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radialement, mesurant de 10 à 20 u sur 8 à 10 u. Ces formes sont souvent désignées sous le terme de massues. Dans le centre des grains, on peut voir parfois un réseau de fins filaments ayant 0,6 à 1,5 u de diamètre; parfois il est impossible de reconnaître la structure filamenteuse du centre. Dans ce cas, il faut écraser le grain sur le bord du verre, pour pouvoir effectuer une préparation pour l’examen microscopique. Par la méthode de Gram, on note la présence de filaments longs et ramifiés, Gram-positifs, qui peuvent être fractionnés et ressembler à des Bactéries de taille très variable, mesurant de 3 à 4 u jusqu’à 10 à 20 u.

Ils sont sinueux ou même spiralés et prennent parfois la forme de V ou deY. Ces éléments ont un diamètre uniforme avec des extrémités renflées en massue. Leur ressemblance avec des Corynebactériacées est parfois si flagrante que l’on peut les confondre avec ces organismes. Cependant ces filaments ne sont jamais rigides et ont toujours un caractère de flexibilité.

Les bâtonnets situés à la périphérie du grain sont Gramnégatifs, ils ont en général une structure homogène. On observe parfois dans l’axe de l’un d’entre eux un filament unique ou ramifié d’'Actinomyces que la substance du bâtonnet enveloppe comme une coque.

Deuxième cas: On ne trouve pas de grains:

Ici, bien entendu, pas de lavages. En effet, la manipulation pour éliminer les germes étrangers a le même effet sur les Actinomyces dont la résistance aux agents physiques et chimiques est la même que celle des Bactéries associées.

On ensemence directement le pus sur le milieu de culture et on dispose en aérobiose et anaérobiose. Dans ce dernier cas, on casse la partie inférieure du tube (là où les colonies actinomycosiques sont visibles et à peu près pures). Enfin, il ne reste plus qu’à obtenir des cultures pures selon la technique que nous décrirons maintenant.

Ensemencement et obtention de cultures pures:

Nous avons déjà dit plus haut qu’il est impossible d'obtenir au début des cultures pures d’'Actinomyces. Il va donc falloir séparer les colonies que l’on veut étudier de celles des germes associés.

Pour cela on peut se servir de trois milieux de culture. NECRONI et BONFIGLIOLI (52) recommandent un bouillon comprenant 100 ce de bouillon ordinaire, 1 à 2 gr de Glucose et 0,5 gr de Gélose, que l’on répartit dans des tubes à essai ordipaires sur une hauteur de 8 à 10 cm. On le fait bouillir pen-

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dant 10 à 15 minutes pour enlever le plus possible d’Oxygène libre. Ensuite, on laisse refroidir jusqu’à une température de 38° à 40°. Il ne reste plus qu’à ensemencer.

Les auteurs que nous avons nommés au début conseillent d'utiliser le milieu de culture de Lubinski, qui selon eux, facilite la croissance de la première culture des Actinomyces. Cette dernière doit être effectuée avec la même technique que celle utilisée pour Les Bactéries anaérobies en évitant Îles bulles au cours de l’ensemencement.

Nous n’insisterons pas sur la préparation de ce milieu obtenu en ajoutant 10 cc de sang humaine défibriné à 200 ce de bouillon ordinaire contenant 0,5% de Gélose.

Nous avons obtenu les meilleurs résultats avec le milieu au Protéolysat à 5% additionné de Glucose pur à 5 p. 1.000.

Nous donnons ci-dessous la préparation de ce substrat.

Protéolysat 50 gr Eau distillée 1.000 ce

Il suffit de faire dissoudre le Protéolysat; il a l’aspect d’une poudre jaune-brun d’odeur caractéristique. On obtient rapidement, par simple agitation, une solution acide dont il faut ajuster le pH à 7,2 environ à l’aide de Soude diluée. On peut employer comme indicateur de pH un papier réactif spécial; mais, par l’addition de Soude, le liquide se trouble peu à peu et, pratiquement, le pH voulu est atteint quan la précipitation est arrivée à son maximum, provoquant un trouble très net. Cette précipitation, dûe aux Phosphates et Carbonates alcalino-terreux, s’accentue encore à chaud. Il faut donc porter le ballon contenant le milieu à la vapeur fluente dans l’autoclave et filtrer à chaud. On obtient un liquide jaune clair très limpide. Ce bouillon peut être enrichi,

gélosé, etc. il suffit ensuite de le stériliser 15 à 20 minutes à 120°.

L’incubation doit se faire à 37° et le prélèvement du pus doit être fait immédiatement avant l’ensemencement. En effet, les Actinobactéries ont une vitalité très faible et ne

résistent que quelques heures à la température du laboratoire.

On observera les cultures toutes les 24 ou 48 heures. Les colonies sont en général bien développées après 3 ou 4 jours, parfois après deux jours, quelquefois plus tard, après 6 à 8 jours. Le tube ne devra jamais être ouvert avant 15 jours d’incubation. En dépit de toutes les précautions prises pour éliminer les Bactéries, les cultures ne sont jamais pures. Quelques traces de Sfaphylocoques peuvent encore se développer à la surface, leurs colonies d’ailleurs, ont les mêmes

caractères que ceux des Actinobactéries et ont la forme d’une lentille biconvexe à leur surface. Les Streptocoques forment de petites colonies superficielles ayant une surface relativement lisse et une partie profonde plutôt ramifiée. D'autres Streplocoques se développent sous forme de colonies dures et épaisses ressemblant à celles d’Actinobacterium israeli.

Les cultures peuvent ne pas présenter les germes secondaires que nous venons de voir, mais il est tout à fait exceptionnel de ne pas trouver des Fusiformis et le Bactérium actinomycetum comitans qui accompagnent les Actinobacteriums pathogènes, même dans les lésions fermées et dans les métastases. Ceci s’explique par le fait que ce sont des germes qui vivent en symbiose et qui pénètrent ensemble dans les tissus avoisinants lorsqu'il y a une lésion.

Une fois que les colonies seront suffisamment développées, il sera relativement facile de séparer les colonies d'Actinobactéries avec une pipette de Pasteur (en évitant de toucher aux autres colonies) et de les placer dans des milieux stériles où elles pourront se développer seules.

Une petite portion est prélevée avec un ensemenceur de platine et examinée directement. Une fois la nature actinomycosique établie, le restant de la colonie est lavé plusieurs fois dans le soluté physiologique stérile pour éliminer une éventuelle contamination bactérienne et finalement écrasé, puis ensemencé dans deux ou trois tubes contenant le milieu au Protéolysat glucosé, gélosé, suivant les indications que nous avons déjà données.

Ce n’est que lorsqu’on aura obtenu une croissance suffisante au bout de 4 à 5 jours que l’on pourra répéter la même opération pour avoir une culture absolument pure.

L'opération test la même lorsqu'il s’agit d’un pus ne contenant pas de grains. Cependant, la séparation des colonies est un peu plus délicate au début, en raison du grand nombre de colonies étrangères.

Après avoir donné les techniques d'isolement employées, nous exposons dans le chapitre suivant les observations cliniques concernant notre cas d'Actinomycose uro-génitale chez une femme.

FÉMISS ESS