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jours. Dans les vingt premiers jours il n'apparut pas trace d'acide azotique : l’'ammoniaque apparaissait au contraire en quantité croissante; puis de l'acide azotique se produisit en même temps qu’on constatait une diminution de l’azote organique et de l'azote ammoniacal ; s’il s'était agi d'une simple oxydation à l'air il est bien évident qu’elle se serait produite dès le début. Si d'autre part on venait à faire circuler des vapeurs de chloroforme dans le tube, la production d'acide nitrique cessait, l’'ammoniaque réapparaissait au contraire ; ces deux faits plaident déjà en faveur de l'intervention de microorganismes.
Celle-ci est rendue manifeste par des ensemencements opérés sur des liquides ammoniacaux préalablement stérilisés par la chaleur (eaux d'égout, milieux liquides artificiels À base de sels ammonia- Caux...); si on y introduit une trace de terreau, d’eau d'égout ou même d’eau courante le phénomème de la nitrification apparaît et on peut le faire cesser en portant les liquides à 70e.
On peut également démontrer l'intervention de microbes dans le phénomène de la nitrification en, répétant l'expérience initiale de BoussiNGauLTt avec de la terre additionnée d’une substance organique azotée, telle que du sang desséché, et portée pendant un. temps suffisant à la températuae de 100° dans une autoclave; au bout d’un mois ou deux on constate que la teneur en nitrate n’a pas subi de modifica- tion; mais il n'en est plus de même si on vient à ajouter à la masse stérilisée un peu de terre qui se trouve apporter les organismes indispensables à la production d'acide nitrique; celle-ci à lieu en
effet, à partir de ce moment, d’une manière très appréciable.
ScHLoœsinG et Müvrz montrèrent que cette faculté n'appartient pas à des espèces banales (Mucor, Aspergillus, Penicillium...) qui se trouvent au contraire détruire les nitrates, mais qu'il s'agit d’êtres ayant une propriété spécifique.
Les conclusions de ce travail furent confirmées par un grand nombre d’expérimentateurs et particulièrement par WaARINGTON (1879); celui-ci insista sur un fait déjà signalé par ScHLœsING et Münrz et consistant dans la formation d’acide nitreux au cours de ces
expériences, en particulier lorsque les solutions sont
relativement concentrées et exposées à une température assez élevée ; les savants français avaient regardé
cette production comme le résultat d'une fermenta-
tion nitrique entravée par le manque d’oxygène ;
nous aurons bientôt l'explication de ce phénomène. D'autre part il fut établi que la nitrification ne
nécessitait que de véritables traces de matière car-
honée; Herous (1886) montra même que les bacté-
ries capables de déterminer la formation de l'acide nitrique aux dépens de l’ammoniaque agissaient d’une manière beaucoup plus intense dans un milieu exclusivement minéral que dans le même milieu additionné de glucose ; on se trouvait en présence d’un
phénomène parodoxal ; ce fut à Winocrapsky (1890-
92) que revint le mérite d'isoler les microorganismes de la nitrification et d'en préciser les propriétés en cultures pures.
Isolement des bactéries de la dénitrification. — Les
échecs subis par les savants qui avaient antérieurement cherché à isoler les organismes de la nitrification tenaient à ce qu'ils se servaient toujours dans leurs essais de milieux nutritifs à base de gélatine, qui sont utilisés si couramment en bactériologie et qui offrent le double avantage de devenir solides à la température ordinaire et de constituer un milieu nutritif ordinairement favorable au développement des bactéries.
WinoGrapsky réussit à isoler les organismes de la nitrification en réalisant tout d’abord cette fermentation dans des liquides exclusivement minéraux et en S'appuyant, pour effectuer la séparation des germes, sur la propriété qu'ils possèdent de se développer le mieux en l'absence de matières organiques. Le savant russe effectua tout d’abord des ensemencements d’une goutte de liquide en pleine nitrification dans une solution minérale telle que la suivante :
Re De a nee UC per. «1000 Qulale d'ammoniume. 2-2 I Phosphate dipotassique . . . .. . . . .. I
On en prenait 100 centimètres cubes qu’on introduisait dans un matras et on ajoutait de o gr. 5 à 1 gramme de carbonate de magnésium.
C'est également avec des solutions minérales que BouLrLaxGer et Massoz ont obtenu une nitrification relativement rapide des substances ammoniacales en cultures artificielles par l'emploi de petits tonnelets de verre remplis de scories, qui permettent l’établissement d'une large surface d'aération: on verse dans ces récipients de 2 litres le liquide à nitrifier jusqu'au
ax. : 4 | nm 5 LE FASO ” En
tiers du volume des vases; ce liquide est celui de Wiocrapsky ou celui qui a été proposé par OMELIANSKY et qui est ainsi composé :
LU VERS Aude PT RE PNR EE OO Sulfate done RE RE M RE EP ETE 2 Chlorure de sodium. . 2 Phosphate dipotassique . 1 Sulfate de magnésium .: .... .": . .*, 0,9 re dé FÉES. 0,4
On stérilise, puis on ajoute dans chaque tonnelet o gr. b de carbonate de magnésium sous forme de lait lui-même stérilisé. On ensemence ensuite et on fait passer un courant d’air stérile et lent ; de temps en temps on fait subir au vase une rotation autour de son axe horizontal, de manière à mettre le liquide en contact avec une nouvelle portion de scories. On peut de la sorte obtenir en cinquante-quatre jours 11 grammes de nitrate par litre ; les scories servent de support aux organismes actifs et on se trouve opérer d'une manière analogue à celle qui est réalisée dans certains procédés employés pour la fabrication du vinaigre.
Wivocrapsky réussit à isoler cinq espèces de bactéries susceptibles de se développer sur des milieux gélatinés ; mais aucune d'elles n’était capable de reproduire le phénomène de la nitrification; le procédé d'isolement ne convenait donc pas enl’espèce. D'autre part l’auteur observa au fond des vases de culture, alors que la nitrification était active, une couche trouble qui, dans les cultures anciennes, se transformait en une sorte de zooglée floconneuse, emprisonnant les particules de carbonate de magnésium. Pour isoler les bactéries qui donnaient naissance à
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cette production, Winocrapsky fit une prise de ces grumeaux et les introduisit dans de l’eau stérilisée : il les ensemençait ensuite dans un milieu gélatiné et reprenait ceux qui ne donnaient naissance à aucun développement; il les reportait enfin dans des milieux minéraux stérilisés et obtenait ainsi des cultures capables de provoquer une nitrification très régulière : ainsi se trouvait réalisée une séparation des bactéries actives.
WinoGRADsky à pu isoler du premier coup les bac-
‘téries de la nitrification en ensemençant un peu de
terre sur un milieu exclusivement minéral, rendu solide par l'addition de silice gélatineuse et ayant la composition qui suit :
OEM RES DTA EE US MCE A TODO Sulfate SORTE DR NT VAE PRET OMR 0,4 de MAgnÉSIUM Le. 0,5 Phosphate dipotassique . . . . . . . .. I Carbonate de sodium... . . . . . .. 6 Chlorure de calcium :. . , : .: . : . .... traces
La préparation de la silice gélatineuse exige certaines précautions qui ont été indiquées par OME- LIANSKY ; On verse lentement dans 125 centimètres cubes d'acide chlorhydrique à 13° B un volume égal d'une solution de silicate de potassium à 8° B et on. soumet le mélange à la dialyse ; pour éviter une coa-
gulation prématurée de la silice, il est nécessaire de
débarrasser, par un lavage à l'acide chlorhydrique et à l'eau distillée, le parchemin animal dont on se sert de
la chaux qu'il peut contenir et d’effectuer la dialyse à
l'eau distillée ; après deux jours environ de dialyse en prélève toutes les trois heures un petit échantillon de la silice gélatineuse obtenue et on la soumet pendant dix minutes à la température de 120° jusqu’à ce que
la coagulation ne se produise plus dans ces conditions. C'est à cette silice stérilisée qu’on ajoute les solu-
tions telles que celles dont nous venons d'indiquer la
composition et qui ont été stérilisées de leur côté ; on
l’ensemence, on agite et on verse dans une boîte d'étain où s'effectue la coagulation. On constate que l’ammoniaque disparaît vers le huitième jour et que la réaction nitreuse apparaît vers le cinquième ; les colonies bactériennes ainsi obtenues sont très petites; Ome- LIANSKY à imaginé un procédé ingénieux pour les obtenir plus volumineuses ; il consiste à découper un petit segment sur la plaque gélatineuse et à y ajouter de temps en temps un peu d'une solution ammoniacale; la plaque d’abord laiteuse devient peu à peu
transparente par suite de la dissolution du carbonate
de magnésium introduit ; les colonies, d’abord inco-
lores, prennent une couleur d’un brun foncé et il
devient possible de les prélever isolément et de les
repiquer dans un nouveau milieu de culture.
Wiocrapsky reconnut, grâce à sa technique spéciale, qu'il existe deux sortes d'organismes concourant à la formation d’acide nitrique à partir de l’am-
moniaque, des ferments nitreux transformant l’am-
moniaque en acide nitreux, et des ferments nitriques
amenant l'acide nitreux à l’état d’acide nitrique.
Ferments nitreux. — Nous avons déjà dit que WARINGTON, reprenant les expériences de ScHLOEsING et Münrz, avait remarqué qu’au cours du phénomène de la nitrification il se produisait de l’acide nitreux et que la formation de ce corps paraissait précéder la production de l’acide nitrique. De son côté Wixo-
TRANSFORMATION DES SUBSTANCES AZOTÉES 233 GRADSKY, dans ses premiers essais d'isolement des bactéries de la nitrification, aboutit à des cultures pures d'organismes produisant presque uniquement des nitrites à partir des sels ammoniacaux ; il ne pouvait s’agir d’ailleurs d’une question d'aération insuffisante et on se trouvait en présence d'une fonction spécifique, celle des ferments nitreux.
Il en a été isolé un assez grand nombre d'espèces : ce sont les Nitrosomonas de l'Ancien Monde et les Nitrosococcus américains ; le ferment de Zurich (fig. 47 A) est en particulier constitué par d'assez gros
at À,
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Fig. 47. — Ferments nitreux de Zurich (A) et de Java (B).
éléments sphériques, ciliés, donnant naissance À des zooglées, celui de Gennevilliers par des cellules coccoïdes petites, formant des chapelets.
Ensemencés sur un milieu minéral contenant un sel
d’ammoniaque ils provoquent la formation de nitrite
vers le quatrième jour ; vers le septième jour la cul-
ture devient opalescente ; cet aspect est dû à l’exis-
tence d'éléments mobiles qui vont jusqu’à la surface prendre de l'oxygène: on constate qu’à ce moment il y a encore de l’ammoniaque dans le
liquide ; lorsque cette substance a disparu, la culture redevient transparente et le carbonate de magnésium se trouve inclus dans üne masse mucilagineuse.
Toutes les circonstances de l'isolement et du fonctionnement de ces bactéries semblaient indiquer qu’elles n’avaient besoin pour se développer d'aucune matière organique ; leur carbone proviendrait alors de gaz carbonique de l’air ou du carbonate de magnésium introduit ; la question qui se posait était très importante, car on ne connaissait alors que les plantes vertes qui fussent capables d'utiliser le gaz carbonique : | de l’air comme source de carbone; les végétaux dépourvus de chlorophylle étaient tous considérés comme empruntant leur carbone à des matières organiques plus ou moins complexes.
WioGrapsky établit le fait de l’utilisation du gaz carbonique par les ferments nitreux, ainsi d’ailleurs que pour les ferments nitriques, d'une manière indiscutable en se mettant à l'abri de toutes les causes d'erreur possibles. Des dosages de carbone exécutés sur des liquides rigoureusement exempts au début de toute trace de matière organique et dans lesquels on .mettait à se développer des Nitrosomonas ont montré que les quantités de carbone assimilé sont proportionnelles aux quantités d'’ammoniaque disparue :
Azote oxydé .. : 19 mgr.7 22 MST. 4 26 mgr. 4 Carbone assimilé . 72 — 815 — 4 928 — 3 Carbone : Azote. . 36.6 36.4 3922
On arrive ainsi à regarder l'oxydation de l’ammoniaque comme étant une réaction qui fournit au ferment l'énergie nécessaire pour décomposer le gaz carbonique ; la lumière qui agit chez les plantes vertes
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pour produire cette décomposition serait ainsi remplacée ici pas une réaction chimique exothermique ; la synthèse de la matière organique du Nitrosomonas serait, non par un phénomène de photosynthèse, mais de chimiosynthèse: c’est d’ailleurs le seul exemple bien connu d'organismes dépourvus de chlorophylle et utilisant cependant le gaz carbonique de l'air.
GODLEWSKI à repris la question de savoir si c'était le gaz carbonique libre ou directement le carbonate de magnésium qui se trouvait constituer pour les bactéries nitreuses la source de carbone : il montra que si dés le début on arrête le gaz carbonique de l'air passant dans la culture; on n'obtient aucun développement; c'est donc bien le gaz carbonique libre qui est utilisé; mais la dose initiale peut être très faible, car, à mesure que l'ammoniaque est oxydée, il se forme de l’acide nitreux qui libère du gaz carbonique à partir du carbonate de magnésium.
La nitrosation est influencée par la quantité d’ammoniaque contenue dans la solution ; elle s'arrête tout à fait pour une dose de 4o grammes de sulfate d'ammonium par litre. D'autre part les nitrites, à certaines À doses, diminuent ou arrêtent la réaction : il en est de même des nitrates.
Les substances organiques suivantes arrêtent la fermentation nitreuse aux doses indiquées ci-dessous (WinoGrADsky et OMELIANSKY) :
PCA AO Med TT LS à P. 100 HÉRATA PIN Pare D EN SL: 05-052:
De O SR ST EN PAS LTÉE à 0 025 1 DSP TOR Er Fe 0:02 2
et ce serait la multiplication des bactéries plus que
236 CYCLE DE L’AZOTE leur fonctionnement qui serait ainsi entravée par ces
substances, Enfin les ferments nitreux sont capables d'agir sur certaines bases azotées autres que l’ammoniaque,
l'aniline, la pipéridine.., mais la fermentation est
d'autant plus difficile qu’il s’agit de molécules plus complexes.
Ferments nitriques. — Winocrapsxy a isolé d'une terre de Quito (1891) une bactérie qu'il a rapportée au genre Mitrobacter (fig. 48), et par un procédé analogue à celui qu'il employa pour isoler les ferments nitreux;
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