CULTURE DU BACILLE DE LA DIPHTÉRIE

rence le sang de bœuf; on peut cependant utiliser le sang du mouton et celui du cheval. ,

Le sang de bœuf est ordinairement récolté a 1 abattoir ; quand l'animal "a été abattu, la carotide est dénudée et sectionnée, le sang coule en jet et il est facile de recevoir ce jet dans de grands cristallisoirs préalablement stérilisés au four à flamber. 11 serait mieux d’introduire une canule stérile dans la carolide avec un ajutage (caoutchouc et tube de verre) ; mais, en général, les bouchers

ne se prêtent pas à cette opération.

Quand le sang est recueilli, on place les cristallisoirs dans un endroit frais à l’abri de toute trépidation pour permettre la séparation du sérum et du caillot; vingt-quatre heures après, on aspire dans des ballons-pipettes le sérum séparé et on le répartit dans des ballons qu’on ferme aussitôt à la lampe.

Si le sérum était stérile, l’opération serait terminée : on aurait ainsi une provision de sérum. Malheureusement dans les opéialions que nous venons de décrire, qui se passent dans des milieux septiques, des germes tombent dans les vases, et il est nécessaire de stériliser le sérum. 11 existe pour cela deux procédés : on peut, après l’avoir séparé du caillot, le iiltrer sur bougie Chamberland, ou bien le stériliser en chauffant les boules de verre, remplies de sérum et fermées à la lampe, trois fois à deux jours d’intervalle, à 58°, pendant une heure.

Quand on veut préparer des tubes de sérum coagulé, on répartit le sérum stérilisé dans des tubes de verre qui sont chauffés à 80° , pendant tout le chauffage, on les maintient très inclinés, presque horizontaux, pour augmenter leur surface libre qui servira à 1 ensemencement. Pendant la coagulation, le chauffage doit augmenter progressivement, mais lentement, et ne jamais dépasser 80° poui conserver au sérum toute sa transparence.

Voici le procédé classique aujourd’hui, tel qu’il est pratiqué à l'Institut Pasteur. Lœffler et d’autres auteurs ajoutent du sucre, de la glycérine ou des peptones au sérum du bœuf ; il est bien certain que, sur le sérum ainsi complété, les bacilles poussent un peu mieux, mais d’autres microbes se développent aussi plus rapidement et gênent les examens.

Si l’on veut préparer du sérum coagulé avec du sang de cheval, il suffit de prendre le sang à la veine jugulaire; on a ainsi un sérum qui est le plus souvent privé de germes et peut être employé sans filtration, ni chauffage. 11 faut bien savoir cependant que, sur sérum de cheval coagulé, le bacille de la diphtérie pousse moins bien que sur sérum de bœuf coagulé ; en outre, le cheval doit être saigne

i.18 LOUIS MARTIN. — SÉROTHÉRAPIE ANTIDIPHTÉRIQUE.

quand il esl à jeun; pendant la digestion, le sang peut contenir demicrobes.

Ensemencement sur sérum. — Purification. — Quand on \eu( préparer la toxine diphtérique, il faut obtenir un microbe diphtérique en culture pure, en partant de la fausse membrane humaine. Voici comment on opère: on prend un til de platine assez fort, aplati en forme de spatule à l'une de ses extrémités. On le fait rougir à la flamme d’un bec Bunsen ou d’une lampe à alcool pour le stériliser et on le laisse refroidir dans un tube flambé avant de s en servir. Quand on veut recueillir de la semence, on promène légèrement la spatule du fil de platine à la surface d’une membrane diphtérique, et l’on ensemence successivement trois tubes de sérum coagulé sans recharger la spatule. On doit faire sur chaque tube une dizaine de stries parallèles, sur toute la longueur du tube, de façon à bien étaler la semence. Dans la pratique, on nélale jamais trop : les débutants ne font souvent qu’une ou deux stries sur chaque tube et s’étonnent de ne pas obtenir des colonies bien isolées; répétons donc qu'il faut bien étaler la semence sur les trois tubes.

Les tubes ensemencés doivent être placés dans une étuve à 37°. Après vingt-quatre heures, l’examen permet de constater que, sui’les deux premiers tubes ensemencés, les colonies sont très serrées et qu’il est difficile d’en trouver de parfaitement isolées; qu'en tout cas, elles sont souvent très rapprochées, tandis que, sur le troisième tube ensemencé, il s’en trouve de parfaitement isolées.

Les colonies diphtériques se présentent, après vingt-qualre ou trente-six heures d’étuve, sous forme de petites taches arrondies blanc grisâtre, dont le centre est plus opaque que la périphérie. Mais il ne faut pas se contenter de les reconnaître par l'aspect, il faut s’assurer par l’examen microscopique que les colonies, qui paraissent être diphtériques, sont bien constituées par des bacilles ayant la forme d’un bâtonnet légèrement renflé aux extrémités, s'enchevêtrant mutuellement à la façon d’un las d'aiguilles; il faut colorer ces microbes et s’assurer qu’ils prennent le Gram.

Quand on a bien reconnu une colonie isolée, il importe d’obtenir avec cette colonie la purification du microbe pour arriver à avoir une culture pure du bacille diphtérique.

Pour purifier un microbe, on pique la colonie reconnue diphtérique avec un fin crochet de verre ou avec un fil de platine, on délaye soigneusement dans du bouillon les microbes qui sont restés adhérents au crochet, puis on agite vivement et longtemps le tube de bouillon. Cela fait, on trempe dans ce bouillon, qui contient des bacilles en petite quantité répartis dans tout le liquide, un fil de

préparation dé la toxine diphtérique.

platine préalablement stérilisé et refroidi; aussitôt sorti du bouillon, on promène le fil de platine à la surface d un tube de sérum coagulé en faisant sur le tube de très nombreuses stries pour répartir les germes sur toute la surface, de façon a ebtenu’ des co onies bien isolées. Le tube de sérum est place a 1 etuve a 3/ • Apies quarante-huit heures, on voit sur le tube de sérum des colonies tics développées ; avec le crochet de verre, on prélève de la semence sm la colonie qui est la plus isolée eLon ensemence un tube (le bouillon qu’on met à l’étuve à 37°. Après un séjour de vingt-quatre heui es, on examine ce tube de bouillon pour bien s’assurer qu il ne contient que des bacilles diphtériques, et qu’on a bien une culture pure d un microbe provenant d’une fausse membrane humaine. Quand ce résultat est obtenu, on peut étudier les propriétés du nouveau bacille isolé et rechercher s’il produit de la toxine diphtérique.

La technique que nous venons d’indiquer est celle qui servit à MM. Roux et Yersin pour obtenir le poison diphtérique, nous l’avons empruntée à leurs mémoires qui parurent dans les Anna/es de l'Institut Pasteur en décembre 1888, juin 1889 et juillet 1890.