SUR LA FERMENTATION LACTIQUE

Par M. Charles Richet

1° Action du formol. .

Je donnerai très brièvement l'indication des méthodes employées pour le dosage de l'acidité du lait fermenté.

Une quantité connue de lait non stérilisé est mise à fermenter, après addition de potasse pour diminuer son acidité au moment du début de l'expérience, et de phénolphtaléine

1. Les mémoires relatifs à l'influence des doses faibles de diverses substances sur la fermentation lactique ont été écrits successivement, après chaque série d'expériences, dans le cours de trois années de travail. Evidemment il y a eu des progrès dans la technique peu à peu réalisés, de sorte que la méthode a subi des changements graduels. De là des contradictions apparentes, et surtout des répétitions, chaque mémoire devant faire en quelque sorte un travail homogène, et se suffisant à lui-même. Au lieu de les corriger et de les modifier, nous avons préféré les donner ici, sans remaniement, et tels qu'ils ont paru dans les Archives internationales de Physiologie. Le lecteur pourra ainsi suivre pas à pas par quelles séries d’expérimentations et de déductions — des tâtonnements — je suis arrivé aux résultats consignés dans le dernier mémoire.

comme indicateur (08,01 par litre). Puis, après fermentation à 40° dans des conditions rigoureusement identiques, chaque tube est dosé par une solution de potasse contenant 10 gr. de KOH par litre. Pour éviter les variations de température, tous les tubes contenant, s'il n'y°a pas d'autre indication donnée, 50 cc. de liquide, sont plongés dans un vase plein d'eau, lequel vase est mis dans l’étuve réglée à température constante. La forme et le diamètre des tubes sont absolument identiques.

Quoique mon étude relative à l’action des doses faibles ait porté sur diverses substances, je ne mentionnerai ici que les expériences faites sur le formol'. On verra que les résultats sont très nets ; el, quelque imprévue que puisse paraître cette affirmation, je montrerai que le formol agit encore sur la marche de la fermentation lactique à la dose invraisemblablement faible de 05',000000 001 par litre, soit, pour faire mieux comprendre la faiblesse de ce chiffre, à la dose

d'un millième de milligramme pour 1000 litres.

1. Le formol dont je me suis servi est le formol (aldéhyde formique) qui est dans le commerce en solution de 40 p. 100. Pour diluer ce formol dans le lait, je prenais soin d’abord de le diluer dans l'eau distillée, à la dose de 0,1 par litre, parfois 0,001, et même 0,000 1. Des quantités variables de cette solution diluée étaient ajoutées au lait, et ce lait ainsi formolé servait de solution formolisante.

Quelquefois la solution de formol était ajoutée au lait à la dose de 1 goutte ou 2 gouttes. 1 goutte représente 0°°,05. Par conséquent, pour avoir un lait contenant par litre 08,000 000 1 de formol, il suffit d'ajouter à 50 ce. de lait 1 goutte d’une solution de formol à 0,000 1 par litre.

Le lait employé était du lail pur venant d'élre trail. Or cette indication n’est pas inutile à donner. Pendant longtemps, nous n'avons eu que des résultats imparfaits, car nous avions employé du lait acheté à une crémerie quelconque. Or, après avoir constaté qu'il fermentait mal, nous avons fait une enquête, de laquelle il est résulté que les laitiers ajoutent au lait une poudre antiseptique, qu'ils appellent, en style imagé, un conservaloire, pour empêcher le lait de tourner. C'est là, disent-ils, une pratique générale, nécessaire à la vente. Il s'agit sans doute d’acide salicylique. Nous signalons à qui de droit ce fait, qui est grave au point de vue de l'hygiène publique.

Les premières expériences faites avant que j'aie imaginé une méthode plus exacte, sont imparfailes ; car, pendant le temps nécessaire au dosage, la fermentation continue, et on est forcé d'avoir recours alors à la chaleur ou au chloroforme, pour empêcher l’action progressive du ferment, manœuvres qui modifient sans doute les résultats dans un sens que nous ne pouvons prévoir. D'autre part, si l’on se contente d’un simple dosage, il faut faire des corrections, selon le temps employé à ces dosages successifs, et l'emploi des corrections est toujours dangereux.

Quoi qu'il en soit de ces réserves, je donnerai quelques chiffres obtenus dans la première série d'expériences.

Voici d’abord le résultat d’une première expérience directrice.

Acidité du lait Ac. du lait Ac. du lait après Moyenne des III Dose de formol après 4 h. après 6h. longue exp. au froid. laits formolés. par litre. Tém.— 100. Tém.— 100. Tém.— 100. Tém.— 100. 0.25 24 0 1.8 8.6 0.12 26 # 2.9 4 LU) 0.06 40 14 3.3 19.0 0.03 60 30 4 34.0 0.015 76 43 22 #7 0.0075 90 97 68 12 0.0037 85 86 81 87 0.0018 105 86 83 91 0.0009 105 99 97 100 0.000#5 98 103 102 101 0.00022 97 113 106 105

On voit très nettement que, même à des doses très faibles, soit deux dixièmes de milligramme par litre, il ya encore une action qui se traduil par une légère accélération de la fermentation, donnée qui, depuis mes expériences déjà anciennes sur l’action antiseptique des métaux, est devenue classique".

1. Voir Comples rendus de l’Académie des sciences, 1892, CXIV, 1494.

| Il s'agissait de pousser l'expérience plus loin, en diminuant encore la dose. L'expérience suivante (11) prouve que, même à dose beaucoup plus petite, il y a encore accélération.

Acidité Acidité Acidité Moyenne du lait du lait du lait des III Jaits Dose de formol après 4 h. après 6 h. après 9 h. formolés

par litre. Tém. — 100. Tem.—100. Tém.—100. Tém.=— 100. 0.012 1.6 2 3.8 2,8 0.006 0.8 ae 3.8 2.8 0.003 22 2.8 5.4 10.1 0.0015 29 21 12.1 20.7 0.00075 63 9 d0.4 50.1 0.00037 83 rh) 73.0 Fo 0.000185 91 92 5 89 0.000092 103 106 90 100 0.000046 {11 112 n 11h lil 0.000023 103 105 10% "104 0.0000115 113 111 108 AI 0.000006 123 109 107 113

Une autre expérience (IT), sériée de la même facon, m'a donné des résultats analogues, avec une dose un peu plus faible encore.

Dose de formol Acidité du lait Dose de formol Acidité du lait par litre. Tém.— 100. par litre. Tém.— 100.

Afin de faire un plus grand nombre de dosages, j'ai supprimé les expériences portant sur des quantités de formol intermédiaires.

L'expérience IV ne porte que sur quatre proportions de formol (11 tubes témoins, 16 tubes formolés).

Acidité du lait Acidité du lait Moyenne des Dose de formol après 2 h. après 6 h. laits formolés par litre. Tém.— 100. Tém.— 100. Tém.— 100.

Dans l'expérience V, les résultats sont beaucoup plus nets, et la dose de formol encore plus faible (témoins, 13 tubes; tubes formolés, 30).

Acidité du lait Acidité du lait Moyenne des après 3 h. après 6 h. laits formolés Formol par litre. Mém,—100: Tém. = 100. Tém.— 100. 0.0005 128 83 105 0.000005 218 233 226

Si l’on fait des expériences très nombreuses, on doit tenir compte du temps mis à faire le dosage, et on peut essayer d'annihiler cette accélération, ce croît pendant le dosage, croit qui est lui-même variable, en dosant successivement un flacon de chaque série. Dans l’expérience VI, l’ordre adopté a été : 1° le témoin ; 2° le flacon contenant 02,000 00001 de formol ; 3° le flacon contenant 02,000 01 de formol.

On a alors, en chiffres absolus, c’est-à-dire en centimètres cubes, de solution potassique :

Lait Lait

avec 0.00000001 avec 0.00001

Témoin. de formol. de formol.

qers dosages. 2 (0) 5.10 9.19 2es NO GE LS D.A0 o.45

De Le NOR 5.20 5.85 BR CN ENONCE 5.70 5.45 DES eu ONE 5.75 5.35 ES 5.65 5.45 RAR à et OU 5.60 5.60 SRE he Le PT RE 5.65 5.65 es, , 0. SD 5.80 5.85 10 MES... : DOME 6.50 6.15 dise > CERN n (ST, 6.05 6.15

jan MN 6 5.85 ;

Ce qui donne les moyennes suivantes :

Six premiers dosages Témoins — +0 — — — Formolés (0,000 000 01 — 105 — —- (0,000 01) —105

Mais pour les six derniers dosages, les résultats sont autres, et on trouve respectivement 100, 96 et 96; de sorte que cette expérience ne serait nullement décisive, si l’on ne tenait pas compte du moment où le dosage a été fait. Il m'a paru que, dans les premières périodes de la fermentation, les doses faibles de formol aecélèrent ; tandis qu'aux périodes plus avancées, les mêmes quantités faibles de formol ralentissent. Je donnerai plus loin la démonstration de ce double phénomène, qui passerait inaperçu, si l’on se contentait de prendre les moyennes brutes. L'expérience VIT, faite de la même manière, a été plus concluante.

Trente dosages ont été effectués en 1"47'. Pendant ce temps, le croît a été de 7,45 d'acide lactique (évalué en solution de potasse), par conséquent, par minute, de 0,075. Or, comme chaque dosage a pris un temps moyen de 1'48”, il y a eu, par dosage, un accroissement de 0,11, qu'il faudra retrancher du chiffre des tubes formolés, pour le premier dosage consécutif, et 0,22, à retrancher des tubes formolés, pour le second dosage consécutif. En faisant cette soustraction, on à les chiffres suivants (en valeur absolue):

Lait avec 0.00001 Lait avec 0.00000001

Témoins. de formol. de formol.

NP AHOSBS. . . . : 20.5 10.84 10.73 288 — er ir 0 14.44 12.42 3° —= Le: 0 11.54 12.63 ges — 4.0. 00 12.99 1518 Des RAS Mn LS 13.94% 14.03 (5 2— D eV 15.09 1019 fic — sater 85 15.94 15.08 ts — 000 10219 16.19 16.68 ges == CE 17.54 17.08 10°S — A CE 18.0% 17.58

Moyennes. . . 14.39 14.37 14.68

Centésimalement, si les témoins —

RICHET

100, les tubes à

0,000 01 sont — 100 ; les tubes à 0,000 000 Û1 — 102. Diffé-

rence encore très faible.

Dans l'expérience VII, où le croit a été négligeable, on

dell:

Témoins (moy. de VI).

Tubes (avec 0,000 01 de formol) n moy. de VID). Tubes (avec 0,000 00001 de formol (moy. de VIT)..

Quoiqu'il s'agisse d’une différence qui parait faible, elle est cependant certaine, et on peut la mettre en lumière en sériant les divers tubes, sans tenir compte du temps où le

dosage a été fait, quoiqu’ on les ait espacés méthodique-

ment.

Tubes avec 0.00001 Témoins. de formol.

Tubes avec 0.00000001 de formol.

L'influence accélérante de doses minuscules ressort nettement de toutes ces expériences ; mais ces doses minuscules

ne peuvent, évidemment,

à dose pondérable.

effectuer qu'une minuscule, et il serait insensé de chercher à trouver quelque chose qui ressemble à l’action des substances antiseptiques

accélération

Pour éliminer l'influence du croît pendant le dosage, j'ai ajouté à chaque flacon, immédiatement avant le dosage, et simultanément dans tous, à la même dose, du chloroforme. Voici le résultat, assez peu net, de cette expérience IX, en sériant d'après la quantité de potasse employée pour la

neutralisation.

Lait avec 0.00001 Lait avec 0.000 000 01 Témoins. de formol. de formol.

6.40 6.70 6.60 6.70 6.75 6.65 6.85 6.95 6.75 6.90 7.10 6.85 7.00 AS 6.95 1.49 7.20 7.05 [7.16] 1.30 7.05 1225 1:39 71.20 AE 1.10 7.45 1.45 8.00 7.45 8.90 9.75 10.40

Si j'ai donné cette expérience, c'est pour montrer que, dans certains cas, des éliminations sont nécessaires, et que nous devons, — ce qui est parfaitement légitime, — retrancher le chiffre le plus fort de chaque série. La moyenne devient alors :

Témoins. ="1,02 = 100 Tubes avec 0,000 01 f. 1,9% 108 Tubes avec 0,000 000 O1 f. — 7,00 — 100

Il ressort de toutes ces expériences que les doses faibles de formol ne sont pas inefficaces.

Mais, comme il s'agissait de démontrer un fait hautement invraisemblable, des expériences plus nombreuses et plus précises étaient nécessaires.

IT

J'ai alors procédé de la manière suivante. Les laits témoins et les laits formolés étaient tous, après fermentation, additionnés de la même quantité de potasse, calculée de manière à donner au lait une teinte légèrement rosée ; puisque avant fermentation toutes les liqueurs avaient été additionnées de la même quantité de phénolphtaléine. Si la fermentation a cheminé de manière identique, la teinte rose

est exactement la même, ainsi que je l'ai constaté dans des, expériences de contrôle, Si, pour une cause ou une autre, la,

fermentation n'a pas été égale, on saisit très nettement les. plus faibles nuances dans la coloration rosée plus ou moins, fonece des tubes. Certains sont tout blancs, d’autres ont une”

teinte rosée à peine perceptible ; d’autres sont roses, d’autres

sont très rouges. |

La sensibilité est telle, qu'on peut, en opérant sur des“ tubes de diamètres différents, voir apparaître l'influence du diamètre des tubes. |

Dans des tubes de verre identiques, à cela près qu'ils ont" un diamètre soit de 21, soit de 22 millimètres, on voit tout de suite, par la différence des teintes, que dans les tubes plus larges, de 22 millimètres, la fermentation a été plus active, par suile probablement de l'action de l'oxygène atmosphérique sur une plus large surface (j'ai montré il y a. longtemps que la fermentation lactique est aérobie).

Nous avons done là un procédé permettant de déceler des variations minuscules dans l’activité d’une fermentation, sans qu’on ait à lenir compte du moment où se fait le dosage, puisque la compression se fait simultanément pour tous les tubes.

Ce procédé à encore deux autres avantages, qui ne sont pas à dédaigner.

Il est très rapide; car l'addition à une quarantaine de tubes d’une même quantité de solution potassique est plus rapide et plus facile que le dosage acidimétrique de ces quarante tubes.

Ensuite, on n'a plus à craindre l'erreur personnelle, ni à se précautionner, ainsi que je devais le faire toujours, contre une idée préconçue, puisqu'on peut classer les tubes d’après leur couleur rouge, rosée, blanche, sans savoir quelle est la signification de cette classification. C'est, d’ailleurs, un dosage que tout le monde peut contrôler, et dans toutes ces expériences, J'avais pour assidu collaborateur P. Lassa-

FERMENTATION LACTIQUE ET DOSES MINOSCULES. 303

8LIÈRE, dont le témoignage venait confirmer le mien, et qui à acquis une grande habitude de cette laborieuse expérimentation.

Pour donner à ces expérimentations une valeur numérique, voici comment il était procédé.

Soient, je suppose, #0 tubes avec lait ayant fermenté dans les conditions susdites, rigoureusement égales pour tous les tubes. On verse dans chaque tube, par la burette de Mour, 18 ce. de la solution de potasse, je suppose. On agite, et on range ces tubes, sans savoir quels numéros ils portent, en les adossant contre une surface blanche, selon l'intensité de leur coloration. On peut, suivant les cas, dislingues deux, trois, quatre, cinq groupes. Pour préciser, supposons qu'il y ait cinq groupes différents :

Rouges foncés ; très roses ; rosés ; à peine rosés; blancs.

On peut donner des numéros d'ordre, comme des coefficients, à ces cinq groupes, en donnant aux blancs, les plus acides, le chiffre 5, et aux rouges, les moins acides, le

chiffre 1. Soit, dans le schéma que je propose, les proportions suivantes :

Coefticients. Témoins. Tubes formolés.

Rouges foncés. . . . . . (1) G 2 need beta 04 natal 4 3 Éd oo 10... 5 5 Arpeine roses. - ... -. "(8 3 ù ER a RL OeR s 2 RO) 2 )

La valeur relative de ces divers flacons en acidité lactique sera alors déterminée de la manière suivante :

Témoins 6X1— 6 Tubes formolés 2 X 1 — 2 — SG à —- C2 0

— MONO — D ID — SU Ep — Dee 400 — DS — Mn == 29 Total= #51 Total = 68

Moyenne — 2.55 Moyenne — 3.40

L'acidilé moyenne des tubes formolés sera donc de 3,40, contre 2,55 (acidité des tubes témoins). Et, en faisant égale à 100 l'acidité des tubes témoins, on aura 130. Mais il faudra bien se rendre compte que cette proportionnalité n'est exprimée que par un chiffre arbitraire.

Bien entendu, il y a des cas, assez nombreux, où aucune différence n’est perceptible, et d’autres cas où il y à autant, de tubes témoins que de tubes formolés dans les divers groupes.

Nous avons résumé ces expériences dans les tableaux suivants, qui résument toutes nos expériences.

La première colonne indique la date, la seconde indique la quantité de cc. de la solution potassique (à 4 p. 100) qu'il a fallu verser dans chaque flacon pour arriver à une quantité voisine (en plus ou en moins) de la neutralisation. La troisième colonne indique le nombre des tubes mis en expérience, tubes formolés et tubes témoins, généralement en quantités égales. La colonne IV indique le nombre des échelles de teinte employées. La colonne V indique centésimalement l'acidité des tubes formolés, en supposant l'acidité des témoins — 100. Mais, nous le répétons, cette dernière mesure. est arbitraire. Elle a une grande valeur qualitative ; mais sa valeur quantitative est moindre. Ou, du moins, les valeurs quantitatives, comparables entre elles, ne pourront être assimilées aux valeurs obtenues par un dosage volumétrique.

Nous n'avons employé que deux solutions de formol : l’une à 0£",000 00001 par litre de lait; l’autre à 0£",000 0000014. De fait, les résultats ne nous semblent pas différents dans l’un et l’autre cas.

Nous indiquerons, pour des raisons qui seront mentionnées plus loin, quand il y a eu un changement de la solution mère de formol.

Date,

Dilution de formol : 0 gr. 000 000 01 par litre de lait.

Quantité de KOH en cc.

pour 50 ec.

de lait.