théories de la fermentation universellement admises vers 1860 par les chimistes de toute nationalité.

La solution de Pasteur, très propre à nourrir les moisissures et quelques espèces bactériennes, qu'on y sème à l'état adulte, est bien moins favorable au rajeunissement des germes de l'air et des eaux. M. le professeur Cohn, de Breslau, modifia plus tard ce

DE l'analyse quantitative. . 63

liquide, en retrancha le sucre candi, évidemment trop favorable à la nutrition des mucédinées; sa formule devint alors :

Parties.

Eau distillée loo

Tartrate d'ammoniaque i

Cendres de levure i

Plus tard encore cette liqueur subit quelques modifications heureuses; elle fut additionnée de phosphate et de sulfate de magnésie, et sa composition fut fixée ainsi qu'il suit :

Parlio".

Eau distillée 200

Tartrate d'ammoniaque 20

Phosphate de potasse u)

Sulfate de magnésie 10

Phosphate tribasique de chaux 0,1

Ainsi préparée, la liqueur de Gohn est loin d'être sensible à l'action des germes des bactéries; cependant, exposée dans les lieux où les poussières abondent, ou encore additionnée de quelques gouttes d'eau, elle se trouble et se putréfie.

M. Rollin, Jaksch et beaucoup d'autres expérimentateurs ont créé des liqueurs de ce genre appropriées au développement d'une ou plusieurs espèces particulières; chacun peut les imiter, et l'on voit combien peuvent être nombreux les liquides nutritifs formés d'éléments minéraux et cristallisés.

2** Avant l'utilisation des décoctions de viandes pour la culture des bactéries, pendant longtemps on a préparé dans les laboratoires un bouillon fabriqué avec V extrait de Liebig. Le bouillon type, que j'ai pendant longtemps mis en expérience à l'Observa-

Gi CHAPITRE iir.

toire de Montsouris, était préparé en dissolvant dans i^*' d'eau 5o5'' d'extrait de viande commerciale connu sous le nom d^extractum carnis Liebig; la solution effectuée, on la neutralisait à chaud par de la soude au Yô' Portée à Tébullition et filtrée, cette solution doit se montrer sans action sur les réactifs colorants. Ce. bouillon, stérilisé à iio®, fournit un très léger dépôt blanc, insoluble dans Teau, que le microscope montré formé d'une poussière brillante à grains irréguliers, facile à distino:uer des microbes vivants et de leurs spores. Sous l'action de la lumière, ce liquide, pourvu après sa préparation d'une belle couleur rouge ambré, se décolore de jour en jour et acquiert à la longue une teinte jaune très pâle. Ainsi obtenu, le bouillon Liebig possède à 18° une densité égale à 1,024. Le bouillon Liebig neutralisé est environ sept fois moins sensible que les bouillons de bœuf de peptone. Avec l'extrait Cibils, on prépare de même des bouillons analogues dont l'usage est indiqué pour la culture de certaines bactéries qui trouvent dans ces sortes de milieux une nourriture substantielle très abondante; d'autres espèces microscopiques n'y croissent jamais.

3° Je prépare 1» bouillon de bœuf en faisant décocter pendant cinq heures i^^ede chair musculaire maigre de bœuf dans 4'^' d'eau; le bouillon, écume dès le début de l'ébullition, est laissé en repos après sa fabrication, puis dégraissé par filtration à travers un linge mouillé, enfin neutralisé à la soude caustique. Cela fait, on le porte dix minutes à l'ébullition, on le filtre au papier et on le ramène au volume de 4*'*- Les bouillons de viande troubles, opalescents, lents à se clarifier, fournissant des dépôts même un mois après leur

DE l'analyse quantitative. ()5

fabrication, sont toujours des bouillons mal dégraissés ou insuffisamment bouillis après la neutralisation.

Ce décocté possède à 20** une densité voisine de I ,oo3; évaporé au bain-marie, il fournit par litre i56' d'un extrait sec, cassant, entièrement redissoluble, non granuleux, transparent comme la gomme arabique fortement colorée, d'un goût agréable, différant essentiellement , de cette substance antihygiénique vendue sous le nom à^extrait de viande Liebig, En ajoutant au bouillon de bœuf los"" de sel marin par litre, on obtient un bouillon salé remarquable par sa sensibilité aux germes de l'air et des eaux; sa densité s'élève alors à i ,009.

On prépare de même des bouillons avec la chair musculaire de veau, de poulet, de lapin, de cobaye, de poisson, etc.; avec des organes d'animaux : foie, rate, pancréas, poumons, etc. Ces derniers bouillons sont souvent très troubles après leur préparation et filtrent très difficilement; on arrive à les obtenir (l'une magnifique limpidité, d'abord en les dégraissant soigneusement après leur refroidissement complet, puis ensuite en les clarifiant au moyen de l'albumine d'œuf, comme cela sera indiqué quelques pages plus loin lors de la préparation des milieux nutritifs solides.

4° On a également substitué au bouillon de bœuf pur des bouillons mixtes formés de décoction de chair musculaire et de peptone; je ne vois pas pour ma part l'intérêt qu'il peut y avoir à employer ces mélanges. Les bouillons de peptone sont généralement plus sensibles à l'égard des bactéries que les décodés de viande préparés avec les soins que j'ai indiqués; en outre, ils ont l'avantage d'être d'une préparation

très facile, et de pouvoir pour ainsi dire être mathématiquement dosés.

Je me bornerai de formuler à cette place quelques desiderata, relatifs à Tadoption des mêmes milieux: nutritifs, afin que les essais des divers expérimentateurs puissent être aisément comparés.

Je proposerai, par exemple, de donner au bouillon de culture usité pour l'analyse quantitative des eaux la composition suivante :

Peptone 20

Sel marin r . 5

Cendres de bois 0,10

Eau ordinaire 1000

Dans l'eau placée sur le feu, on fait dissoudre le sel et la peptone, on ajoute les cendres de bois, et l'on porte à Tébullition durant quelques minutes. Ce bouillon est légèrement alcalin par la raison que les cendres et les peptones possèdent ordinairement une réaction franchement alcaline; on ajoute alors pendant l'ébullition quelques gouttes d'une solution faible d'acide tartrique, de façon à rendre le liquide aussi neutre que possible. On a conseillé des bouillons de peptone plus concentrés et jugé de l'altérabilité de ces liquides nutritifs d'après le trouble plus ou moins intense que les micro^organismes peuvent y produire; cette manière de voir n'est pas conforme aux faits : l'altérabilité d'un bouillon n'est pas proportionnelle à la quantité de substance nutritive ajoutée; au contraire, passé une certaine limite, elle devient inversement proportionnelle au poids de la peptone employée; pour la peptone Chapoteaut qui me sert, cette limite est voisine de 3o pour 1000.

DE l'analyse quantitative. • 67

La gélatine d\in pouvoir nutritif correspondant, à peu près, à celui du bouillon présente la composition suivante :

Peptone 20

Sel marin 5

Cendres 0,10

Gélatine 100

Eau 1000

5° On évitera d'employer les gélatines acides ou trop alcalines, et surtout les gélatines commerciales qui ont été antiseptisées au moment de leur préparation par des fabricants peu scrupuleux, dans le but de les empêcher de tourner pendant le séchage. On se trouvera bien de l'emploi de la gélatine Goignet n° 1 ou des gélatines Nelson vendues en filaments.

Les gelées végétales, de lichen et d'agar, sont beaucoup moins aptes à favoriser le rajeunissement des microbes; d'ailleurs la gélose ordinaire ou agar ne fond qu'à de hautes températures (65-75°), elle est encore très chaude au moment où elle peut se prêter à la fabrication des plaques ; plusieurs espèces fragiles résistent déjà mal à 4o'*-45°.

Les décoctions de champignons, des vastes mycéliums, et notamment des levures de bière, ont été fabriquées en vue de favoriser la multiplication de quelques microphytes. Ces décoctés sont souvent troubles, et demandent à être clarifiés au moyen du blanc d'œuf.

6° Enfin on a de même utilisé les bouillons de navels, de choux, de foin, sucrés ou non sucrés; l'eau de foin qui a joui d'une si grande réputation en Angleterre et en Allemagne est du plus mauvais emploi : son degré de sensibilité à l'égard des microbes la range parmi les liqueurs dites minérales, tandis que

les décoctions de feuilles de choux, de navets sont plus putrescibles que le bouillon Liebig.

Milieux solides.

Ces milieux peuvent également être divisés :

i** En milieux solides naturels;

2° En milieux solides artificiels.

Je joindrai à ces subdivisions une troisième classe de milieux, solides mixtes, fabriqués en mélangeant à la gélatinç stérilisée au préalable des liquides animaux ou végétaux, stérilisés par filtration à froid.

Milieux solides naturels, — Dans cette catégorie de milieux, on peut comprendre la pulpe des fruits (oranges, citrons) utilisés pour la culture des moisissures; le parenchyme des fruits charnus : poires, pommes, carottes, etc.; la pomme de terre, dont les tranches coupées au moyen d'un couteau stérilisé, après la désinfection de la partie extérieure du tubercule parle sublimé corrosif, a été employée pour cultiver certaines espèces chromogènes et pathogènes. Parmi les liquides animaux, le sérum du sang coagulé vers 70°, d'après le procédé que le D'' Koch a indiqué, est employé pour la culture du bacille de la tuberculose. Plusieurs auteurs ont également fait usage de l'albumine d'œuf également coagulée à basse température, 5o®-55°, etc.

Milieux solides artificiels. — Au nombre des terrains solides usités pour la culture des schizomycèles, on peut employer :

1° La gélatine nutritive;

DE l'analyse quantitative. 69

2° La gélose peptonisée;

3° La gelée de lichen ;

4° Les mucilages.

1° La gélatine est presque généralement employée pour la confection des milieux de cultures solides ; sa préparation ne présente pas de grandes difficultés; il faut néanmoins avoir suivi les différentes opérations que son obtention à l'état de limpidité exige, pour être capable de l'obtenir avec les qualités requises par les expériences de bactériologie. La clarification de cette gelée par fîltration à travers le papier est longue et pénible : c'est pour cette raison que ce mode d'opérer a été à peu près abandonné.

Au contraire, il est facile, au moyen de l'albumine d'œuf, d'obtenir dans des conditions déterminées et du premier coup une gelée absolument claire, quelle que soit la proportion de gélatine employée qui dépasse d'ailleurs rarement plus de lo pour loo.

Dans une capsule de cuivre étamée à l'étain pur, argentée, ou encore mieux en fer controxydé, on verse 1 2005'' d'eau ordinaire. Cette capsule placée sur un fourneau, on jette dans cette eau 206'" de peptone, Se»* de' sel et on ajoute une pincée de cendres de bois. Lorsque le liquide est arrivé à peu près à l'ébullition, on retire la capsule, on ajoute sans tarder iook*" de gélatine et on active la dissolution de cette substance en agitant avec une spatule. Si on ajoutait la gélatine dans le liquide placé sur le fourneau, on s'exposerait à voir cette dernière se coller au fond de la capsule et s'y brûler sous l'action directe de la flamme du fourneau. Ce premier temps de l'opération accompli, on procède à la clarification du liquide de la manière suivante :

La capsule est remise sur le fourneau dont la flamme a été considérablement baissée, de façon à amener avec lenteur le liquide à Tébullition. Pendant ce temps, on réunit deux blancs d'œufs dans une petite capsule de porcelaine à manche, auxquels on ajoute environ poids égal d'eau distillée. On bat ce mélange quelque temps, de façon à activer la solution de l'albumine; puis on fait tomber en un mince filet, dans la capsule placée sur le feu, Teau albumineuse qu'on vient de préparer, en ayant soin d'agiter constamment la solution de gélatine. Gela fait, on abandonne ce liquide à lui-même jusqu'à ce que les grumeaux d'albumine coagulée viennent former à sa surface une croûte blanchâtre et mousseuse. On éteint le feu dès que se manifestent les premiers signes de l'ébullition. Alors, au moyen d'un écumoir, on enlève Talbumine réfugiée à la surface du liquide qui est versé sur une étamine destinée à retenir les grumeaux répandus dans la masse. De cette étamine, le liquide tombe dans un vaste entonnoir de verre garni d'une forte bourre de coton hydrophile qui achève de le clarifier complètement. Cette filtration doit être effectuée avec le liquide très chaud, et on la voit s'accomplir, même en hiver, en moins d'un quart d'heure. 11 reste à distribuer la gélatine parfaitement limpide dans les vases mêmes où devront s'effectuer les cultures, et finalement à stériliser ces vases avec leur contenu.

2** La gélose nutritive se prépare comme la gélatine, cependant son obtention exige quelques précautions particulières qu'il est utile de signaler.

La gélose n'ayant pas tendance à se coller à la partie inférieure de la capsule, on peut la mettre

DE l'analyse quantitative. 71

dissoudre dans Peau en même temps que le sel et la peptone. Quand la gélose est dissoute, ce qui exige une demi-heure à trois quarts d'heure, même quand la proportion de cette substance ne dépasse pas 205'' par litre, on procède à la clarification, comme pour la gélatine; mais, au lieu de recevoir la solution de gélose passée à Fétamine dans un entonnoir muni d'une bourre de coton hydrophile, on la reçoit sur un papier filtre ordinaire, qu'elle traverse avec beaucoup de rapidité en donnant un liquide d'une limpidité magnifique. M. de Freudenreich a préconisé la filtration des solutions de gélose à Pautoclave; cette opération me paraît superflue quand on a procédé à la clarification au blanc d'œuf comme je viens de le dire; de même que la gélatine, la gélose fait l'objet d'une répartition méthodique dans les vases destinés à la culture; il faut cependant se hâter et opérer avec le soluté très chaud si l'on ne veut pas voir apparaître un commencement de solidification qui gêne beaucoup cette opération.

Les vases à culture renfermant de la gélose stérilisée à l'autoclave offrent un terrain solide, opalescent, quelles que soient les précautions que l'on prenne.

Plusieurs auteurs ajoutent à la gélose ordinaire une quantité de glycérine variant de i à 3 pour loo; cette substance, qui favorise dans quelques cas le développement des micro-organismes (bacille de la tuberculose, Nocard et Roux), empêche également la dessiccation rapide de ce terrain nutritif.

3** Pour obtenir de la gelée nutritive de lichen, on peut faire digérer directement le Fucus crispus lavé, xiit dans du bouillon de bœuf préparé à l'avance, soit

7'i CHAPITRE III.

dans du bouillon de peptone préparé exlemporanément; la quantité de frondes de lichen Garraghaen à ajouter par litre de liquide varie de 3os** à 4o8^ suivant qu'il est frais ou sec. Après une digestion à ioo° prolongée pendant plusieurs heures, on passe le décocté à travers un tamis qui retient les frondes mucilagineuses du lichen, et le JiUratum est de nouveafu porté à l'ébullition, puis passé à travers une étainine placée dans un entonnoir à filtration chaude. La limpidité de ce milieu nutritif n^est jamais absolue; il conserve une légère opalescence inférieure à celle que présente la gélose. Ce milieu nutritif peut être employé pour les cultures solides qui exigent une température comprise entre 3o** et 4o°, mais son usage est surtout indiqué dans la préparation des plaques étendues soit sur le verre, soit sur du papier, et dont on désire colorer les colonies au bleu d'indigo.

4** Les mucilages se préparent avec de la gomme adragante, ou avec des semences de coings.

On commence par laver soigneusement la gomme adragante à l'eau froide, puis on l'imbibe de 5 à 6 fois son poids d'eau, et on la laisse en digestion à basse température pendant douze à vingt-quatre heures. Le magma qui résulte de cette macération est repris par plusieurs fois son volume de bouillon ou d'eau nulrifiée avec 2 pour loo de peptone; on fait bouillir le tout pendant quelques minutes, et on passe avec expression à travers un linge fin. Ce terrain demisolide est encore plus louche que la gélose, mais il présente comme la gelée de lichen la faculté de regonfler sous l'influence des liquides, quand il a été desséché sur des lames de verre ou des feuilles de papier.

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A côté des graines de coings on peut utiliser les mucilages fournis par la graine de lin.

Milieux solides mixtes, — J'appelle ainsi des gelées préparées au moment du besoin avec des liqueurs animales ou végétales stérilisées à froid, de façon à obtenir des terrains éminemment nutritifs pour les espèces qui réclament, par exemple, à être cultivées dans le jus de viande, les sucs végétaux qui, avons-nous déjà dit, ne résistent pas sans perdre de leurs propriétés fécondantes aux températures élevées de l'autoclave.

On confectionne ces milieux de la façon suivante. A de la gelée simple chargée de 20 pour 100 de gélatine, qu'on a fait fondre à 3o®-4o°, on ajoute, au moyen de pipettes flambées, les liquides végétaux ou animaux stérilisés par filtration à froid, on opère leur mélange avec la gélatine fondue, en agitant longuement; les conserves ainsi obtenues sont placées pendant une vingtaine de jours à l'étuve, de façon à s'assurer que durant les manipulations il ne s'est pas introduit de germes capables d'altérer ultérieurement la sincérité des résultats; quand cet essai préalable donne des résultats négatifs, ces milieux mixtes sojît mis en expérience comme les gelées nutritives stérilisées à 1 10°.

Nous connaissons maintenant les divers instruments et les divers milieux usités dans les essais quantitatifs des eaux : il nous reste à savoir comment se pratiquent ces recherches bactériologiques.

74 OHAPITRK III.

rv. — De l'essai préliminaire et des divers procédés usités pour le dosage numérique des bactéries des eaux.

Ce dosage rapide consiste à déterminer, au préalable, dans un laps de temps très court, la richesse approximative d'une eau en bactéries. Il est nécessaire de le pratiquer quand on a recours à la méthode du fractionnement des eaux dans le bouillon ; il rend aussi de grands services dans les analyses par les plaques de gélatine lorsqu'on ne possède aucune donnée sur la quantité probable des germes vivant dans les liquides.

Cet essai s'effectue ainsi : l'eau, parvenue au laboratoire, est distribuée par goutte à l'état naturel dans 4 à 5 conserves de bouillon stérilisé; puis diluée au I : loo, au I : looo, au i : loooo et au i : jooooo si on le juge utile. Une goutte de ces diverses dilutions est introduite dans des séries de 12 petits vases de bouillon. Ces conserves sont exposées pendant vingtquatre heures entre 3o° et 35°. Au bout de vingtquatre heures un simple coup d'oeil montre à quelle puissance l'eau reçue doit être diluée.

En effet, si, par exemple, 2 vases des 12 qui ont reçu une goutte d'eau au i : looo se sont altérés, on peut être certain que l'eau renferme au moins 4 bactéries X 4 par gramme d'eau au i : 1000, par la raison qu'en moyenne, au bout de vingt-quatre heures, le quart des bactéries à éclore dans le bouillon manifestent leur présence par un trouble ou des dépôts spéciaux parfaitement discernables.

Donc, is^ de l'eau considérée offrira au minimum

DE l'analyse quantitative. 75

16000 bactéries. Cette donnée précieuse va nous servir à établir le dosage proprement dit sur des bases certaines. Il est vrai qu'on retarde ainsi de vingtquatre heures l'analyse quantitative et qu'on est contraint de prolonger pendant tout ce temps le séjour de l'échantillon dans la glace, mais cela n'est pas d'une grande importance, l'analyse qualitative, c'està-dire la plus utile, pouvant être commencée dès l'arrivée de l'eau.

Méthode par les ensemencements fractionnés dans les liquides. — En adoptant, comme exemple, le cas qui précède, c'est-à-dire celui d'une eau qui, diluée au I : 1000, accuse 16000 bactéries par centimètre cube à Tessai préliminaire, il est aisé de déduire que chaque centimètre cube d'eau au i : 1000 devant renfermer environ 16 bactéries, les conserves de bouillon, pour s'altérer dans la proportion de 20 pour 100 devront recevoir une goutte d'eau au i : 3ooo. Je n'insiste pas, comme je l'ai promis, sur ce procédé délicat et difficile à appliquer par les débutants, mais qu'on rend beaucoup moins chanceux par les ensemencements multiples à i, 2 et 3 gouttes, ce qui laisse l'opérateur absolument maître de choisir les séries de cultures qui répondent aux exigences voulues et de négliger les séries qui, au contraire, sont trop riches en cas d'altérations. Je passe sans retard à la description du procédé que j'ai appelé mixtCy basé sur le fractionnement de l'eau dans la gélatine coulée en pkques.

Procédé mixte, — Ici, l'opérateur n'est plus gêné par la crainte de dépasser le taux des conserves alté-

rées que comporte un bon dosage dans la méthode précédente; il lui importe peu que toutes les plaques montrent i, 2 et 3 colonies; ces taches microphytiques seront, tout au moins, séparées les unes des autres par un espace convenable et il pourra sûrement les apercevoir en surveillant journellement les ensemencements, tandis que dans les vases de bouillon le trouble ne lui indique nullement s'il est produit par une ou plusieurs bactéries. L'expérimentateur va, il est vrai, renoncer au bénéfice de l'incubation à la température de 3o-35**, ce qui est un point à considérer dans les analyses très précises, mais je suppose qu'il tient surtout à obtenir des résultats comparatifs et simplement cette indication relativement peu importante qui découle des dosages quantitatifs vul-

gaires.

L'eau diluée au titre voulu, on l'ensemence à la dose d'une ou plusieurs gouttes dans des flacons coniques contenant une couche de 5™" à 6™™ de gélatine, qu'on a fait fondre au préalable dans une étuve chauffée vers4o°. J'emploie d'habitude une douzaine de ces flacons, ce qui permet d'obtenir un facteur très approché et met l'observateur à l'abri d'un accident fortuit comme il s'en présente assez fréquemment (bris, liquéfactions prématurées, envahissements par les mucédinées, etc.). Si i ou 2 flacons se trouvent dans de mauvaises conditions, il en reste toujours un nombre suffisamment élevé qui permet le calcul exact du nombre de germes.

Bien que ce calcul soit d'une très grande simplicité, je ne trouve pas déplacé d'en donner ci-après la formule générale :

Si A gouttes d'eau, au i : ^ 10'*, ont donné un nom-

DE l'analyse quantitative. 77

bre C de colonies, i*'*' d'eau naturelle en contiendra