CHAPITRE XVI

COUPES BACTÉRIOLOGIQUES

L'examen bactériologique des coupes a pour but tout à la fois de déceler Les microbes et d'étudier les lésions.

Cet examen ne peut être fait utilement qu'après coloration. Il faut d'abord traiter les pièces comme on le fait en histologie : prélever, fixer, inclure ; puis débiter en coupes, coller ces dernières sur lames, enfin colorer.

Prélèvement, — Les pièces qu'on désire couper seront prélevées aussi fraiches que possible : chez l'animal en expérience, sitôt après la mort. Chez l'homme, seules les pièces opératoires peuvent être fraîches; pour les autopsies, on est forcé de respecter les délais légaux, et les pièces qu'on y prélève présentent toujours des alté rations dites cadavériques.

On coupera des fragments avec des instruments très propres. Leur épaisseur ne dépassera jamais 6 ou, au grand maximum, 10 millimètres ; il est presque toujours possible de limiter à 5 ou 6 millimètres. Les deux autres dimensions peuvent atteindre sans inconvénient 1 à 2 centimètres.

Fixation. — Sitôt prélevés, les pièces seront fixées.

Les agents tixateurs doivent respecter à la fois les tissus et les microbes. Certains fixateurs employés en histologie, fixant mal les microbes, ne sont pas applicables. On s’adressera de préférence à l'alcool, au sublimé ou au formol.

Quel que soit le fixateur employé :

Noyer la pièce dans une grande quantité de liquide (au moins. vingt-cinq fois son volume);

Placer au fond du récipient une couche de coton hydrophile, pour permettre l’imprégnation sur toutes les faces.

. Arcooc. — a. Plonger les pièces pendant vingt-quatre heures dans l'alcool à 60° ou 70°;

b. Enlever, plonger dans l’alcool à 80° ou 90°, même durée;

c. Enlever, plonger dans l'alcool absolu, un à deux jours.

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L'alcool fixe bien les bactéries, mais assez mal les tissus, qu'il rétracte. De plus il durcit beaucoup, ce qui gêne le débitage des coupes quand le tissu renferme beaucoup detissu conjonctif dense ou de tissu musculaire. Il est suffi ant dans la majorité des cas.

Des fragments très petits peuvent à la rigueur (mauvaise fixation) être placés directement dans l'alcool absolu.

On se méfiera de l'alcool dit « absolu » du commerce. Si l'alcool est absolu, il ne fait pas émulsion quand on le mélange au xylol. On peut déshydrater l'alcool en y plongeant un sachet renfermant du sulfate de cuivre desséché (blanc). En s’hydratant, le sel de cuivre devient bleu.

SUBLIMÉ. — C’est le meilleur fixateur. On utilisera de préférence le sublimé acétique :

SUDUMÉS Es 0 ONE 4 à 5 grammes., Acide acétique glacial........... 1 centimètre cube. EAU ESS ee RU De ASS 100 centimètres cubes.

La solution est instable : à préparer au moment du besoin. a. Plonger la pièce dans la solution fixatrice; laisser séjourner jusqu'à ce qu’elle soit complètement opaque (temps variable :; quelques heures à vingt-quatre heures). PURE b. Enlever ; plonger dans l'alcool à 70° additionné de teinture diode jusqu’à teinte brune. L'iode dissout le sublimé en excès. Si l'alcool se décolore, ajouter à nouveau de la teinture d'iode, jusqu’à ce que la coloration persiste, Temps moyen : vingt-quatre heures. c. Enlever; porter dans l'alcool à 800.

L'addition d’iode au temps 6 est indispensable, sans quoi le sublimé se

dépose dans les coupes et donne des cristaux, génants pour l'observation. Pour manipuler, au cours des fixations par le sublimé, faire usage à

d'instruments non métalliques (corne, bois, verre). ;

Formoz. — Le formol convient à tous les tissus, y compris le système nerveux; la fixation est imparfaite, mais suffisante pour les besoins courants.

Préparer la solution fixatrice en diluant le formol du commerce dans l'eau salée à 7,5 p. 1 000, en proportions variables : 6 à 8 p. 100 dans la plupart des cas ; 10 p. 100 pour le système nerveux.

Porter la pièce dans la solution de formol. La fixation est obtenue |

en six à vingt-quatre heures, suivant le volume du fragment.

Conservation. — Si eiles ne sont pas incluses de suite, les pièces fixées par l'alcool ou le sublimé seront conservées dans l'alcool à 80° (non dans l'alcool fort, qui les rend cassantes). Fixées au formol, elles peuvent être conservées ou dans la solution fixatrice même ou dans l'alcool à 800.

Inclusion à la paraffine. — Pour obtenir des coupes fines utilisables en bactériologie, il faut inclure les pièces, c’est-à-dire

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les imbiber d’une substance liquide susceptible d’être solidifiée. On s'adresse à peu près exclusivement à la paraffine ; d’autres procédés utilisés en histologie (collodion et celloïdine entre autres) ne permettent pas d'obtenir des coupes assez fines.

I. Il existe diverses variétés et diverses qualités de paraffine. Les" variétés sont caractérisées par leur point de fusion; il faut se munir de deux échantillons au moins, fusibles l’un vers 450-500 {paraffine molle), l'autre vers 55° (paraffine demi-molle). On rejettera toute paraffine non homogène, cassante; une paraffinc de bonne qualité doit être souple.

Il. La plupart des échecs dans la pratique des inclusions viennent de ce que les pièces ne sont pas suffisamment déshydratées ; la paraffine, insoluble dans l'eau, les pénètre mal. La déshydratation doit être complète; mieux vaut pécher par excès que par défaut.

IT. Certains tissus (derme cutané, tissu conjonctif dense, tissu musculaire) se laissent mal imbiber par les liquides : on augmentera de moitié la durée des temps indiqués ci-dessous ; les fragments seront très petits.

IV. La paraffine est soluble dans le xylol, le foluène, le chloroforme, etc., liquides utilisables pour l'inclusion. On emploie d'ordinaire le xylol.

Technique. — Pour chacun des temps de l'inclusion, nous indiquerons la durée minima approximative de séjour dans chaque liquide pour trois sortes de pièces : petites (environ { millimètre de côté), moyennes (5 millimètres), grosses (10 millimètres). — Nous supposons partir d’une pièce placée dans l’alcool à 800.

Déshydratation, — a. Porter dans l'alcool à 900.

Pièces petites :6 heures ; moyennes : 12 heures ; grosses: 24 heures.

b. On plonge ensuite dans l’alcoo!k absolu.

Pièces petites : #heures ; moyennes : 12 heures; grosses : 24 heures.

S'assurer au préalable que l'alcool est absolu (Voy. p. 250).

Imbibition par le æylol. — c. Au sortir de l'alcool absolu, placer dans le xylol.

Petites pièces : 1 heure et demie; moyennes : 3 heures ; grosses : 6 heures.

On reconnaît que l’objet est entièrement imprégné de xylol quand il est devenu uniformément translucide. Si les durées indiquées ne suffisent pas, prolonger‘ davantage.

Ces trois temps s'effectuent d'ordinaire à la température ambiante.

Imbibition par la paraffine. — d. Porter ensuite dans un mélange de xylol et de paraffine molle, à l'étuve à 370. Parties égales de chaque substance, ou deux tiers de xylol pour un tiers de paraffine.

Pièces petites : 1 heure ; moyennes : 3 heures ; grosses : 6 heures-

e. Plonger enfin dans la paraffine molle pure, fondue, vers 50° 550 ; porter à l’étuve à 500-55°; ne jamais dépasser 60° (coagulation

de l’albumine).

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Petites pièces : 1 demi-heure ; moyennes Srheuress Br OSSHS 3 heures.

La température nécessaire au temps e altère un peu les tissus; on ne maintiendra pas les pièces au delà de la durée indiquée.

Moulage. — f. Reste à enrober la pièce dans un bloc de paraffine. On utilise dans ce but un moule.

Moules à paraffine. — I est facile de fabriquer les moules soi-même. Prendre un bouchon cylindrique dontle diamètre dépasse du tiers au moins celui de la pièce; enrouler autour du bord supérieur un papier épais taillé ad hoc, de façon à constituer un cylindre de 2 centimètres de hauteur; fixer avec une épingle ou du fil.

On peut s'ingénier à d’autres expé-.

dients : utiliser par exemple des boîtes en papier, ou en carton; ou des capsules à bouteille, en étain. :

Le mieux est de se servir du moule de Leuckardt (fig. 134); deux fortes lames métalliques en L. Accolées par leurs petites branches, elles forment une cuve dont on variera la longueur suivant les besoins. Placer le moule sur une lame de verre, formant fond.

Fig. 134. — Moule à paraffine.

Technique du moulage. — Faire fondre de la paraffine dans une capsule en porcelaine. On prendra en été une paraïfine fusible à 55°; en hiver, de la paraffine molle. Attendre qu’une pellicule se forme à la surface. ‘

A ce moment, enlever la pièce de l’étuve à 559; verser dans le moule la paraffine de la capsule ; y plonger doucement la pièce, et assurer à cette dernière l'orientation voulue à l’aide d'’aiguilles chauffées; au besoin, maintenir les aiguilles en place jusqu'à ce que la paraffine commence à devenir opalescente-

Quand la surface est devenue opalescente, transporter le moule — sans le comprimer — dans un bain d’eau froide (cuvette plate, cristallisoir), en prenantsoin de ne pas mouiller la face libre du bloc.

Dès que la masse est devenue solide, écarter le moule. Le bloe, renfermant la pièce, est prêt à être coupé.

Débitage des coupes. — Les pièces incluses dans les moules seront coupées à l'aide des microtomes habituellement employés en histologie. Nous ne pouvons les décrire; signalons le modèle le plus courant : microtome Minot (fig. 1435). Les coupes auront une épaisseur de 1/200 à 1/500 de millimètre.

Collage des coupes ; enlèvement de la paraffine. — Les coupes bactériologiques sont en général trop délicates -pour se prêter

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à des manipulations directes. Il faut les coller (les fixer) sur une lame porte-objet. Il sera ensuite nécessaire d'enlever [a paraffine, pour permettre la pénération des solutions colorantes.

COLLAGE. — On se servira de l’albumine glycérinée, albumine de Mayer.

Elle se prépare comme suit : prendre un blanc d'œuf, mélanger avec partie égale de glycérine : battre fortement, mettre à filtrer sur papier-filtre ordinaire (la filtration est très lente, 24 à 48 heures au moins). Ajouter au filtrat un cristal de thymol pour assurer la conservation. , | Conserver en flacon bien | PR to sd Re bouché.

On préparera d’autre part : de l’eau chaude (vers 400-450), à répartir dans un couvercle de boîte de Petri; du papier de soie.(le papier à cigarettes est parfait); du papier-filtre; des aiguilles à dissocier.

a. Enduire les lames, bien sèches, d’une couche extrêmement mince d'albumine glycérinée. Le plus simple est d'y déposer une très petite goutte, et d’étaler avec le doigt.

b. Prendre les coupes avec l'aiguille, les déposer à la surface de l'eau chaude. Elles s'étalent, grâce à la chaleur. Avec les aiguilles, séparer les coupes, et au besoin compléter l’étalement.

c. Plonger dans l’eau la moitié inférieure d'une feuille de papier de soie, large de 2 à 3 centimètres; amener une coupe sur le papier.

d. Très rapidement, enlever le papier de soie, renverser sur une lame (comme pour décalquer), en ayant soin de ne pas laisser se faire de plis. La coupe est entre la lame et le papier.

e. Sécher à l’aide de papier-filtre posé bien à plat et pressé sur le papier de soie. Enlever le papier-filtre, puis le papier de soie. Si la dessiccation est suffisante, la coupe reste adhérente.

[. Porter au-dessus d’une veilleuse, jusqu'à ce que la chaleur ‘soit insupportable au dos de la main (environ 60). La fixation est faite.

Le temps f est un peu délicat. Si on chauffe trop, des bulles se forment et décollent la coupe; si on ne chauffe pas assez, l’albumine n'est. pas coagulée, et la coupe n’adhère pas. C'est une éducation à faire.

On peut porter dans l'étuve à 55° pendant une demi-heure,

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Enlèvement de la paraffine. — Laver, doucement, au xylol, qui dissout la paraffine ; la coupe devient transparente. Égoutter.

Laver à l'alcool absolu. La coupe devient opaque.

Plonger dans un petit cristallisoir ou un verre plein d’eau.

On peut commencer alors la coloration.

Coloration.

Dans la coloration d’une coupe bactériologique, on cherche surtout à voir les microbes; il faut donc les différencier du tissu où ils se ‘trouvent. Il est souvent indiqué de colorer également le tissu de telle

manière qu'on puisse tout au moins apprécier Les rapports topogra-

phiques des microbes avec les éléments anatomiques. Il existe des méthodes générales et des méthodes spéciales.

REMARQUES. — Ï. Verser les colorants ou réactifs à côté de la coupe (ct non directement sur elle); faire glisser sur-la coupe en inclinant la lame.

II. Ou bien, porter la lame dans un baïn de colorant ou de réactif.

III. Pour les lavages à l’eau : disposer un petit récipient (verre, cristallisoir) plein d’eau; y plonger les coupes.

IV. Une coupe colorée peut être examinée entre lame et lamelle, en intercalant une goutte d'eau. Il vaut mieux monter au baume du Canada.

V. Montage au baume. — Avant de monter dans le baume du Canada, il faut d’abord déshydrater, puis enlever l'alcool absolu par le xylol. — Le

xylol éclaircit les coupes. On peut éclaircir davantage, en faisant agir.

l’essence de girofle avant le xylol, mais l'essence décolore.

Pour monter, employer le baume du Canada dissous dans le xylol, de consistance sirupeuse. — Déposer une goutte de baurñe au bord de la préparation ; saisir par la tranche une lamelle bien propre, la chauffer légèrement pour enlever toute trace d’eau ; poser la lamelle sur le côté libre du baume, laisser tomber par son propre poids; appuyer RC nt pour étaler le baume.

Méthodes générales. — Nous étudierons la coloration simple et la méthode de Gram.

Coloration simple. — Elle est applicable à tous les microbes qui se décolorent facilement par les couleurs d’aniline.

A. PROCÉDÉ au TaniN (M. Nicoice). — a. Colorer pendant quelques minutes au bleu phéniqué.

b. Laver à l’eau. Faire agir pendant quelques secondes une solution aqueuse detanin à 10 p. 100. Le tanin rend à peu près insoluble le colorant fixé par les microbes ou les tissus.

c. Laver à l’eau. Déshydrater par l'alcool absolu.

d. Passer au xylol, monter. |

B. PROCÉDÉ À LA THIONINE (M. NicoLLE). — Procédé de choix.