TECHNIQUE PERSONNELLE DE REDUCTION

Devant ces difficultés, et pour ne pas nous engager dans des dosages interminables de chaque métabolite séparément, ce qui aurait d’ailleurs été impraticable vu l'urgence de refaire les dosages chaque deuxième ou troisième heure, nous avons pensé à réduire la molécule à un terme beaucoup plus simple qui serait reproduisible aussi bien à partir de la molécule intacte qu’à partir de ses dérivés d’hydrogénation et, le cas échéant, même d’oxydation. L'idée qui s’imposa fut de couper la molécule au niveau du pont azoïque par un réducteur approprié, assez énergique pour aboutir au stade amine, et pas trop fort pour ne pas endommager la molécule dans ses autres fonctions. De cette facon le dosage se réduirait à un dosage du paminophénylsulfamide, facilement mesurable par une méthode de diazotation. Cependant la question de savoir, si l’autre moitié de la molécule, l'acide triamirnobenzoique, (dorit on sait la fragilité, et qui est 3 fois amine cycliaue) ne viendrait pas perturber les colorations, resta ouverte.

En effet, on ne pouvait pas prévoir, si en scindant le Rubiazol-C intact in vitro et en le colorant en vue de la préparation d’une gamme, la teinte ne deviendrait pas plus prononcée qu'en scindant les résidus dans l’urine où une partie des mo'écules ayant traversé l’organisme se trouve déjà coupée, peut-être avec persistance de la moitié Suifamide mais avec perte plus ou moins importante de la moitié triaminobenzoique, plus fragile. C’est ce que l'expérience devait montrer.

D'abord il a fallu chercher un réducteur approprié. Il est un fait que l’hydrogénation de la fonction azoiïque aboutit surtout au stade amine en présence de réducteurs acides. Nous avons pensé au mckel en milieu chlorhydrique, mais gênés par la coloration verte de son sel qui prend naissance, nous nous sommes tournés tout d’abord vers d’autres réducteurs.

1) L’Hydrosulfite de Sodium a l'avantage de n’apporter en somme aucun ion nouveau dans le milieu urinaire. La décoloration se

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on —

fait après un certain temps, quoiqu'assez difficilement. Mais eri diazotant et copulant au R. IV. après son action, nous n'avons jamais obtenu que des teintes pâles dont la fugacité était due en bonne partie à un excès d’hydrosulfite dans le milieu réactionnel, excès qui continue à réduire le nouveau composé azoique formé. Nous avons tenté par différents moyens (perhydrol, ferricyarure de K, et extraction subséquente au butanol, où ce derrier ne passe pas) d'éliminer cet excès d’hydrosulfite avant de diazoter, mais les résultats ne se sont pas améliorés d’une façon appréciable.

Le chlorure Stanneux, en milieu chlorhydrique, donne une décoloration prompte, mais il est difficile d’éliminer l’ion étain à la fin de la réaction.

L’amalgame de sodium, que nous avons utilisé, s’avérait insuffisant.

L’aluminium en poudre, en milieu alcalin, décolore bien, si ja concentration en Rubiazol-C n'est pas trop élevée, mais le mélänge se récolore superficiellement au contact de l’air. La diazotation, après action de l'aluminium donne tout de même une coloration bien appréciable.

Le zinc en milieu acide n’a pas été retenu à cause de son élimination difficile, due à son caractère amphotère. Après tous ces essais, nous nous sommes adressés au nickel en

milieu chlorhydrique parce que sa manipulation restait la plus simple et en même temps, les résultats les plus nets. La coloration verte de son chlorure, qui d’abord nous avait gêné, nous allait servir par la suite de point de repère pour l'élimination du métal après son action.

Après maints essais nous avons adopté le chemin Suivant :

À 5 cc. de solution de Rubiazol-C on ajoute une petite pincée de poudre de nickel et 1 cc. d’acide chlorhydrique normal. Le mélange est agité de façon que tout le contenu du tube devienne uniformément noir. L'hydrogère se dégage doucement et le liquide se décolore. On laisse agir pendant 10 minutes, comme la poudre de nickel se dépose vite on a avaniage à agiter encore une à deux fois pendant ce temps. Le liquide prend une teinte légèrement verdâtre. Les 10 minutes écoulées, on ajoute 1,5 cc. de soude normale, on répartit bien le contenu du tube et on jette le toui sur un petit filtre. Le filtre retient l’excès de nickel ainsi que l’hydrate qui a précipité. On obtient un filtrat incolore. On rince le tube à l’aide de 2,5 cc. d’eau dist. qui servent en même temps à laver le filtre. On laisse égoutter totalement, puis on jette le filtre, le filtrat est supposé contenir le p-aminophénylsulfamide incolore.

Le filtrat ainsi obtenu ne se récolore plus à l'air, il ne Se recolore pas non plus en ajoutant des oxydants comme le perhydrol. Il semble donc que le stade hydrazoique a été dépassé quantitativement. Ce filtrat obtenu à partir de 10 ec. de liquide (5 cc. sol. de Rubiacol-C, 1 cc. HCi N, 15 cc, soude N,2,5 ec. F20)"sera diazote selon le principe de la méthode de Marshall.

On ajoute successivement :

2 cc. d’acide trichloracétique À 1 cc. de nitrite de sodium 0,1°%/ à température ordinaire. Agiter, laisser 3 minutes.

1 cc. de sulfamate d'NH“ 0,5°/o.

Agiter fortement et laisser reposer 3 minutes. LÉCIR AIN. 0e Aviter:

On attend 10 minutes et on évalue colorimétriquement.

Cette méthode qui comporte une longue série de manipulations présente évidemment beaucoup de causes d’erreur, nous avons trouvé toujours des valeurs concordantes quand nous avons pris les précautions suivantes:

Se servir pour chaque réactif toujours de la même pipeite. Utililiser des entonnoirs de taille identique ou au moins voisine. Choisir toujours la même grandeur pour les papiers filtre. Agiter bien le liquide avant filtration, afin que le passage à l’alcalinité se fasse déjà dans ie tube et non pas sur le filtre, ou plus encore, dans le jiltrat. (Apparition de flocons verdâtres dans le filtrat.) Surveiller bien les filtrations, afin que nulle trace de nickel en poudre ne passe dans le filtrat où son action deviendrait fâcheuse quand par la suite on réacidifie.

Ajuster bien les solutions d'HCI N, de soude N, et d’acide trich-

loracétique 15°/, afin que le milieu récupère à la fin un PH

nettement acide.

En nous plaçant toujours dans les mêmes conditions nos résultats ont toujours été très satisfaisants.

L’élimination du sel de nickel sous forme d’hydrate par la soude, qui vient compliquer les opérations, présente aussi ui avantage. Par alcalinisation ou moment de filtrer on se place dans de bonnes conditions de solubilité pour le p-aminophénylsulfamide qui est mieux soluble en milieu alcalin, caractère qu'il partage d’ailleurs avec le Rubiazol-C.

La question majeure qui subsistait encore était de savoir de quel côté passe l'acide triaminobenzoique, s’il y en a qui persiste, ou bien s’il est détruit au cours des manipulations, ou bien s’il ne réagit pas avec le R. IV. dans les conditions de l'expérience; pour la pra-

tique de nos dosages cette dernière éventualité reviendrait au même que la destruction.

En nous servant de cette méthode nous avons essayé de préparer une gamme. Une solution à 0,010°/ de Rubiazol-C, fraîchement préparée, servait à faire nos dilutions. Pour bien solubiliser le produit la solution était préparée de façon à contenir 3 cc. de soude N pour 100 ce. d'urine au dixième.

De cette solution nous prélevons 10 ec. qui sont dilués au tiers avec 29 cc. d'urine au dixième. Cette dilution nous donne une première série — Série À

Avec 10 autres cc., nous préparons de la même façon une deuxième dilution au quart. — Série B

Avec chacune des deux dilutions À et B, nous préparons une gamme de tubes de façon que le premier contient :

DCE, —— 4,5 cc. urine 1/10 le Second. L ec. — 4 cc. urine Î/10 le troisième 1,5 cc. 3,5 cc. urine 1/10 et ainsi de suite jusqu'au dixième qui contient alors 5 cc. + 0 cc. d'urine au dixième, donc uniquement la dilution.

Chaque tube est traité de la façon décrite et les colorations sont évaluées au photocolorimètre de Pulfrich, avec le filtre 12 qui est dans le bleu et avec de l’eau distillée comme terme de comparaison.

Nous avons réuni dans le tableau IV et la figure I les valeurs de cette expérience.

MABEEAURINV Série A.

: Conc. Conc. en sul- LE = x No | Dil |Urine| en R Vos fanilamide [2 5 € mr 1/3 gr. ‘lo absolue gt. % S 2373 (=ÿ CG:

l | 12 | 41} | 0.00033 | 0.0000165 | 0.000165 5 | 4,5 2 l 4 0.00066 0.000033 0.060033 10 8.5 3 11/2 31/2 | 0.000990 0.0000495 0.000495 15 (528) | 4 2 $ 0 00132 0.000066 0.000€6 20 1728 | 5 21/2 21/2 | 0.00165 0.0000825 0.000825 25 AE 6 5 2 0.00198 0.000090 0.000990 30 26 7 31/2 11/2 | 0.00231 0.000115 0.001175 35 30 8 4 l 0.00264 0.000132 0.00132 40 34.5 9 41/2 1/2 | 0.00297 0.000148 0.00148 45 39 10 5 0 0.0033 0.000165 0.00165 50 43 Re —

© ot

Série B.

Conc en | Conc. en sul- LE L LE ù No | Dil |Urine Rub-C Teneur fanilamide | 5 <]£ 5 & 1/4 gt | absolue er. 0% S 27 = 3 [= ce ANRT 0.00025 | 0.000125 | 0.060125 | 4 | 3.5 2 4 | 0.00050 | 0 000025 ! 0.006025 | 8 | 65 3 | 142 | 312 | 0.00075 | 0.0000:75 | 0.000375 | 11.5 | 9.5 | 25 Me 000 0.00005 | 0.0005 ire 5 | 212 | 2142 | 0.00125 | 0.0000625 | 0.000625 | 19 l16 | ls lle conne evo IC ME 7 | 32] 112 | 0.00175 | 0.0000875 | o oous75 | 26.5 | 22.5 Enr 1 [o.on2 | 0.000: 0.00! 30 | 2 9 | 4 12 | 0.00225 | 0.000125] o.oo1125 F34 [20.5 000125 3751162

Les valeurs photocolorimétriques indiquées «dans ce tableau représentent une moyenne des valeurs obtenues dans une série d'essais.

Êlles se placent sur une ligne nettement définie et nous donnent la preuve que notre manière de procéder est bien utilisable. Il faut néanmoins relever que les valeurs qui correspondent au tube 10 de la série À et à des concentrations encore plus fortes ont tendance à devenir trop faibles. La meilleure appréciation se trouve entre les valeurs photocolorimétriques 10 et 45 ce qui correspond à une concentration en p-aminophénylsulfamide de 0,00033 gr°/o et 0,0015 gro, ce qui revient grossièrement aux concentrations de 0,004 gr ‘°) et 0,008 gr'/ de Marshall, vu que cet auteur travaille sur un volume 5 fois plus faible. En effet Marshall part d’un ec. tandis que nous utili- SONS 5 CC. pour avoir un volume plus important au moment de la filtration.

Si nous multiplions les valeurs que nous indiquons comme valeurs-limite d’une bonne appréciation par 5, en les assimilant ainsi aux valeurs de Marshall, nous aurons :

0,00033 X 5 — 0,00165 gr°/o D'OUISMENS — 0,0075 gr°/o

Dans le tableau IV nous indiquons la concentration en p-aminophénylsulfamide, nous voulons exprimer par là, la quantité de paminophénylsulfamide qui prend naissance par réduction de la quantité de Rubiazol-C indiquée dans la même ligne, d’après le calcul:

1 gr. de Rubiazol-C fournit 0,50 gr. de p-aminophénylsulfamide, le poids moléculaire du Rubiazol-C étant 335,3413, celui du paminophénylsulfamide 170,1906. On trouvera par Simple division: