II. — PRÉPARATION DE LA TOXINE DIPHTÉRIQUE

Bouillons de culture. — Pour obtenir la toxine diphtérique avec un microbe qu’on vient d’isoler d’une fausse membrane humaine, il faut faire des ensemencements sur milieux liquides; on doit savoir que la préparation de ces milieux liquides est soumise à des règles qu’il importe de bien connaître.

Mais, avant de fixer le meilleur mode de préparation, voyons comment MM. Roux et Yersin ont opéré quand ils ont obtenu pour la première fois une toxine diphtérique active.

Dans leur premier travail (1888, p. 642), ils indiquent comme milieu de culture le bouillon de veau ; dans le deuxième memoiie (1889, p. 274), ils précisent en disant que ce milieu doit être légèrement alcalin. Dans ces conditions, le bacille diphtérique donne une culture peu abondante, caractérisée par la formation d amas mictobiensqui se déposent au fond des vases de cultures. Si 1 on i echenhe la réaction du milieu, on voit que le bouillon, d alcalin qu il était, devient légèrement acide, puis redevient alcalin après un temps plus ou moins long, suivant les cas. Si l’on filtre sur bougie Lhamberland le liquide de culture, et si on recherche son activité en l injectant sous la peau d'un cobaye, on voit que le bouillon est inactif tant qu’il estacide, et qu’il devient toxique quand 1 alcalinité apparaît.

140 LOUIS MARTIN. — SÉROTHÉRAPIE ANTIDIPHTÉRIQUE.

MM. Roux cl Yersin imaginèrent un procédé qui permit d obieoii plus rapidement une toxine active: voici sa description (\) :

Dans les conditions habituelles, il faut maintenir les cultures pendant des mois à la température de 37° pour que le poison s'y accumule. Un procédé plus rapide peut être recommandé : il donne des résultats plus constants ; il consiste à faire la culture dans un courant d’air humide. On se sert de vases à fond plat, munis d'une tubulure latérale (vases de Fernbach), dans lesquels on met du bouillon alcalin peptonisé à 2 p. 100, de façon que la couche liquide ait une faible épaisseur. Après stérilisation à l'autoclave, on sème du bacille diphtérique récent, très virulent, et on porte à l'étuve à 37°. Lorsque le développement est bien commencé, la tubulure de chaque ballon est reliée par un tube de caoutchouc à un ajutage d un tuyau de cuivre qui est lui-même en relation avec une trompe à eau. Au moyen de pinces à vis, placées sur les tubes de caoutchouc, il est facile de régler le courant d’air qui pénètre par le col de chacun des matras, après avoir barboté dans un flacon laveur. Cet agencement est préférable à celui qui dispose les vases de culture les uns à la suite des autres, et les fail tous traverser par le même courant d air. Après trois semaines, un mois au plus, la culture est suffisamment riche en toxine pour être employée. Sur le fond des' vases, on voit un fort dépôt de microbes, et, à la surface, un voile formé de bacilles plus jeunes. A ce moment la réaction est fortement alcaline. Tous les bacilles diphtériques, même lorsqu ils paraissent également virulents pour les cobayes, ne donnent pas les mêmes quantités de toxine dans les cultures.

L essai de bacilles de diverses provenances fera reconnaître ceux qui fabriquent la toxine la plus active. Nous n’étonnerons aucun bactériologiste en disant que la force de la toxine n’est pas toujours la même dans des cultures faites, en apparence, dans des conditions identiques. Aussi est-il préférable de faire une provision de toxine qui servira pendant toute une série d'expériences, afin que celles-ci soient bien comparables entre elles.

Les cultures achevées sont filtrées sur une bougie Chamberland, et le liquide clair est gardé dans des vases bien remplis, bouchés et tenus à l’abri de la lumière, à la température ordinaire. Ainsi préparée, la toxine tue d’ordinaire un cobaye de 500 grammes en quarante-huit heures à la dose de 1 dixième de centimètre cube. Elle perd son activité à la longue, mais lentement si on la maintient dans les conditions que nous venons de dire. »

(1) Annales rie l'Institut Pasteur, 1894, p. 611.

PRÉPARATION DE LA TOXINE DIPHTÉRIQUE. 141

Avec le procédé que nous venons de décrire, on obtenait des toxines peu actives et surtout il y avait des irrégularités. Aussi les travailleurs ont-ils recherché les conditions qui favorisaient la production des toxines et, en précisant les expériences, ils ont vu que la production des toxines dépendait en grande partie :

1° De l'alcalinité primitive du milieu ;

2° De la persistance de cette alcalinité.

Alcalinité primitive tics bouillons. — D’après MM. Houx et Yersin, le bouillon de veau devait être franchement alcalin ; Parket Williams (t) étudièrent spécialement cette question et voici leurs conclusions: «Les meilleurs résultats sont obtenus avec du bouillon qui, après avoir été neutralisé, est additionné d’environ 7 centimètres cubes de soude normale par litre. »

Pour appliquer cette règle, il y a un point délicat : la neutralisation du bouillon; pour l’apprécier, on se sert comme indicateur de la teinture de tournesol. 11 faut à l’avance préparer, comme point de comparaison, un tube contenant de l’eau distillée et trois gouttes de teinture de tournesol; il donne la teinte neutre donton devra se rapprocher autant que possibleen alcalinisant le bouillon.

Quand on observe bien la règle posée par Pafir et Williams, on voit que le bouillon ensemencé avec un bacille diphtérique devient acide et que l’alcalinité apparaît vers le deuxième, troisième ou quatrième jour de la culture ; et, de ce fait, on constate parfois des irrégularités dans la production de la toxine ; aussi a-t-on cherché quelle était la cause de cette acidité.

Corps qui favorisent la production d’acidité. — C’est le Dr C. Spronck, d’Utrecht (2) qui, le premier, mit en cause la glucose présente dans les milieux de culture, et nous avons étudié avec le Dr Louis Momont (3) l’influence de différents corps.

Nous avons vu, qu’à la dose de 5 grammes par litre, la glucose, la lévulose , la saccharose, la galactose, la glycérine favorisaient la production d’acide; tandis que le glycogène, l’amidon, la lactose, la maltose, la raffinose, l’arabinose, l’érythrite, la dulcite eL la mannite ne provoquent pas l’apparition de l’acidité.

Ious ces faits nous ont permis de conclure qu’en éliminant du bouillon tous les corps qui favorisent la production d’acidité, on peut obtenir un milieu qui reste toujours alcalin et dans lequel la toxine doit se produire rapidement.

1 our éliminer toute glucose, il importe d’avoir des peptones

!D J he Journal of experimental Medieine, vol. I, p. 1.

(2) Annales de l'Institut Pasteur, 1895, p. 758.

(3) Annales de l'Institut Pasteur , 1898, p. 39 .

142 LOUIS MARTIN. - SÉROTHÉRAPIE ANTIDIPHTÉRIQUE.

qui n’en contiennent pas ; il importe aussi de faire disparaître toute

celle qui se trouve dans les viandes.

Pour avoir des peptones privées de glucose, le mieux est de les

fabriquer soi-même au laboratoire.

Pour avoir des viandes sans glucose, il faut, avant de preparei

des bouillons pour la diphtérie, détruire le sucre par fermentation ; pour cela on a proposé d’ajouter à la macération de v.ande de la levure et de placer le tout à l’étuve; mais il est facile de se convaincre qu'il est inutile d’ajouter de la levure et qu .1 sullit, pou. faire disparaître toute trace de glucose, de placer la macération viande vingt heures à l’étuve à 33-, en prenant toutefo.sk pré^ution de se servir pour faire la macération d une eau chauffée a 3 , .

Milieu de choix. - En recherchant les conditions favorables a la production de la toxine, nous avons proposé un milieu de culture qui donne de très bons résultats et qui est constitue par un mélangé par parties égales d’un bouillon d'estomac de porc qui apporte peptone et d’une macération de viande ; voici comment on opéré .

Bouillon d’estomac de porc. - C’est une eau qU

produit soi-même avec des estomacs de porcs; ces estomacs, appelés panses dans le commerce, nous fournissent ce que nous appelions pour plus de simplicité le bouillon de panse.

Pour l'obtenir, nous prenons des estomacs de P»rcs et non broyons ou hachons ensemble les tuniques muqueuse et »b I* ^ Pour éviter autant que possible les variations qui pourraient survenir par suhe de laquaLé variable de pepsine de chaque estomac,

nous prenons ordinairement cinq panses, pour une opeiatio .

“laçons ce hachis dans Peau acidulée à 50°, dans les proporlions suivantes :

Hachis d estomacs de poics a

Acide chlorhydrique ]000

liau à 50°

L'eau doit être maintenue à 30”, car à cette température la pepsine de la muqueuse stomacale digère plus activemen

et les transforme en peptone 'tU ^ ^niralement terminée ; on

Apres douze heure , P vin®t-quatre heures: dans ce

peut sans ^s de microbe.. Lorsque la

milieu 1res acide, il f l llouili0n d’estomac de porc

digestion est achevée, on chautie

II) Ou peut '.VI, iiiconvcuienl, I"''" mmhwrer ^'olgnncs, jtrwwmple Su poumon, .1rs

“jf ïrr"«,SJ * "•

tic l'estomac cl les autres matières albuminoïdes.

PRÉPARATION DE LA TOXINE DIPHTÉRIQUE

a 100°,on détruit ainsi la pepsine en excès; puis on le passe au tamis ou mieux on le filtre sur une couche de coton hydrophile peu épaisse et peu serrée, on chaude le liquide filtré et on l’alcalinise au moment où le liquide atteint environ 80°. Dans le liquide, de gros flocons se forment qui le clarifient.

Après l’alcalinisation, on filtre le bouillon sur papier. Quelquefois le bouillon de panse est louche ; si on chauffe à 120°, cela na pas d importance, car le bouillon se clarifie à Y autoclave. Si on veut seulement chauffer à 100°, il faut avoir soin de bien écumer le bouillon comme on écume un pot-au-feu, puis on le laisse refroidir et on enlève la graisse solide qui surnage. Si, malgré ces précautions, le liquide était louche, on le clarifierait sûrement en ajoutant, avant de l’alcaliniser, un fragment de chlorure de calcium et immédiatement après un morceau de phosphate de soude.

Une pratique meilleure esL de chauffer la macération d’estomacs de porcs tous les deux jours à -100° ; après trois ou quatre chautlages, le liquide se clarifie très facilement; ensuite chauffer à 120°, filtrer sur papier, répartir dans les vases de culture et stériliser en chauffant un quart d’heure à 115°.

Le liquide obtenu par cette aulo-digestion de l’estomac est une véritable solution de peptone, dans laquelle le bacille diphtérique se développe bien, sans fournir d’acide ; la peptone ainsi préparée donne des îésultats plus constants que les peptones commerciales dont la composition est si variable.

Macération de viande. — Voici la technique que nous conseillons . hacher de la viande de veau, mettre 500 grammes de ce hachis Par litre d’eau, chauffer à 37° et placer le tout à l’étuve pendant vingt heures, exprimer la viande et ajouter 5 grammes de sel marin par litre.

Mélange. — A cette macération de viande ainsi préparée, on ajoute parties égales de bouillon d’estomac de porc alcalinisé et filtré sur papier.

Le mélange par parties égales de macération de viande et de bouillon d’estomac de porc est chauffé à 70° pour coaguler les matières albuminoïdes, puis filtré sur papier et neutralisé exactement ; on ajoute alors les 7 centimètres cubes de soude normale par litre et on stérilise par filtration sur bougie Chamberland, soit par chauffages discontinus à 100°, soit par chauffage à l’autoclave; quand on veut obtenir une toxine très forte, il vaut mieux stériliser par

filtration, mais, dans la pratique, il est plus simple de se servir de I autoclave.

Dans le milieu ainsi

pi é paré, le bacille diphtérique ne pousse plus

! 44 LOUIS MARTIN. - SÉROTHÉRAPIE ANTIDIPHTÉRIQUE.

en petits amas qui se déposent au fond du vase ; mais les microbes en se développant, forment un voile a la surlacc du liquide, dan . .

premiers jours le voile tombe et se reforme ; après quinze jours, le

voile ne se reforme plus. .

Avec le milieu que nous venons de décrire, on peut supprimer le courant d'air que préconisaient MM. Houx et Yersin faire des cultures en profondeur, et avoir cependant plus rapidement des toxines plus actives.

Milieux sans viande. — Beaucoup de travailleurs, pour etudic la production de la toxine diphtérique, ont essayé de préparer pour le bacille diphtérique, une sorte de liquide Raulin dans leque omles éléments seraient dosables. On espérait ainsi suivre leur transformation et savoir desquels dérive la toxine diphtérique.

Les milieux qui ont été proposés ne permettent pas d obtenir en général des toxines très actives ; mais, comme les essais pourront être améliorés, nous devons donner la composition des milieux les

plus connus. , ...

Milieux de M. Nicolle. - Maurice Nicolle a propose un milieu

qui contient différents sels, des peptones et de la gélatine liqueti. e

par le subtilis ; voici sa formule :

Eau Q. S. pour porter à 1 000 grammes.

Peptone Cliapotcau ou de Aschmann.

Sel marin

Phosphate bipotassique

Asparagine

Lactate d’ammoniaque

Phosphate disodique

Tartrate de potasse

Sulfate de magnésie

Gélatine liquéfiée par le suolilis.

- tü

lions ce milieu, la culture du bacille se fait pendant très longtemps efÏÏoxicTé augmente. Avec ce procédé. M. Nicolle , obtenu une loxine active au millième do centimètre cube apres cinquante jouis

de culture (Communication de 1 auteur). .

0, “cl, inski (2) avait proposé pour l'étude des toxines du cholém e de la diphtérie un milieu où tous les aliments étaient dosablc. . sa formule :

... . U, ma aiouler un dixième de bouillon, alcaliniser, rê-

(1) Faire de la gélatine n 1 eau 10 p. - I Uure cn bouillon de subtilis, enlever de partir en flacons, stériliser, ensemencer a\cc une cultu

l'étuve après trois à quatre jours. ... isqj .,.293.

(2) Oucihsski, Archives de médecine experimentale, ■ . J

PRÉPARATION DÉ LA TOXINE DIPHTÉRIQUE

Eau

Glycérine

Chlorure de sodium

Phosphate bipotassique Lactate d'ammonium. . .

Sulfate de magnésium.

Chlorure de calcium — Asparagine

t 000 grammes.

2sr,5

0BP.5

0sr,3

Ob'ql

Hugounenq cl Doyon (1) répètent les expériences d’Ouchinski e trouvent : « que les résultats positifs avancés par 1 auteur doivent être considérés comme tout à fait exceptionnels, du moins pour la

diphtérie ». , .

C’est aussi l’avis de Iladley (2) qui vient tout récemment de reprendre l’étude de cette question et qui propose d’ajouter du glycocolle pour obtenir un milieu plus parfait; voici sa formule.

Glycérine

Chlorure de sodium

— de calcium

Sulfate de magnésie

Phosphate bipotassique

Lactate d’ammonium

Gly cocolle •

Eau O- ^ .

3 grammes.

Ûsr,G0

OsqOS

0sr,32

OsqTü

OeqlO

pour 1 00 grammes.

Pour accoutumer certaines races réfractaires à un tel milieu, des quantités croissantes de celui-ci sont ajoutées à du bouillon. Iladley Unit toujours par obtenir des cultures sur la solution glycocollée.

Choix du microbe. — Quel que soit le milieu de culture choisi, on remarque que tous les microbes ne donnent pas une toxine diphtérique également active. En général, on voit que les miciobes \iiulenls qui tuent rapidement les animaux donnent une toxine plus active que des microbes peu virulents ; maison trouve que, pai mi les plus virulents, les uns donnent des toxines très actives, d'autres des toxines peu actives; le pouvoir toxigène n’est pas absolument dépendant de la virulence. La conclusion qui découle de ces observations est que, dans la pratique, on doit rechercher dans les microbes virulents quels sont les plus loxigènes. On fait un choix et on examine ensuite quel est celui qui, en dehors de 1 organisme conserve le mieux ses propriétés loxigènes; parfois on trouve des microbes très actifs lorsqu’ils viennent dêlre isolés et qui, dans la suite, ne conservent pas la fonction toxigène ; il faut donc les éliminer.

(1) Hcgounenq et Doyon, Société de lliologie , 18 avril 1890, p. 4ul.

(2) Philippe B. Madley, Journal of infect . dise aies, supplément du 3 mai 1907, p. 93.

Médic. microbiens, 2' édit. tb

1 1 6 LOUIS MARTIN. — SÉROTHÉRAPIE ANTIDIPHTÉRIQUE.

Modes de conservation du microbe. Quand on a trouvé un bon microbe, bon producteur de toxine, et conservant cette propriété, il importe de legarder en culture en dehors de l’organisme.

Chaque laboratoire a ses méthodes; ce qui prouve, du reste, qu’il n’y en a pas d’absolument parfaites. Nous conseillons avant tout d’éviter les milieuxdans lesquels les microbes produisent des acide-.

Cette règle est généralement observée dans tous les laboratoires, et voici quelles sont les méthodes les plus employées :

Rosenau (1) conseille les ensemencements journaliers sur sérum, sur agar ou sur bouillon.

A l’Institut Pasteur, nous ensemençons tous les deux jours en bouillon.

Malgré ces précautions, il arrive que le pouvoir toxigène diminue; nous indiquerons comment on peut le remonter; mais en général dans tout laboratoire on conserve de vieilles cultures qu'on doit rajeunir par deux cultures successives lorsqu’on veut s’en servir.

Nous employons des cultures sur sérum coagulé ; les tubes sont ensemencés par stries, puis placés à l’étuve à 37° pendant quarantehuit heures. On les retire et on les laisse dans un local à température basse, 10°-12°, et constante. Il faut avoir bien soin de recouvrir ces tubes d’un capuchon de caoutchouc, ou mieux de les fermer à la lampe. On peut aussi employer les vieilles cultures sur bouillon et les rajeunir au moment de s’en servir.

Spronck, usant d’un autre procédé, ensemence sur sérum liquide, qu’il met vingt-quatre heures à l’étuve à 37°, puis conserve la culture en dehors de l’étuve à l’abri de la lumière. Quand on veut reprendre le microbe, il faut le rajeunir; pour cela, on l’ensemence d’abord sur sérum, et de ce sérum dans le bouillon qui doit servir à produire la toxine.

Augmentation du pouvoir toxigène. — Quand un microbe perd une partie de son pouvoir toxigène, on peut l'augmenter par différents procédés. Rouxet Yersin avaient conseillé, pour augmenter la virulence d’un microbe, de l’associer au streptocoque, soit en culture, soit en injections aux animaux ; ce moyen peut servir pour augmenter le pouvoir toxigène. On a aussi de bons résultats en pratiquantdes passages par lesanimauxet en particulier par le cobaye. Enfin nous avons souvent remonté le pouvoir toxigène en plaçant dans le ventre de lapins un sac de collodion rempli de bouillon ensemencé avec du bacille diphtérique ; après quelques passages, le microbe devient très toxigène.

(1) Rosf.nau, The immunity unit for standarizing Diphteriaanlitoxin (ffi/gienic laboratory Huit., avril 190.“, n° 21).