IL. PAR DIAZOTATION

1) Méthode de Marshall.

La méthode de Marshall s’adresse à la fonction amine du sulfamide, qui est diazotée et copulée en milieu acide, au chlorhydrate de l’x-naphtyldiéthylpropylènediamine ou réactif IV de Tréfouel ou simplement R. IV. La coloration rouge qui apparaît, est dosée directement par colorimétrie. Cette coloration rouge est très forte et donne à la méthode toute sa sensibilité. En effet la méthode présente un optinum pour les concentrations en sulfamide comprises entre 0,004 et 0,008°/. Plus haut, la coloration est trop foncée et ne peut plus être évaluée avec certitude, plus bas elle devient vite trop faible. Avec ces faibles concentrations les mesures deviennent médiocres, parce que l'urine dépourvue de sulfamide et traitée selon cette méthode donne une légère coloration rose qui se produit avec toutes

les urines, elle est due à des substances diazotables qui s’y trouvent et aui varient d’une émission à l’autre. Cette difficulté est cependant facilement tournée par le fait de la forte teinte que le réactif donne avec le sulfamide, teinte qui oblige à diluer l’urine quelquefois jusqu'au centième.

Il existe néanmoins un tableau correctif pour cette méthode, où l'on trouve la valeur à défalquer pour une dilution urinaire donnée.

Protocolle:

À 1 cc. de la dilution appropriée d’urine on ajoute 2 cc. d’acide trichloracétiqtie à 15°/o et 7 ec. d’eau. On diazote à température ordinaire avec 1 cc. de solution de nitrite de sodium à 0,1%, et on laisse agir 3 minutes. Ce temps écoulé on ajoute 1 ec. de solution de sulfamate d’ammonium à 0,5°/ et on agite énergiquenient. On attend 3 minutes jusqu'à ce que le dégagement gazeux ait cessé, puis on mesure dans le tube 1 cc. de la solution à 0,1% de R IV. et on agite légèrement pour bien répartir. Le mélange se colore en rouge, la coloration est maxima après 10 minutes et reste Stable pendant 5 à 8 heures à l’obscurité, pendant une heure et demie à la lumière. On mesure soit en comparant à une gamme fraîchement préparée, soit en se servant d’un colorimètre.

L’addition de sulfamate d’ammonium a pour but de stabiliser la coloration et d'éviter des colorations parasites provoquées éventuellement par un excès de nitrite. Le sulfamate détruit le nitrite en excès. Si l’on procède en l’absence de sulfamate on n'arrive généralement pas à la belle coloration franche que donne le R IV. en sa présence, aussi voit-on la coloration obtenue fléchir beaucoup plus vite.

Il existe des variantes de la méthode de Marshall pour le dosage des sulfamides dans le sang et dans le liquide céphalo-rachidien. Le dosage dans le sang se fait après destruction préalable de l’hémoglobine par une solution de saponine à 0,05°/. Dans le liquide céphalo-rachidien on dose après addition d’acide trichloracétique qui précipite les protides aui s’y trouvent normalement, et filtration. On se met ainsi dans les meilleures conditions de clarté et de lisibilité colorimétrique.

Ceci dit, revenons au mode opératoire dans le cas d’une solution urinaire. Par la technique que nous venons de décrire plus haut on mesure la partie sulfamide libre seule, la partie conjuguée où l’amine est dissimulée par acétylation, échappe. Pour saisir également cette partie acétylée, il faut avoir recours à une hydrolyse, aui dans la méthode de Marshall est réalisée en ajoutant à 2 ec. de dilution uripaire 2 cc. d'acide chlorhydrique normal, et en portant au B. M. bouillant pendant une heure. On complète au double avec de l’eau

et on filtre, du filtrat on prélève 1 ec. et on continue comme pour la mesure du terme libre, c'est à dire, en ajoutant successivement, et en respectant les différents temps de réaction:

7 cc. d'eau, 2 cc. d’acide trichloracétique à 15°,

1 cc. de nitrite de sodium à 0,1°/o, 1 cc. de sulfamate d’ammonium

à 0,5°/o, 1 ec. de R IV. a 0,1%).

En présence de dérivé acétylé une nouvelle partie de sulfamide est entrée en combinaison avec le R IV.; la coloration a augmenté. Par différence avec la coloration de l'échantillon non hydrolysé on trouvera facilement la teneur en dérivé acétylé.

A côté de la méthode de Marshall il y a d’autres méthodes par diazotation, ce qui les distingue entre elles c’est surtout le choix de la copule. Nous les passons brièvement en revue, pour discuter dans le chapitre suivant du choix qu'il a fallu faire parmi ces diverses méthodes dans le cas spécial de la mesure de l’Hémikrèse et de la Protorrhée du Rubiazol-C et de ses métabolites. Pour de plus amples détails nous renvoyons toutciois à l'ouvrage de MM. Sartory et Meyer (27) et surtout à la thèse de M. Fasciaux (28) où l'on trouve toutes ces méthodes décrites en détail, ainsi qu’une foule de méthodes pour ia reconnaissance quaiitative de nombreux sulfamides.

2) Méthode de Marshall modifiée par Martin.

Le R. IV. est remplacé par une soiution acétono-alcoolique de diméthyl-2-naphtylamine.

3) Méthode de Paget.

Après diazotation en milieu trichloracétique, cet auteur emploie le thymol alcalin (thymol à 1°/ dans la soude normaie) comme agent de copulation, et il compare la coloration jaune à une gamme fraîchement préparée. La copulation se fait donc en milieu alcalin, l'excès de nitrite est détruit par une solution d’urée à 10/0.

4) Méthode de Paget et Dupont.

C’est une modification de la méthode précédente. L'agent copulateur reste le thymol alcalir. Mais pour le dosage des sulfamides dans le sang cette méthode propose comme agent de défécation une liqueur ferrocyanozincique, constituée par deux solutions, une solution À et une solution B.

Solution A : Ferrocyanure de potassium à 15 ‘/o

Solution B: Acétate de zinc à 11,2%

La solution B peut être remplacée par une solution de sulfate de zinc à 15°.

5) Méthode de Fuller.

Elle prescrit le 8 -naphtol alcalin (2,5 gr de B -naphtol, soude normale 25 cc., eau distillée q. s. p. 100 cc.) qui donne également une

coloration jaune. On compare à une gamme. La copulation se fait donc également en milieu alcalin.

6) Méthode de Werner

On emploie le réactif d'Ehrlich, la diméthylaminobenzaldéhyde en milieu strictement neutre. On neutralise par la soude N/4. La coloration jaune apparaît tout de suite. On peut comparer la coloration à une gamme préparée avec de bichromate de potassium qui a l'avantage d’être conservable.

Il, AUTRES MÉTHODES.

Les méthodes que nous énumérons ici s'adressent pour la plupart à des solutions de sulfamides hautement purifiées, et ne sont guère utilisables pour le dosage de ces corps dans les milieux complexes comme les humeurs où elles deviendraient vite onéreuses et perdraient de leur précision, par les purifications, qu’il faudrait nécessairement entreprendre.

1) On acidifie une partie aliquote de la liqueur par HCI et on titre avec une solution connue de nitrite de sodium en présence d’iodure de potassium. Le sulfamide est diazoté et l’exès de nitrite se traduit par une libération d’iode qui est détecté par un ruban de papier amidonné. (American Medical Association)

2) À une solution de sulfamide alcalinisée par la soude, on aioute du bromure de potassium en excès et une quantité connue de bromate de potassium N/10. Le brome libéré se fixe sur le noyau. Après 15 minutes on acidifie par 10 cc. d'acide chlorhydrique et on ajoute un excès d’iodure de potassium. Le brome qui n’est pas fixé déplace l’iode quantitativement. On continue par iodométrie.

3) Après défécation tungstique on laisse agir le B -naphtoquinonesulfonate de sodium qui forme un composé coloré en rouge-orange avec le sulfamide.

4) Destruction de la molécule et oxydation du soufre en sulfate par une ébullition de 35 minutes sous réfrigérateur ascendant en présence de permanganate de potassium en milieu alcalin. On clarifie avec de l’acide chlorhydrique et on ajoute une solution de chlorure de barium. Le sulfate filtré et lavé est dosé gravimétriquement.

5) Dosage de l'azote, après kielldalisation préalable, avec l’appareil de Parnas et Wagner.

Parmi toutes ces nombreuses méthodes il était bien difficile d’en trouver une, applicable au dosage du Rubiazol-C, et surtout adaptable aux conditions de dosage en série dans un minimum de temps, demandé d’une part par l'intérêt qu’on a à prélever les urines aussi Souvent que possible, et d'autre part, par l’altérabilité de la solution urinaire elle-même.

Nous nous heurtions à trois difficultés majeures :

1) Une bonne partie des méthodes ne sont pas applicables au Rubiazol-C qui en sa qualité de sulfamide azoiïque coloré est assez éloigné du p-aminophénylsulfamide qui a servi de base pour l'élaboration de la plupart de ces méthodes.

2) Les urines, après ingestion de Rubiazol-C ne sont guère colorées, donc impossibilité de doser le produit colorimétriquement après extraction par un solvant approprié. (voir page 27).

3) Le Rubiazol-C. coloré lui-même, ne se laisse point diazoter.

En outre, il fallait trouver un moyen pour doser dans les urines tout le «bloc rubiazolique», c'est à dire, autant que possible des dérivés de dégradation.