DANS LE CORPS DES MOUSTIQUES

[.es moustiques qui peuvent être infectés par Filnrin nocturna sont nombreux et appartiennent à des genres différents. On connaît parmi eux : Culex fatigans, Wiedemann ; Aiiopheles Rossii, Giles ; Stego7nyia fasciaia, Fahricnis-, certains Panoplites \ A7iopheles f7i7iestus, Giles; Anoplieles coslalis, Lœw ; A7iopheles 7iigev7'i- 771US, Giles.

Pour bien comprendre et retenir le cycle évolutif de la filaire de Bancroft, dont les embryons se développent dans le corps du moustique, et les formes sexuées se conjuguent dans le corps de l’bomme, il faut se rappeler que la filaire, à chacun de ses étals, a une prédilection marquée pour le tissu interstitiel ou lymphatique, et qu’elle n’habite le sang que transitoirement.

Si l’on examine l’estomac d’un moustique qui vient de piquer un malade atteint de filariose, au moment où le sang péri|)bérique de

ce malade contient des embryons de filaire fc'està-dire la nuit, en règle générale), on voit les embryons bien vivants s’agiter au milieu des globules rouges. Ils ont encore les mêmes caractères que dans le sang de l’homme : longueur de 3oo g sur largeur de 8 g, présence d’une gaine striée transversalement et de deux tacbes claires, une antérieure en V, et une postérieure peu marquée.

Au bout de quelques heures, le sang est hémolvsé dans l’estomac du moustique, il prend un aspect poisseux. Cet état nouveau du sang semble exciter l'embryon qui s’agite plus vivement et, à l’aide d’un stylet placé à son extrémité antérieure, perce sa gaine. On voit donc à ce moment dans l’estomac du moustique des embryons nus, dépouillés de leurs gaines, animés de mouvements rapides, au milieu des globules sanguins, de quelques embryons morts qui commencent à être digérés, et de gaines vides. Les embryons nus sont naturellement beaucoup plus mobiles; quand ils sont encore dans leur gaine, leurs violentes contorsions ne les font pas changer de place, tandis qu’une fois nus, ils présentent des mouvements de translation, traversant rapidement le champ du microscope.

Si l’on examine l’estomac d’un moustique encore un peu plus tard après la [liqêre, on n’y voit |)lus d’embryons, malgré la présence d’un

ÉTUDK DES MOUSTIQUES

grand nombre de gaines vides. Mais si l’on examine le tissu musculaire thoracique, qui entoure l’estomac, on voit qu’il a été envahi par ces embryons, qui ont grandi et se sont modifiés {fig. 34). La filaire a regagné le tissu inter-

/m<7. 34. — DifTérenls «tlades de l'éroUition de l’embryon de hlaire (D'après Mansoii).

sliliel, son habitat de choix. Elle s’y meut languissamment. Alors commence une métamorphose qui dure de i (> à 20 jours, suivant la température (.Manson). La taille de la Pilaire augmente jusqu’<à atteindre 1 millimètre à 1 mil-

limètre et demi de longueur sur 3o jj. de largeur ; la filaire possède à présent un tube digestif, sa queue a pris une forme trilobée parliculière.

A ce moment, les blaires émigrent à travers la cavité générale du moustique : on en voit qui vont se loger au milieu des œufs, dans la partie postérieure de l’abdomen. Mais le plus grand nombre, parcourant le tissu connectif du pro-

35 — Filaire dans la trompe d’un moustique (D'après une préparation de Low).

thorax, du cou, de la tête, s’engage dans celui du labium, qui est assez considérable. On peut voir ces jeunes blaires dans le labium des moustiques très longtemps après le moment où ils se sont infectés; elles sont parfois au nombre de cinq ou six dans le même labium, allongées ou légèrement recourbées, les tissus autour d'elles sont boursoullés, et il est évident qu'ils peuvent être transpercés facilement par les filaires {fig, 35). Cej)endant Manson a re-

ÉTUDE DES MOUSTIQUES

marqué que, chez des moustiques ayant sucé plusieurs fois des fruits, elles n’avaient pas quitté le labium. Elles paraissent donc distinguer entre une proie végétale ou animale.

Comment les filaires quittent-elles le moustique pour infecter l’homme? On n’a pas encore la preuve absolue de cette transmission, et les expériences de Grassi et Noé, faites avec une filaire voisine de celle de l’homme : Filaria immitis, parasite du chien, ne sont pas exemples de critique. Toutefois, quand on considère la façon dont pique un moustique, et que l’on observe la façon dont sont logées les Blaires dans le labium, il paraît évident que les choses se passent comme il suit : Lorsqu’un moustique pique, il n’enfonce pas sa trompe entière dans la peau ; ce sont les deux maxilles et les deux mandibules qui plongent leurs extrémités acérées comme de petits couteaux à travers l’épiderme, ils entourent le tube fragile formé par le labium et l’hypopharynx, par où le moustique inocule immédiatement son venin salivaire d’abord anesthésiant, puis irritant. Le labiumdurant la piqûre ne sert qu’à diriger l’apijareil piquant et aspirateur, à peu près comme l’index d’un chirurgien ponctionnant une ascite guide le trocart [fig. 36 et 37). Naturellement, le labium étant aussi long que les autres stylets de la trompe et étant le seul à ne pas pénétrer dans la peau, il se re-

courbe, sa pointe seule appuyant sur la peau fortement. Il est très facile à ce moment aux lilaires de percer le tégument distendu du la-

Fig, ~ Schéma monlrant le moustique piquant.

bium, elles se trouveront immédiatement dans la plaie, c’est-à-dire dans le tissu cellulaire, où

Fig, ’Si, — Par «^oinparaisoii, schéma monlratil la main <lu chirurçien ponctionnant. ^

elles chemineront aussitôt, gagnant les vaisseaux lymphatiques.

A partir de ce moment, on peut suivre les étapes des lilaires. Dans les vaisseaux lympha-

ÉTUDE UES ilOUSIIQUES

tiques, elles deviennenl adultes (on les appelle Filaria hancrofli à l’état adulle, tandis que le nom de Filaria noclurna est employé pour désigner les embryons), elles s’y conjuguent, les femelles y pondent, et les embryons éclos des œufs finissent par tomber dans le courant sanguin, restant le jour d»ns les gros troncs internes et circulant la nuit dans le sang périphérique.

chapitur IX

TECHNIQUE DE LA PRÉPARATION DES MOUSTIQUES POUR SUIVRE L’ÉVOLUTION DES PARASITES : IIÉMAMIBES ET PILAIRES

Les moustiques femelles étant les seuls qui piquent, il n’est f|uestion que d’eux dans le chapitre (]ui suit.

La première [)arlie du problème consiste à conserver longtemps les moustiques vivants, la deuxième à leur faire piquer les malades, ce (|ui n’est pas toujours aussi facile que l’on [)eut croire. Il s’agit ensuite de faire les dissections et les coupes qui permettent d’étudier l’évolution des parasites.

.\) 1. Conservation des moustiques vivants. — Il faut pouvoir conserver, durant plusieurs mois, les moustiques infectés par les filaires et môme ceux qui sont infectés [)ar des hémamibes, par exemple, lorsqu’on veut savoir à quel moment les sporozoïtes disparais.sent des

Kdm. «t Kt. S«H0»ST — Étude de» Moustiiiue»

lÜ

ÉTUDE DES MOUSTIQUES

glandes salivaires. On les garde dans des cages comme celles que nous avons décrites. On a soin de munir la cage d’eau propre, car les moustiques ont besoin de boire, et d’alimcnis sucrés. Parmi ceux-ci, ce sont les fruits qui conviennent le mieux : bananes, raisins.

Eviter les fruits acides, il paraîtrait que les moustiques qui s’en nourrissent échappent à l’infection hémamibienne. 11 faut nettoyer avec soin les fruits que l’on met à leur disposition, car on trouve souvent sur eux de petites araignées qui font de grands ras'ages dans un élevage de moustiques. Si l’on met des feuillages dans les cages, nous conseillons de les stériliser à l’eau bouillante auparavant, toujours à cause de la présence fréquente de ces petites araignées.

A défaut de fruits, on peut mettre du miel, des confitures ou de l’eau sucrée dans une petite soucoupe. On peut conserver ainsi des Culex durant des mois. Les Anopheles ont besoin de sucer du sang de temps à autre. On place, à cet effet, un oiseau plumé sur le dos ou un petit mammifère épilé (lapin, cobaye), dans une petite cage, comme nous l’avons indiqué à la p. i«4- Les souris, qui sont éveillées la nuit, se défendent trop bien des moustiques, et réussissent toujours à en tuer quelques-uns ; il ne faut pas les employer.

ÉTUKE DES PARASITES 147

2. Poui' faire piquer les moustiques. — Lorsque l’on veut faire piquer des moustiques, il faut les soumettre pendant quelque temps à une température assez élevée. On les habitue graduellement à des températures croissantes, et finalement on les laisse quelques jours à 24- 3o“. Ils piquent alors très volontiers. Il ne faut pas les porter trop brusquement à une forte chaleur, il en mourrait un certain nombre.

Pour faire piquer un malade par des moustiques, on applique une petite cage, comme celles que nous avons décrites, contre la peau de son avant-bras, ou micu.v encore, on fait introduire au malade

Fiij. 38.

la main entière dans .Manière de faire piquer un malade

la cage et on pose une p“'' >"û«atiques.

ligature sur le manchon, au niveau du poignet, au moment d’un accès quand il s’agit d’un paludéen, la nuit, quand il s’agit d’un malade à (ilaires {fig. 38).

Il faut éviter que la peau ait la moindre odeur, les moustiques sont très sensibles aux odeurs, comme le remarquait déjà Réaumur.

Il arrive souvent que les moustiques refusent de piquer aux moments propices, on enijiloie alors dilîéreiits artifices pour les y forcer. On se sert parfois, à l’étranger, d’une petite pince qui

ÉTUDK DES MOUSTIQUES

saisit les ailes des moustiques et avec laquelle on les maintient sur la peau jusqu’à ce qu’ils piquent. Mais nous craignons que la pinre ne froisse les ailes d’un insecle aussi délicat, et pour faire piquer les moustiques sans les molester, nous nous servons d’un autre dispositif que l’on peut préparer soi-même. C’est un tube de verre très court, dont l’extrémité inférieure est recouverte par un morceau de mousseline et qui porte à son autre extrémité un long bouchon que l’on peut enfoncer à frottement dur dans le tube. Le moustique une fois introduit dans ce tube, on pousse avec précaution le bouchon, comme le piston d’une seringue, de façon à réduire

p.quer le. mous- de plus en plus 1 espacc ou peut

t'mas se mouvoir le moustique (/îÿ! Sg).

On arrive ainsi à immobiliser celui-ci contre la mousseline. On applique alors l’extrémité du tube coilîée de cette mousseline contre la peau du malade, la trompe qui passe à travers les mailles est maintenue appuyée sur la peau, le moustique se décide le plus souvent à piquer.

Naturellement, il faut s’assurer, avant de faire piquer un malade, qu’il a des parasites dans le sang.

rUj. 39.

KTUDE DES PARASITES

D'après R. Riige, on ne doit pas faire sucer à des Culex du sang très riche en Proteosoma, l’infection est trop violente, et les moustiques meurent avantque les parasites aient eu le temps d’évoluer. Il faut avoir soin de ne pas administrer de quinine au paludique qui doit être piqué. Pour avoir des chances de voir se développer des zygotes chez les Anopheles (\m ont piqué un paludique, il faut avoir vu des llagelles dans le sang de celui-ci au moment des piqûres. Enfin, pour infecter les moustiques avec des filaires, il faut naturellement les faire piquer la nuit.

Les moustiques qui ont piqué un malade sont replacés dans une cage spéciale, une des grandes cages que nous avons décrites, quand ils sont nombreux, ou qu’on veut les garder longtemps en vie, ou bien dans de simples flacons coiffés de mousseline, dont le fond est [)lein d’eau, avec un bout de liège pour servir de llotteur, et quelques fruits pendus le long des parois. On a soin de coller sur le flacon une étiquette portant les indications utiles; date et heure de la piqûre, nom du malade ou numéro de l’animal eu ex|)érience, état du malade (stade de l’accès : frisson, chaleur, ou sueur) quantité de parasites dans le sang. Pour avoir ce dernier renseignement, nous avons adopté le procédé suivant : Une goutte de sang est placée entre lame et lamelle, et exami-

KTIJDE DES MOUSTIQUES

IHO

née avec l’objectif à immersion ; nous comptons le nombre des parasites vu en deux minutes, montre en main. Nous estimons cette méthode préférable à celle qui consiste à compter les parasites par cbamp de microscope, car ainsi le terme de comparaison est très variable, suivant le degré d’étalement du sang, tandis qu’en deux minutes, on examine à peu près toujours la môme quantité de sang, quel que soit son étalement.

On peut encore employer un autre procédé pour connaître approximativement la quantité de parasites inoculés; ce procédé indiqué autrefois par Laveran et recommandé dans ces derniers temps par R. Ross, est aussi utile pour le diagnostic rapide du paludisme chez I homme. II consiste à colorer, avec une couleur basique, du sang dont l’hémoglobine a été dissoute ; dans du sang de mammifères, il n’y a alors de coloré que les parasites et les noyaux de leucocvtes. Par conséquent, il n’y a pas lieu d'étaler le sang, on peut examiner sans inconvénient une épaisse couche de sang, puisque les globules rouges seront incolores. Tandis que la quantité de sang que l’on peut étaler sur une lame, de la manière ordinaire, ne dépasse jamais i millimètre cube, on peut mettre sur une seule lame vingt millimètres cubes de sang non étalé. On a donc la possibilité d’examiner sur une lame une goutte

ÉTUDE DES PARASITES

unliére île sang, sans grande faligiie. On peul ainsi facilement compter les jiarasites du sang contenus dans une goutte de sang sensiblement de même volume que celle que le moustique a ingurgitée. Yoici commenton procède: on laisse tomber une goutte de sang sur une lame, on ne l’étale pas, et on laisse sécber sa?is la fixer. On traite ensuite par une solution aqueuse d’éosine qui dissout et enlève rhémoglobine, puisque celle-ci n’est pas fi.\ée('). On lave à l’ean et on colore par une solution faible de bleu de méthylène. On lave à l’eau, pour enlever l’excès de bleu, on laisse sécber et on monte au baume.

11 est évident que ce procédé ne peut pas être employé pour le sang d’oiseau, dont les globules rouges ont des noyaux qui possèdent les mêmes réactions colorantes que les noyaux des leucocytes.

Nous jugeons utile de rapjieler ici les mélbodes de coloration par le mélange bleu de métbyléne-

(< Ruge emploie, pour dissoudre riiéinoglobiiie, le mélange suivant :

Formol y. ce.

Acide acétii| ne o, >

Kau distillé.-' loo

i(ui a l'avantage de fixer les élénienls cellulaires [)ar le formol alors ([ue l’acide acétique enlève l’iiémoglobine. Colorer ensuite par la méthode ib; Laverau ou par la solution de Gicmsa.

Étude des moustiques

éosine, qui sont les méthodes de choix pour la coloration du sang en général, des hémamibes, et des sporosoïtes. Farces procédés, les filaments chromatiques sont teints en violet rouge, les karyosomes des parasites en rouge vif, le protoplasma des parasites en bleu pâle, le protoplasma des cellules des vertébrés en teintes variées douces, celui des globules rouges en orange clair. Le principe de ces colorations est dû à Romanowsky. On emploie les modifications suivantes :

Méthode de Laveran ;

A) Nitrate d’argent . ... i gramme

Eau distillée loo

Dissoudre. Précipiter de l’hydrate d'argent par de la soude. Laisser déposer le précipité brun, le lavera plusieurs eaux. Finalement décanter l’eau surnageante pour n’avoir que le précipité lavé de la soude.

D) Bleu de méthylène médicinal de Hôchst i gramme Eau distillée loo

Ajouter B à A. Laisser mûrir au moins lôjours (c'est le bleu à l’argent, d'après Borreh. D'autre part, on a une solution d’éosine à l’eau de llocbst au 1 1000 (camiibre) et une solution de tanin à l’éther à 7o (camphre) ou bien de l’orangetanin de Grübler,

Les lames fixées à l’alcool absolu (lo minutes

ÉTUDE DES PARASITES

à 1 heure suivant la vieillesse de l’élalemenl) sont placées dans des boîtes de Pétri, face en dessous (en glissant sous elle une mince baguette de verre). On prépare, au moment de s en servir, le mélange suivant qui est jeté sur les lames :

Eosine au i 'looo 4 ce.

Eau distillée 6

Bleu à l’argent de Borrel i

.\u bout de 5 à 20 minutes, la coloration est faite, ce que l’on constate d’abord par l’apparition d’un voile irisé à la surface du mélange colorant.

On lave les lames à grande eau, on les traite par la solution de tanin (quelques secondes à quelques minutes suivant les cas). On relave à l’eau. On laisse sécher et on monte au baume.

On peut aussi se servir, au lieu de bleu de méthylène, du bleu azur qui en est tiré. Voici la formule de Xocht ("résultats inférieurs à cou.x de la méthode de Laveran, pour la coloration des hémamibes des oiseaux : mais résultats très bons pour l’hémamibe du paludisme, les piroplasmas).

1® Fixer dans l’alcool absolu (1/2 heure à 1 heure).

Préparer les deux solutions suivantes :

^ \ Azur de méthyle oS'',8o

t Eau distillée

t Éosine WG

( Eau distillée

ETUDK DES MOUSTIQUES

Mélanger, aumomenl de s'en servir, 20 cenlimèlres cubes de 13 et 2 cenlinaètres cubes de A.

Laisser agir une demi-beure.

Laver à grande eau. Traiter par la solution de tanin à 5 ou l’orange-tanin (quelques secondes à quelques minutes). Laisser sécber. .Monter au baume.

On se sert couramment dans les laboratoires de la solution de Giemsa, dont l’emploi est Irès commode. Fixer dans l’alcool absolu. Puis préparer :

Solulion de Giemsa i goutte

lüau distillée 20 gouttes

Colorer pendant 20 minutes. Laver à l'eau. Sécber.

Cette solulion contient les principes actifs colorants de la méthode de Romanowsky.

13) Technique de la préparation des moustiques pour suivre l’évolution des Hémamibes('). 1“ Disseetioii de l'estomac {fi g. 4o). — On peut faire cette préparation à

(I Pour observer la fécondation des gamètes femelles par les microgamètes, il n’est pas besoin d'examiner des estomacs de moustiques avant sucé du sang parasité. 11 suflil d’observer entre lame cl lamelle nue goutte de sang à laquelle on a ajouté soit un peu d’eau ])liysiologique ou même d’eau ordinaire, soit du sérum d’un animal quelconque. La dilution du liquide sanguin, et le refroidissement subi par le sang provoquent la formation rapide quelques minutes) des microga-

ÉTUDE DES PAKASITES

l’œil nu. 11 laut avoir : une paire de pelils ciseaux fins, deux aiguilles fines moulées ou deux porte-épingles fines dans lesquels on fixe une de ces épingles fines ([ui servent à pit|uer les mousti- (|ues, de l’eau salée à : 1, une pla-

que de verre noir (on manipule sur un fond Fin. lO. — Uissoclion de l'eslomac

. ilii moustique.

noir à cause de la

coloration blanche de l’estomac et de l’intestin).

On lue l’insecte en lui faisant respirer du chloroforme, ou du cyanure de potassium et aussitôt on le place de côté sur une lame porte-objet l)osée sur la plaque de verre noir. On l’immerge

mètes dont on peut suivre la course entre les globules rouges, l’entrée dans un macrogainète. La manipulation est facile avec du sang d’oiseau infecté par llæmamœba Danileivskyi fj aller idi uni). On assiste môme aux phénomènes présentés par le macrogamète et aboutissant à sa transformation en ookinète. Si l’on désire faire des préparations |)ersistanfes colorées montrant l’issue des microgaraètes ou leur fusion avec les macrogamétes, il suflit de faii'e deux préparations simultanées de sang allongé d’eau sous lamelle L'une est placée eu chambre humide, pendant qu’on examine l’autre. Aussitôt que l’on voit se produire le phénomène attendu, on fixe la préparation gardée en chambre humide, on la colore ensuite j)ar la métliode de Laveran,

ÉTUDE DES MOUSTIQUES

dans une grosse goulte d’eau salée, on lui coupe les pattes et les ailes qui gêneraient et dont les écailles pourraient se disperser sur la préparation avec les ciseaux fins, on ampute la partie antérieure du thorax (lobes prothoraciques), On applique de la main gauche la pointe d’une aiguille sur un des points A et R du premier anneau de l’abdomen, et on appuie, de la main droite, la pointe de l’aulre aiguille au point D, sur le dernier anneau de l’abdomen. Cette deuxième aiguille doit éire émoussée, pour ne pas causer de dégâts. Puis on écarte ces deux aiguilles l’une de l’autre en tirant doucement suivant l’axe de l’abdomen. En un endroit quelconque de l'abdomen les anneaux cèdent, tantôt près de l’extrémité apicale, tantôt près de l’extrémité basale. On voit alors se dégager un petit tube blanc, l’intestin, et avec lui deux petites boules blanches qui sont les deux sacs ovigères. Quand le moustique vient d’être sacrifié, l’intestin présente encore des mouvements péristaltiques. Si l’on continue à tirer les aiguilles en sens inverse, on voit les petits tubes blancs de Malpighi sortir brusquement de la cavité abdominale, et en même tem|is apparaît le renflement stomacal. Deux obstacles peuvent s'opposer au bon résultat de cette préparation :

a) L’estomac e.st encore plein de sang. C’est le cas lorsqued’on veut voir les ookinètes et les jeunes

ÉTUDE DES PARASITES

zygotes, spécialement chez les Culex{{\\[ digèrent très lenlemeul le sang. Ün ne voit, en effet, leur ventre distendu et noirâtre reprendre ses dimensions normales que vers le 6® ou 7® jour, tandis que les Anopheles digèrent le sang en 48 h. On a pourtant besoin de faire ces dissections quelques heures après que l’insecte a piqué. 11 faut donc chasser le sang de l’estomac, sous peine de ne rien voir. Voici la technique très bonne indiquée par R. Huge : une fois l’estomac extrait de l’abdomen par le procédé indiqué, on immerge la préparation avec le porte-objet dans un récipient contenant de l’eau salée (boîte de Pétri, par exemple). On place une lamelle sur l’estomac, et on presse légèrement avec l’ongle sur cette lamelle. Le sang aussitôt est expulsé de l’estomac par l’œsopbage sectionné et l’intestin, et la préparation se lave dans l’eau salée. On recommence autant de fois qu’il le faut cette petite opération et l’on a finalement une préparation dépourvue de globules rouges où l’on peut voir à merveille les petits kystes hyalins sur les parois de l’estomac. 11 faut avoir soin de baigner l’estomac dans une goutte assez grosse d’eau salée normale: s’il se dessèche, il s’enroule et on ne peut plus arriver h l’étaler. Il faut avoir soin aussi de ne pas trop l’écraser dans la manipulation, car alors les kystes se détachent.

b) Le deuxième inconvénient possible résulte

ETUDK DBS U0U8TIQUES

de la présence d’œufs mûrs dans l’abdomen du moustique. Les œufs murs forment deux masses jaune clair assez grosses qui entravent la sortie du tube digestif de la cavité abdominale. On peut les extraire par une sorte de massage exercée sur l’abdomen dans le sens centrifuge avec l’aiguille tenue de la main droite de façon à pousser lentement dehors la masse des œufs. Cette masse est molle et se prête à cette manipulation, elle fait bientôt hernie à l’ouverture de l’abdomen, et on peut s’en débarrasser facilement.

On peut arriver, avec beaucoup de patience et d’adresse, à disséquer l’estomac d’un moustique conservé dans l’alcool. Pour le ramollir, l’immersion durant quelques heures dans de l’eau distillée formulée suffit.

Pour exarniner à l'état frais l’estomac ainsi préparé, il suffit d’enlever l'excès d’eau physiologique autoui- de l’estomac, ainsi que les débris du corps de l’insecte, de poser une lamelle sur la préparation et d’observer avec un objectif à immersion, si l’on a affaire à un moustique ayant piqué depuis peu de jours ; on peut se servir d’un objectif à sec pour observer les zvgotes plus développés. Si l’on veut avoir une préparation persistante, on fait passer un courant deglj’cérine sous la lamelle : on dépose une goutte de glycérine sur un bord de la lamelle et on fait un

ÉTUDE DES PARASITES

appel de liquide eu plaçant le long du bord opposé une bande de papier buvard coupée aux ciseaux, Il y a avantage à teinter légèrement cette glycérine avec du bleu de méthylène ou de rbématéine. La glycérine une fois substituée à l’eau, on borde à la paraffine sur laquelle on peut étaler une couche de baume de Canada. On peut aussi, par une manipulation un peu plus délicate, colorer l’estomac (hématéine et éosine), quand on vient d’enlever l’excès d’eau. On se sert de rbématéine à l’alun (hémalun) ainsi préparée:

Hématéine cristatlisée (hématéine ammoniacale), i gr. Alcool à 90“ 5o cc.

Dissoudre à chaud. Verser dans la solution suivante faite aussi à chaud :

Alun ordinaire 5o gr.

Eau I 000 CC.

.Mettre du camphre pour la conservation.

I.,a préparation est mise à colorer pendant un espace de temps variable de i5 minutes à 24 heures (pas de surcoloration). Puis elle est lavée à l'eau, et traitée par une solution très faible (i/iooo) d’éosine à l’eau. Il est préférable, quand la coloration par l’hématéine est forte, de traiter la préparation retirée du bain d’bémaléine, après lavage à l’eau, par l’alcool chlorhydrique (alcool à 60“ : 100 cen-

IGO

KTl'DK DES MOUSTIQUES

limètres cubes, acide chlorhydrique ; o,5) 3 ou 4 minutes, puis par l’alcool ammoniacal (alcool à 6o“ : loo centimètres cubes, ammoniaque: 0,5) un temps égal. On traite alors par la solution d’éosine ; après la coloration, surveillée au microscope avec un faible grossissement, on lave à l’alcool pour déshydrater, on passe au xylol et on monte dans le baume de Canada.

2° Dissection des glandes salivaires {fig. 4*, 42, 43). — Celte manipulation est plus délicate que la précédente.

Il faut se munir des mêmes instruments, avec une aiguille montée lancéolée, ou un petit couteau à cataracte, en plus.

On manipule sur un fond clair et non plus sur un fond noir (à cause de la leinte sombre du cou et de la tête).

Enfin une partie de la manipulation au moins doit se faire sous le microscope (objectif de Stiassnie, n° 2, grossissement 3o à 4o diamètres, ou n° 4 dont on a dévissé la lentille frontale, et oculaire redresseur de Stiassnie).

On place le moustique aspby.xié (on peut lui avoir déjà enlevé l’estomac et l’intestin postérieur) couché sur le côté, sur une lame porteobjet. On l’immerge dans une goutte d’eau physiologi(|ue. On lui coupe les pattes et les ailes.

ÉTUDE DES PARASITES

On appuie une grosse aiguille sur la lête ou mieux sur la trompe, de façon à incliner fortement la tète sur la face inférieure du thorax. On

■Si.

sectionne avec l’aiguille lancéolée ou le petit couteau à cataracte, le thorax suivant la ligne AB,

f'ig» 12. ~ Dinsection des glandes nalivaires (Cliainp opératoire*).

puis suivant la ligne Cl) qui a une direction perpendiculaire à l’axe du corps du moustique,

Kilm. et Kl. Skuoemt — Ktude des Moustiques

ÉTUDE DES MOUSTIQUES

à une distance de la tête à peu près égale à la longueur de la tête. Dans l’angle dièdre thoracique AOD ainsi délimité, on est sûr de trouver les glandes salivaires. On presse sur cet angle avec une grosse aiguille (voir fig. 43); on voit alors un lobe ou la glande entière faire hernie hors du tissu sectionné, sous forme de petits tubes granuleux ; avec l’épingle 6ne, on détache ces tubes par petits coups; il faut, à ce moment.

Fig» 43. — Dissection dos glandes salivaires (Tecbniqoe).

que la préparation soit simplement bumide et non plongée dans l’eau, pour la commodité de la manipulation. De temps eu temps, on remplace l’oculaire redresseur par l’oculaire compensateur n° 6 ou n° y, pour mieux voir les détails. Quelquefois on est assez heureux pour détacher les deux glandes trilobées intactes avec leur canal collecteur commun. On examine entre lame et lamelle dans le liquide phvsiologique. Une pression sur la lamelle peut- faire sortir les sporozoïtes qui sont alors colorés plus

ÉTUDE DES PARASITES

facilement qu’à l’intérieur de la glande. On emploie les procédés de coloration par le bleu de méthylène et l’éosine (procédé de Giemsa, de RomanowsUy) ou parle bleu azur (voir p. i52). On peut chercher à voir et à colorer les sporozoïtes dans les glandes salivaires de moustiques morts depuis un jour ou deux : les tissus du moustique sont altérés et méconnaissables, mais les sporozoïtes ont gardé encore leur aspect et la faculté d’être colorés.

Lorsque l’on est un peu familiarisé avec la dissection des moustiques, on peut employer un procédé extrêmement simple pour la recherche des sporozoïtes dans les glandes salivaires, et qui est en même temps très efficace : On serre, dans une pince, le corps du moustique. Avec une autre pince fine, on arrache la tête. Sur la partie sectionnée du cou apparaît, du coté du thorajç, une gouttelette claire qui contient du liquide salivaire, et, lorsqu’il y en a dans les glandes, des sporozoïtes. On essuie cette gouttelette sur une lame, sur un petit espace, on fixe et colore comme ci-dessus.

3® Coupes. — Le fixateur de choix est le liquide de Perenyi :

Acide nitrique à lo o/q /|U cc.

Alcool absolu !5o

Sol. aqueused’acidechromiqueà •/.,#/(,. 3o

ÉTUDE DES .MOUSTIQUES

Oïl mêle ces liijuides et, au boul de peu de temps, on obtient une solution d’un beau violet.

On immerge les moustiques vivants dans le liquide de Perenyi ; par suite deseflorts faits par les insectes pour respirer, le fixateur pénètre dans le corps entier par les trachées, et agit complètement. Il présente de grands avantages en amollissant la chitine. On y laisse les moustiques environ une heure. Puis on lave à l’alcool à 70“. On passe par les alcools de plus en plus forts (80-90°) puis enfin par l’alcool absolu (au moins si.x heures), par le xylol (2 ou 3 heures). A partir de ce moment, les moustiques sont placés à l’étuve à 54°, dans la solution de xylolparaffine (4 heures); puis dans la paraffine pure fusible à 54° (2 heures). On coule alors la paraffine dans les moules ad hoc. On a coupé- les ailes et quatre pattes du moustique, en laissant deux pattes comme points d’appui et de préhension pour orienter le moustique, dans le bloc de paraffine avant que celle-ci se soit solidifiée. Il faut prendre soin d’orienter convenablement le moustique. Les coupes seront faites frontales ou sagittales, en rubans. On pourra ainsi avoir sur une lame ou deux (suivant la taille du moustique) le corps entier.

On a pré|)aré des lames extrêmement propres sur lesiiuelles on étale du bout du doigt une

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igî;

mince couche du mélange suivant (albumine de Mayer) :

Albumine d'œuf ) .Y- p g

GJycérine ;

On filtre sur papier, et on ajoute quelques petits morceaux de camphre j)our empêcher la peptonisation de l’alhumine par des cultures microbiennes.

Une fois l’albumine étalée, on recouvre la lame d’une mince couche d’eau sur laquelle sont posés les rubans de coupes régulièrement les uns à côté des autres, de façon à ne pas perdre de place. Les coupes sont posées leur surface brillante en dessous. Elles sont souvent un peu froissées. On passe avec précaution la lame audessus d’une veilleuse, la couche d’eau devient tiède et les coupes s’étalent mieux. Surtout ne pas cbaufTer jusqu’à fusion de la paraffine. Une fois les coupes bien étalées, on fait écouler l’eau en retenant les rubans sur la lame. On sèche les rubans avec du papier mousseline appuyé très légèrement sur eux. On porte alors la lame au-dessus de la flamme de manière que la paraffine fonde rapidement, puis sur une surface froide (table de verre ou de lave) pour qu’elle redevienne solide. I^a coupe est collée et peut être gardée indéfiniment ainsi. Quand on voudra la colorer, on enlève la paraffine en la dis.solvant

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dans du xylol, on enlève le xylol par l’alcool, et l’alcool par l’eau. On peut alors plonger la lame dans le colorant. Le colorant de choix est l’héinatéine (voir la technique, p. i5<)).

Lorsque l’on n’est pas pressé, un bon procédé de collage des coupes, qui dispense de l'emploi de l’albumine de Mayer, consiste à étaler les coupes sur des lames rigoureusement propres et recouvertes d’une mince couche d’eau. Ces lames sont ensuite portées à l'étuve, où, l’eau s'évaporant, elles collent admirablement au bout d’une heure environ.

D'autres méthodes de fixation que celles que nousavons indiquées ont donnéde bons résultats ; on peut fixer les moustiques en les immergeant vivants dans de l’alcool absolu. On peut aussi les fixer dans un mélange de deux parties d’alcool à 90" et d’une partie d’une solution aqueuse de bicblorure de mercure (à 1 pour lono) dans un tube à essai. On porte doucement à l’ébullition pendant une minute ou deux pour expulser tout l’air contenu dans les trachées, et pour iaire pénétrer en sens inverse le fixateur dans tous les tissus. On laisse encore l’insecte quel- (jucs heures dans le mélange, puis on le passe par l’alcool à 90 iodé (-1- teinture d’iode jusqu’à teinte ambrée), puis dans l’alcool absolu et on peut enrober dans la paraffine.

Lors(|ue l’on n’a pas à sa disposition l’outillage

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d’un laboratoire, on peut improviser une èluve pour la paraffine, d’après les indications du lieutenant-colonel Giles. Elle consiste simplement en une longue plaque de cuivre ou de tôle portée sur quatre pieds de bois, elle est chaufîée a une extrémité par une petite lampe ou une veilleuse. C’est, en somme, une platine chauffante rudimentaire. Un récii>ient étroit et long est placé sur la plaque dans le sens de sa longueur. Il est plein de paraffine et conslilue ainsi un tbermomètre. La paraffine fond dans la partie proche de la veilleuse et reste solide à l’autre extrémité. On place des petits godets pleins de paraffine, contenant les objets à fixer, au niveau du point où la paraffine commence à fondre. Ils seront ainsi soumis à une température approchant de .'>4".

Eysell monte, dans la celloldine, des moustiques fixés dans l’alcool absolu. Mais comme la celloïdine ne pénétrerait pas dans les cavités du corps, il a recours au procédé suivant : il insère le corps d’un nmustiqiie dépouillé de ses pattes et de ses ailes entre un morceau de hège et un morceau de moelle de tournesol. La moelle de tournesol se laisse déprimer plus fortement que le liège par le corps du moustique. Si alors on passe un scalpel mouillé d’alcool dans la fente entre le liège et la moelle de tournesol, on enlève une calotte du tégument de la tête, du thorax et de

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l’abdomen. Les grandes cavilés du corps sont ouverles et la celloïdine pourra y pénétrer. Naturellement le tube digestif qui occupe une position centrale dans le corps du moustique, n’est pas atteint par le couteau.

On peut prendre pour de jeunes zygotes des parasites de l’estomac des moustiques, comme les grégarines. On reconnaîtra celles-ci à leur noyau condensé, leur protoplasma uniforme et l’absence de pigment. Les grosses cellules des tubes de Malpighi peuvent aussi donner lieu à des erreurs; il suffit, pour s’en garantir, de faire des préparations de moustiques sains pour apprendre à reconnaître les cellules. D’une manière générale, il faut se rappeler que les zygotes se trouvent surtout à la partie postérieure (renflée) de l’es'oniac.

G) Technique de la préparation des moustiques pour suivre l'évolution des filaires. 1“ Disseclion. — Les instruments nécessaires sont: deu.v aiguilles montées; au microscope : un objectif faible (n“ 2 de Stiassnie ou n° 4 dont on a ôté la lentille frontale), avec un oculaire redresseur si l'on veut disséquer sous le microscope, ce qui n’est pas nécessaire; un objectif à sec jilus fort (n” 7) pour c.\aminer les embryons de lilaire, avec un objectif à immersion homogène pour voir les détails ; un oculaire compensateur n° 6.

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Lorsque l’on vont examiner les embryons de filaire dans l’estomac d’un moustique qui vient dépiquer, il faut préparer cet estomac de la façon qui a été indi(|uée à la p. i54-

Manson indique un procédé qui permet de voir entre lame et lamelle, sans avoir besoin du moustique, comment les embryons sortent de leurs gaines. Il semble que les embryons soient incités à sortir de leurs gaines à la suite de l’bémolyso qui se produit dans l’estomac du moustique. Il suffit donc d’hémolyser une goutte de sang par un moyen physique (froid puis chaleur).

On fait plusieurs préparations fraîches du sang d’un malade à filaires, à l’heure nocturne où les embryons s’y trouvent. On se contente de border les lamelles avec un peu de vaseline, on enveloppe les préparations séparément dans du papier à filtrer et on les dispose dans une boîte bien étanche sur un bloc de glace pendant (i ou 8 heures: le reste de la nuit par exemple. Éviter que le sang ne gèle! Le lendemain malin, on examine au microscope: les lames de verre, ainsi reportées à la température de la chambre se réchaulTent, le sang s’bémolyse, lesembryons engourdis par le froid reprennent leur activité et, dans le sang hémolysé, s’elTorcent de rompre leurs gaines. On assiste à ce spectacle tout le long de la journée. La plupart des embryons

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rcijssissenl à se libérer, et le soir, on voit, éparpillées dans la préparation, un grand nombre de gaines vides.

Pour voir les filaires qui ont passé dans les muscles thoraciques, on dilacère sur une lame, avec deux aiguilles montées, le tborax d’un moustique immergé dans l’eau physiologique, ün écarle avec les aiguilles les téguments chilineux, on recouvre d’une lamelle et l’on observe avec un faible grossissement. Le moustique doit avoir piqué un malade depuis plusieurs heures. On peut garder ces préparations sans les colorer en remplaçant l’eau par la glycérine, comme nous l’avons indiqué à la p. i58. 11 est préférable de colorer à l’iiémaléine (voir à la p. iSg), déshydrater par l’alcool absolu, enlever l’alcool par le xylol, et monter au baume.

Pour voir les Pilaires qui ont passé dans le labium, il est très facile d’écraser la trompe entre lame et lamelle dans une goutte d’eau.

2" Coupes. — Les coupes seront faites suivant la technique indiquée à la p. i6ii; enrober dans la parafline de préférence.

Elles seront épaisses de G à 10 g, et pratiquées dans les trois directions de l’espace, à cause de la dissémination des Pilaires dans le corps entier ilu moustique, ce qui force à les chercher partout. Des soins particuliers seront donnés à l’orientation de la trompe dans le bloc de paraf-

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line, car ce sont les cou|)es du labium qui sont les plus intéressantes.

La principale difficulté consiste à fixer sans dommages les coupes detromjæs sur les lames — le squelette cliitineux a, en effet, une tendance à se détacher, déchirant sur son passage les tissus moins résistants. Annett, Dutton et Elliott ont indiqué un procédé pour obvier à cet inconvénient, c’est une modification de la méthode d’Obrega pour fixer les coupes enrobées dans la paraffine, il donne de très bons résultats. On fait un mélange de deux parties de solution de glucose et d’une partie d’un sirop épais de dexlrine pure ;

Dextrine 'i-^^ grammes

Eau 496 K

Tlivtnol I //

Une trace de ce mélange est étalé sur une lame en couche mince au moyen d’une baguette de verre. Les rubans de coupes sont |)ortés directement sur la lame enduite de ce mélange sirujieux, on |)orlele tout dans une étuve à 4<)" pour plusieurs heures. Le mélange glucosé dextriné sèche complètement et devient dur. Un enlève alors la paraffine par le xylol, le xylol par l’alcool absolu. On verse ensuite une solution de pliotoxyline sur la lame, de façon à recouvrir com[)lètement les cou[>es d’une mince couche.

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La plîoloxyline a ici sur la celloïdine l’avanlage d’ôtre parfaitement Iransparenle. On attend que les bords do la couche de photoxyline, se durcissant, commencent à se gondoler. Si on immerge en ce moment la lame dans l’eau, la pellicule de photoxyline se détache avec les coupes qui sont prêtes à être colorées en place, dans cette pellicule. On colore comme ci-dessus, de préférence à l'hématéine.

Mansnn donne la technique suivante, qui lui a valu de très belles préparations — les insectes conservés dans la glycérine sont traités par une solution d’acide acétique à 5 dans l’eau, pendant 24 heures ; puis par le formol à 5o % dans l’enu, pendan 1 24 heures ; puis par l’alcool absolu, pendant 24 heures aussi; enfin par un mélange à parlieségales d’alcool absolu et d'élher, encore pendant 24 heures; finalement, il sont inclus dans la celloïdine. On pratique alors les coupes qui sonlcjlorées par une solution forte d’hémaloxyline iiendant deux heures, décolorées par une solution d’acide chlorhydrique à 1 « g et par l’alcool, lavées à l’eau, passées à l’huile d'aniline, au xylol, et montées au baume.