COLORATIONS
1° Protéines :
Deux colorations sont surtout employées : le bleu de bromophénol (55, 85, 23, 36, 46) et le noir d’amide 10 B.
La première nécessite un coefficient de correction car il colore plus fortement la fraction albumine, ses résultats concordent moins bien avec l’électrophorèse en milieu liquide (23).
Des techniques d’évaluation après élution ont aussi été employées (55). WUNDERLY a démontré que 70 % au maximum des protéines étaient éluées (86) et que ce taux était variable.
Le noir d’amide semble être le meilleur (77, 83). La technique employée est celle de GRASSMANN, HANNIG et KNEDEL (29, 2, 43).
Les bandes séchées sont immergées dans le colorant (10 g pour 1000 cm$ de méthanol acétique à 10 %) pendant 10 minutes à raison de 30 ce pour 5 bandes dans un bac animé d’un mouvement de bascule grâce à un moteur dont la vitesse est de deux tours minute.
Le colorant ne doit être utilisé qu’une fois, car lorsqu'il est chargé de tampon l’affinité des protéines pour
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le colorant varie. Les bandes sont ensuite lavées par quatre bains successifs de méthanol acétique à 10 % pendant 10 minutes.
Les bandes sont essorées puis placées sur un papier filtre sec. Elles peuvent être stockées en attendant la photométrie.
2° Les glycoprotéines :
Nous avons employé la méthode de GOMORI (93) et HOTCHKISS (95) selon la technique de KOIW et GRONVALL (45) modifiée (35).
Les polysaccharides oxydés par l'acide périodique donnent naissance à des polyaldéhydes qui recolorent le réactif de SCHIFF. On ne connaît pas exactement la nature des substances qui, dans ces conditions, donnent naissance à des fonctions aldehydes.
Le bain réducteur dont HOTCHKISS préconise l’emploi après l’oxydation périodique a été supprimé car, à la suite de LISON (50), GROULADE a remarqué qu'il diminuait nettement l’intensité de la coloration obtenue. Il est remplacé par un rinçage à l’alcool sulfité.
Réactifs :
1° Acide périodique : 6 g; Eau distillée : 150 cc; M Acétate de Na — : 75 cc; J Ethanol : 500 ce,
à conserver au frigo à +4°.
2° Fuchsine basique GRÜBLER : 2 g; Eau distillée bouillante : 400 cc.
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Laisser refroidir puis :
Acide chlorhydrique 2 N : 10 cc; Métabisulfite de K RP : 4 g.
Boucher et laisser une nuit à lobscurité à 44° C. Mélanger à 1 g de charbon activé pulvérisé et filtrer. Ajouter 30 ce d’ ot chlorhydrique 2 N. Le liquide se décolore progressivement.
Il est conservé dans un flacon bouché à l’émeri à +4”. Au moment de l’emploi, ce réactif est dilué à volume égal avec de léthanol à 95°. Cette modification rend la réaction plus sensible.
— Eau distillée sulfitée de rinçage; Eau distillée : 1 000 cc; Acide chlorhydrique concentré RP : 10 cc; Métabisulfite de K RP : 4 g A conserver soigneusement bouché.
Technique : Les bandes séchées à 37° sont rincées à l'alcool éthylique pur puis immergées pendant 5 minutes dans le bain d’acide périodique.
Les bandes sont ensuite rincées à l’aide du premier bain alcoolique additionné du quart de son volume de solution sulfitée.
La coloration dans la solution de fuchsine alcoolique dure 45 minutes. Elle est suivie de 5 lavages de 5 minutes dans la solution sulfitée de rinçage. Les bandes sont ensuite deshydratées par deux bains d’alcool pur. Après essorage elles sont séchées à l'air.
3° Lipoprotéines :
La technique de SWAHN (78) a été (OO Colorant :
Noir cerol B : 0,5 g; Alcool éthylique : 250 cc; Eau distillée : 250 cc.
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Le noir cerol B est dissout dans un peu d’éthanol pur, puis dilué à 250, et l’eau distillée est ajoutée peu à peu en agitant. Le mélange est placé dans un ballon muni d’un réfrigérant à reflux et porté à l’ébullition pendant 45 minutes.
Il est refroidi puis filtré.
Coloration : 5 bandes sont immergées dans 50 ce de colorant pendant une heure dans un bac animé d’un mouvement oscillant, comme pour toutes les colorations.
Aussitôt après la coloration les bandes essorées sur papier filtre sont immergées dans la glycérine jusqu’à la photométrie.
RAYNAUD fixe les lipides à l’aide d’une solution alcoolique de gomme laque (67). D’autres colorants ont été préconisés : le Cereschwartz Pt C 2683 Bayer par LORENZINI (52); lOïl red O par DURRUM, PAUL et SMITH (89); le bleu Ciba par WUNDERLY et PEZOLD (106).
DENSITOMETRIE
Les bandes qui ont été mises sous presse pour assurer la planéité sont imprégnées d'huile de vaseline pendant 20 minutes (protéines et glycoprotéines) ou de glycérine (lipoprotéines).
L'appareil (ELPHOR) muni d’un filtre orange pour les protéines. et les. lipoprotéines et d'un: filtre vert (WRATTEN, 55) pour les glycoprotéines donne millimètre par millimètre la densité optique des taches.
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