CHAPITRE PREMIER

TECHNIQUE

19 Choix de l'A lque. — Ces recherches devant se poursuivre dans des condilions rigoureusement aseptiques et avec un végétal bien déterminé, en un mot en cultures pures, je me suis adressé, comme sujet d'expérience, à une Algue unicellulaire : Chlorella vulgaris (Beye erink).

J'ai effectué aussi quelques essais avec le Cystococcus ve cola (Nægeli), dont une culture pure sur milieu solide m'a été aimablement cédée par Charpentier, qui a fait sur cette Algue une étude physiologique si remarquable. Cette culture, abandonnée dans une armoire de laboratoire, à l'obscurité, depuis

neuf ans, m'a néanmoins fourni de belles cultures par réensemencement de quelques cellules prélevées en des plages restées vertes. Mais comme ce Cystococcus m'a paru donner de moins bons rendements avec les acides organiques que le CAlorella, J'ai préféré ce dernier. Aussi, si je le mentionne, c’est uniquement pour signaler ce fait, assez inattendu, d’avoir eu l'occasion de constater une survie d'aussi longue durée, avec persistance de chlorophylle, chez une culture d’Algue conservée à l'abri de la lumière. ;

29 Composition des milieur de culture. — Après de nombreuses expériences avec les divers milieux connus et conseillés pour la culture des Algues, j'ai choisi la solution de Molisch légèrement modifiée, dont voici la formule ;

AZ0tate dé DOtSSIUDL LE TM re 0#,30 Phosphate acide de potassium.:................ 0æ,10 Chlorure dé-Dotassiime- st en Osr,05 Sülfate de Masnésttm. SE 0,20 Solution au 1/200° de sulfate ferreux... ......... | goutte. Eau: redisuillées, es Re RE à 4 litre.

Cette liqueur, additionnée des acides organiques libres et de leurs combinaisons potassiques, constituait les milieux de culture à expérimenter. Seule, ou renfermant du glucose d’une part, du chlorure où du sulfate de potassium d'autre part, elle formait les milieux témoins, dont les rendements servaient de termes de comparaison.

Comme pour les Phanérogames, toutes les solutions de culture d’une même série renfermaient poids égaux de carbone (1) et possédaient la même acidité. Toujours pour se rendre compte de l'influence de l'apport potassique des combinaisons organiques, les milieux témoins préparés avec les sels minéraux, chlorure et sulfate de potassium, contenaient même quantité de potassium que les milieux préparés avec les sels organiques.

30 Déterminalion de la toxicité des acides organiques libres el combinés. — Avant tout, il était nécessaire de déterminer les doses toxiques des composés organiques, en milieu Molisch, pour le CAlorella, afin de se placer dans des conditions favora-

(1) Sauf por l'acide oxalique.

bles pour son développement. Ces essais préliminaires, effectués en 1911, m'ont appris que, pour les acides libres, je ne devais pas dépasser les quantités correspondant au 1/2000€ de leur poids moléculaire par litre; pour les sels acides, le 1/100€ et pour les sels neutres (sauf l’oxalate), le 1/20 et même au delà. Déjà, par ces résultats,'on peut se convaincre que la toxicité des acides est bien due à leur fonction acide.

Les acides malique et tartrique sont nettement plus nocifs que les autres, les succinates et citrates acides de potassium beaucoup moins que les tartrate, malate et oxalate. Ce dernier, à l'état neutre, est manifestement défavorable à la dose de 187,26 p. 1000 (1/100€ du poids moléculaire).

49 Concentration et préparation des milieux organiques. — La grande sensibilité de l'Algue à l’action des acides libres m'a imposé l'obligation de les employer à des doses bien inférieures (10 fois moins) à celles de leurs combinaisons acides et neutres. Voici d’ailleurs, exposées en un tableau, toutes les concentrations adoptées dans les deux séries d'expériences et exprimées en milligrammes par litre :

A l'état libre. A l'élat combiné.

CR Er RE)

{re série. 2e série. 1re série. 2e série.

Acide malique......... 67 34 670 340 RC HATITIQUE 75 38 50 380 — Succinique...... 59 30 590 300 — oxalique........ 63 32 630 320 CIRQUE. 70 35 700 350

Les milieux de culture sont préparés en ajoutant à 100 centimètres cubes de solution de Molisch, le dixième de ces poids d'acides ou de leurs combinaisons. Tous, contenus dans des boîtes de Roux de un litre, y compris les milieux témoins, sont stérilisés à l’autoclave, puis, après refroidissement, ensemencés d’Algues. Afin de répartir dans ces vases des quantités de cellules aussi égales que possible, j'ai ajouté à chacun d’eux un centimètre cube d’une culture pure (1) de CAlorella dans du Molisch, en ayant bien soin de l’agiter avant chaque prise. On

(4) Une série de milieux ensemencés à l'aide d'une culture contaminée par le Penicillium glaucum, a donné des cultures mixtes d’Algue et de Chambpignon, dont l'association paraissait surtout profiter à la première, dont les cellules se trouvaient prises entre le mycélium enchevêtré. Il y aurait peutètre là un moyen pratique pour tenter la synthèse de lichens nouveaux.

place ensuite toutes les boîtes, à plat, dans le laboratoire, à une même exposition au nord et contre une fenêtre dont les vitres sont garnies de papier blanc, afin d'atténuer l'intensité lumineuse. J'ai constaté, en effet, que la lumière diffuse telle quelle, provoquait, l'été, le Jaunissement des Algues qui ne sont protégées contre elle que par une couche d’eau de quelques millimètres d'épaisseur. Celte remarque concorde entièrement avec celles de Grintzesco el surtout de Raoul Combes qui a prouvé, par des mesures pholométriques précises, que l’éclairement optimum, pour le C'hlorellu, est représenté par l'éclairement le plus faible utilisé dans ses expériences.

Récolte de l'Alque. Poids sec. — Un jour ou deux avant de procéder à la récolte, on relève et on incline les boîtes de Roux, en les laissant reposer sur un de leurs angles inférieurs : les Algues se réunissent alors au fond de cet angle. Puis, avec un siphon de très faible débit, on décante le plus possible de liquide clair. Le reste est agité pour mettre en suspension les cellules végétales déposées, et on verse le tout dans un tube à centrifugalion.

On rince la boîte plusieurs fois avec de l'eau distillée et on transvase tous ces liquides dans le tube précédent, que l'on soumet à l'action de la centrifugeuse électrique. Après une centrifugation de deux minutes de durée, faite avec une vitesse de 3 000 tours à la minute, les Algues se trouvent agglomérées en une masse compacte, surmontée d'un liquide limpide. On décante celui-ci, et on le remplace par une solution d'acide chlorhydrique au millième, qui a pour but de dissoudre le précipité de phosphate de magnésie produit par l’alcalinité de certains milieux de culture : une cause d'erreur très importante, par rapport au poids minime d’Algue, est ainsi évitée. Après une nouvelle centrifugation on décante la solution acide et on lave ensuile les cellules vertes avec de l'eau distillée, à plusieurs reprises ; chaque lavage est évidemment suivi d’une centrifugation. Le culot d'Algue ainsi obtenu est entrainé, au besoin à l’aide d’un peu d'eau, dans un vase bouché à l'éméri, puis desséché pendant quarante-huit heures dans une étuve à 1030 etenfin pesé. Je n'ai pas tenu compte, dans ce poids see, du poids descellules introduites dans chacune des boîtes de Roux,

au début des expériences, pour effectuer l’ensemencement : il est négligeable, d'ailleurs il est bien approximalivement le même pour tous les milieux.

6° Dosage des acidités initiale et finale des milieux de culture. — Ces acidités ont été dosées tout simplement au moyen de Ja solution décinormale de soude, en présence de phtaléine du phénol et sont exprimées en centimètres cubes de cette solulion p. 100. Avant de déterminer les acidités finales, j'ai pris la précaution de soumettre pendant quelques minutes les milieux au bain-marie, afin d'en chasser l'acide carbonique.

19 Détermination du quotient respiratoire de l’Alque. — I m'a paru d'autant plus intéressant de déterminer le quotient respiratoire d’une Algue, que l'on ne possède, sur ce sujet, aucun renseignement, du moins à ma connaissance. Après de très nombreux tâtonnements, j'ai adopté la technique suivante qui m'a donné de bons résultats. La culture, bien agitée, est filtrée sûr papier spécial pour filtration à la trompe, qui retient parfaitement, surtout lorsqu'il est humecté au préalable, les cellules végétales.

Dès qu'une couche mince et uniforme d’Algues garnit le fond du filtre, qui prend alors une légère teinte vert-clair, on découpe à cet endroit un petit carré de deux centimètres de côlé que l'on introduit dans un espace d'air confiné de deux centimètres cubes (1). La respiration s'effectue ainsi durant vingt-quatre heures et on procède ensuite au dosage de l'oxygène et de l'acide carbonique, au moyen de l'appareil Bonnier et Mangin.

Pour obtenir des quotients constants pour une même culture, il est important de ne pas exagérer l'épaisseur de la couche d'Algues, qui doivent toujours être légèrement humectées par le peu de liquide que retient le papier filtre. Après quelques essais, on arrive facilement à surmonter cette petite difficulté. La respiration s'effectue ici en présence du milieu même de culture.

(1) Cet espace d'air est ménagé dans un tube de diamètre suffisamment

petit pour que le papier, support d’Algues, adhère contre ses parois, sans toucher le mercure.