CULTURES. AR EN

Le Bacille diphtérique est un anaérobie facultatif, mais il pousse mieux en aérobiose.

Il commence à pousser à partir de 20°, mais jusqu'à 30° la culture est lente et maigre. La température optima est de 35 à 37°.

Bouillon ordinaire.—En bouillon de bœuf,etmieux en bouillon

Fig. 188, — Corpuscules métachromatiques de Neisser.

de veau peptoné, le Bacille de Lôffler trouble assez rapidement le milieu. En même temps de petits grumeaux blancs apparaissent sur les parois du vase, et à la surface se développe un voile mince, fragile, blanchâtre. Au fond du tube se dépose une masse blanchâtre, visqueuse ; le liquide s’éclaircit au fur et à mesure. ;

Pendant les premiers jours, après l’alcalinité initiale, le milieu devient acide, pour redevenir alcalin si, en employant un matras de Fernbach, on installe en permanence un courant d'air pendant le séjour à l’étuve.

En bouillon additionné de elycérine ou de sucre, l'acidité apparait plus rapidement et persiste longtemps; elle nuit au développement de la culture et à sa vitalité.

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Bouillon Martin. — Mèmes caractères, mais développement

plus abondant. De plus l'acidité ne se produit pas: enfin la vitalité.

et la virulence du Bacille persistent plus longtemps.

Gélatine. — Cultures minimes. Le long de la piqûre, des colonies blanchâtres, punctiformes, sont perceptibles. Pas de liquéfaction.

Gélose ordinaire.— Colonies se présentant sous forme de taches blanches, un peu plus épaisses au centre qu'à la périphérie ; elles se développent en trente à quarante-huit heures.

D’après Michel, la culture est plus abondante en gélose glycérinée ; de même aussi en gélose à la pomme de terre.

Sérum co£œulé (milieu de choix). — Aprèsseize à dix-huit heures de séjour à l’éluve à 370, les colonies apparaissent sous la forme de petites taches rondes, blanc grisâtre, grosses comme une tête d’épingle, dont le centre est plus’sombre que la périphérie. Vue à un faible grossissement, la colonie est finement granuleuse, sèche à la surface, régulièrement arrondie ; ses bords sont nets etlégèrement translucides. Dans la suite, elles conservent le même aspect, mais atteignent 4 à 5 millimètres de diamètre au bout de cinq à huit jours.

En strie, les colonies deviennent rapidement confluentes et:

figurent une glaire grisâtre dont les bords sont irrégulièrement découpés.

Sur sérum peptoné de Lüffier (3 parties de sérum de veau, 1 partie de macération de viande de veau peptonée et sucrée à 1 p. 100, salée à 0,5 p. 100), la culture est plus abondante.

Albumine d'œuf coagulée.— Si l’on n’a pas desérum à sa dis-

position, l’albumine d'œuf coagulée par la chaleur peut rendre des services. Après vingt à vingt-quatre heures d’étuve, les colonies développées sont rondes, un peu saillantes, moins blanches que le milieu sur lequel elles reposent ; au bout d’une semaine, elles prennent une coloration brunâtre ou jaune rougeâtre.

Pomme de terre. — Sur pomme de terre alcaline, culture peu apparente. Sur pomme de terre acide, le développement est nul.

Lait. — Culture assez abondante, sans aucune coagulation.

Gélose profonde glucosée de Veillon.— L.Martinet Loiseau ont étudié les caractères particuliers de culture sur ce milieu anaérobte.

En piqûre. — Le long de cette dernière et dans la profondeur de la strie, les colonies se développent, mais sans s'étaler à la surface du milieu.

En masse. — Quand, après liquéfaction de ce dernier, on ensemence le bacille diphtérique dans toute l’étendue du milieu, ce

bacille pousse sous la forme d’un semis de petites colonies qui se répartissent uniformément dans toute l'épaisseur de la gélose, dans la profondeur comme à la surface ; les colonies superficielles ne s'étalent pas à l’air libre, même si on abandonne pendant plusieurs jours les tubes à la température du laboratoire

Ces caractères sont différents de ceux qu’on observe avec les bactéries diphtériformes et notamment avec le Bacille de Hoffmann qui pousse exclusivement en aérobiose, et dont la culture se montre uniquement à la surface (V, p. 432).

Vitalité. — D'une facon générale, le Bacille diphtérique présente

une grande résistance vitale.

Dans les cultures, il est déjà très vivace, puisqu'une vieille culture en sérum datant de plusieurs mois peut donner encore un ensemencement positif.

Il résiste peu cependant à la chaleur quand il provient d’une culture en bouillon : quelques minutes à 350 suffisent à le détruire. Mais, quand la culture a été desséchée, il supporte volontiers la température de 959 pendant plusieurs minutes.

La lumière diffuse, d'après Ledoux-Lebard, se montre presque inactive : il n’en est pas de même de la lumière solaire, qui a raison de sa vitalité en quelques heures.

Très sensible aux antiseptiques (acide phénique à 1 p. 100), qui tuent les cultures en quelques secondes, quand elles sont humides, le Bacille de Lüffler est beaucoup plus résistant si la même culture a élé préalablement desséchée : ainsi Chantemesse et Widal, en expérimentant sur des fils de soie trempés dans les cultures, puis desséchés à l’étuve, et plongés dans les divers antiseptiques, ont vu qu'il résistaitau moinstrois minutes à l’action des produits suivants : acide phénique à 1 p.100, sulfate de cuivre et sulfate de zinc à 0,5 p. 100; biiodure de mercure à 0,5 p. 100, eau salolée, acide salicylique en

-solution alcoolique à 5 p. 100, etc. | |

Dans les fausses membranes, surtout soumises à la dessiccation, la résistance est encore beaucoup plus considérable :

D’après Roux et Yersin, des fausses membranes desséchées, mises à l'obscurité, peuvent ner des cultures positives après plusieurs mois. D'ailleurs Park, Wright ont constaté sa longue vitalitésur les vêtements d'infirmiers, Abel sur des jouets d'enfants ayant eu la

diphtérie. Les poussières des locaux infectés peuvent le conserver à l’état vivant pendant plusieurs mois.

Dorter et SAcOuÉPÉE — Bactériologie, 2e édit. 27

418 BACILLE DIPHTÉRIQUE.

Toutefois, si la fausse membrane a été exposée à la lumière, la vitalité est moins considérable : Roux et Yersin ont montré que, dans ces conditions, le Bacille ne résistait que quatre à six semaines.

Virulenee. — La virulence du Bacille de Lôffler est extrêmement variable. Dans une culture provenant d’un cas dediphtérie, certaines colonies sont très virulentes, d’autres beaucoup moins. C’est en général dans les atteintes graves qu’on trouve le plus de colonies virulentes ; inversement, dans les cas bénins, ces dernières sont rares.

L. Martin a montré que les formes longues du Bacille de Lôffler étaient habituellement les plus virulentes, et queles formes courtes étaient les moins actives, Toutefois cette règle comporte des exceptions : tel Bacille long peut en effet être avirulent, alors que des Bacilles courts peuvent avoir une virulence très accusée (L. Martin).

Cette propriété du Bacille de Lüffler est sujette à des ones suivant les influences qu’on lui fait subir.

En général, elle s'atténue au fur et à mesure que les cultures vieillissent, surtout quand ces dernières subissent l’action d’un courant d'air. La dessiccation à l’air, la lumière agissent dans Île mêmesens. Ainsi, dans une fausse membrane desséchée, les bacilles gardent longtemps leur vitalité, mais ils deviennent de moins en moins virulents.

On peut cependant faire récupérer la virulence à un bacille « atténué » : Roux et Yersin y ont réussi en cultivant en présence d’un Streptocoque un Bacille de Lôffler ne provoquantchez le cobaye qu'un léger œdème au point d'inoculation. Injecté après cette symbiose, il tuait l'animal avec tous les symptômes de la diphtérie expérimentale.

= [est vrai que Roux et Yersin n’ont pu reproduire ces faits avec des bacilles devenus ou étant naturellement avirulents. Pour que l'expérience puisse réussir, il faut que le germe donne au moins, en injection sous-cutanée, de l’œdème au point d'inoculation.

L’exaltation de la virulence peut encore réussir en inoculant des bacilles peu actifs, mélangés à une petite quantité de toxine diphtérique (Trump). Bardoch l’a obtenue chez le chien après vingt-cinq passages dans l'organisme de cet animal, L. Martin chez le lapin, après des passages en série en sacs de collodion.

Réactions biochimiques.— Formation d’acides.— En bouillon, on l’a vu plus haut, le Bacille de Lôffler engendre des produits acides. On suppose que l'acidité est due à la formation d'acide lactique, né aux dépens des hydrates de carbone contenus dans le

milieu. Elle dure tant que l’air ne se renouvelle pas. Si l'air se renouvelle, elle est remplacée par une réaction alcaline, liée à la production d’ammoniaque, se combinant à des produits entrant dans la constitution du milieu, et formant du phosphate ammoniaco-magnésien.

Certains auteurs, dans un but de différenciation du Bacille diphtérique et des germes diphtérimorphes, ont dosé cette acidité à l’aide de la solution normale de soude et de la phénolphtaléine. En ensemençant 5°, 3 de bouillon, le Bacille de Lôffler développerait en vingt-quatre heures, d’après Lehmann, une acidité correspondant à 0cc,7 d’une solution normale de soude à 1 p. 40; en quarante-huit heures, elle s’élèverait à 100,5, ou 266,5, Martin a montré que la production d'acide ou d’alcali est fonction de la composition du milieu.

Action fermentative sur les sucres. — D'après Graham-Smith, le Bacille diphtérique fait fermenter les sucres suivants : glucose, galactose, lévulose, souvent la maltose, la dextrine, la glycérine, parfois la saccharose, mais jamais la mannite.

Les résultats de Knapp, Zinsser ne sont pas conformes à ceux de Graham Smith en ce qui concerne la mannite et la saccharose. Milieu de Thiel. — Pour Thiel, la seule fermentation constante serait celle de la glucose avec le milieu suivant :

RODIUNOS ss se DR senc douss

DAUREUSO PE SR ea re de De &a 1 gramme.

OCDE RNA nai dune sn

RIT CHLSIN ON AVIS NLRS semence ee à Oer,05 Tournesol de Kahlbaum........... 5 grammes, ee AIRES ER TRES EP RNTE * 100 —

On ensemence ce milieu avec du Bacille diphtérique légèrement alcalin ; si la fermentation se produit, le tournesol rougit, la nutrose précipite, parfois le milieu coagule ultérieurement.

Milieu de Rothe. —Rothe a imaginé un procédé qui permet de mettre en évidence, d’une façon constante, la fermentation de la glucose et de la lévulose.

On prépare du bouillon-sérum (4 parties de sérum de bœuf et 1 partie .de bouillon neutre). On mélange 90 parties avec 10 parties d’une solution de tournesol de Kahlbaum contenant 1 p. 10 de sucre à éprouver, et préalablement stérilisée. Ce milieu, réparti en tubes ou en boîtes de Petri, est coagulé par la chaleur, comme le sérum de bœuf simple.

Avec ce milieu, le Bacille diphtérique fait virer au rouge les tubes ou boîtes ensemencés, contenant glucose et lévulose. La réaction est constante et persistante. :

420 BACILLE DIPHTÉRIQUE.

Pour Costa, J. Troisier et Dauvergne, le Bacille diphtérique ensemencé sur le milieu solide qu'ils ont imaginé (V. p. #41), fermente : glucose, lévulose, miltose, gala:tose; il reste sans action sur : saccharose (1), lactose, mannite, dulcite.

Tous les auteurs en tout cas sont d'accord pour Re que,

.quel que soit le milieu utilisé, le Bacille de Lôffler possède une

action fermentative constante sur la glucose : réaction importante à retenir en vuede la différenciation d’avecles diphtérimorphes qui ne font pas fermenter ce sucre. De plus, 'a gélose ylucosée de Veillon additionnée de tournesol rougit sous l'influence de la culture du Bacille diphtérique ; il reste intact si ce dernier est remplacé par le faux diphtérique d'Hoffmann (L. Martin et Loiseau).

Réactions vis-à-vis du sérum antidiphtérique. — Agglutination. — Nicolas, en 1897, a montré que le Bacille de Lôffler pouvait être agzlutiné par le sérum antidiphtérique . Il se servait, dans ce but, non de cultures en bouillon où les microbes s’agglutinent spontanément, mais de cultures rendues homogènes.

D'après L Martin, Prévot et Loiseau, l'agglutination peut s ‘observer avec le sérum d’un cheval vaeciné à l’aide d'une toxine provenant de cultures ayant longtemps séjourné à l’étuve, et où ont macéré des corps microbiens. Elle ne se produit pas quand la vaccination a été faite avec une culture très jeune.

L'agglutination est très nette avec le sérum des animaux immu-. nisés avec Les cultures microbiennes. Elle s'effectue par le procédé

macr oscopique.

On recueille avec une spatule la culture qui a poussé en boîtes triangulaires sur gélose à la pomme de terre (soit 50 centigrammes par boîte). Dans un mortier on opère un broyage et on'l’'émulsionne dans l’eau physiologique, de façon que l'émulsion contienne 2 milligrammes de corps microbiens par centimètre cube. Ce'te émulsion est stable et ne montre aucun dépôt après vingt-quatre heures de séjour à l'étuve.

On verse dans chaque tube 4 centimètre cube de l’'éulsion, out À centimètre cube d'une série de dilutions de sérum. On ne à l’étuve à 370, et on observe après seize à dix-huit heures.

D'après certains auteurs, le Bacille de Lôffler seul subirait l'aggluünation : Les Bacilles diphtérimorphes ne seraient pas agglutinables par le sérum spécifique. Lesieur a montré cependant que certains de ces derniers se comportent comme le Bacille diphtérique.

Enfin le Bacille de Loôffler n’est pas agglutinable par le sérum des: malades. :

(1). D'après L. Martin, la fermentation de la saccharose peut être obtenue sur les milieux. liquides.

HABITAT. — PERSISTANCE. De ASSOCIATIONS SECONDAIRES. 421

Sensibilisatrice spécifique. — Mis au contact avec le sérum préparé par des injections de toxine, le Bacille de Lôffler ne fixe pas le complément ; ce sérum ne contient donc pas de sensibilisatrice spécifique pour les microbes.

Avec du sérum antimicrobien, au contraire, Lambotte a vu la fixation du complément s’opérer.

Les recherches restent négatives avec le sérum des malades.

Avec les Bacilles diphtérimorphes, la réaction n’est pas constante; les résultats de l’épreuve restent donc incertains.

Action hémolytique. — L'hémolyse des globules rouges mis en contact avec des cultures de Bacilles diphtériques a été observée par Lubenau en 1901. Schwoner la constate seulement sur les cultures provenant de diphtéries graves.

Costa, Troisier et Dauvergne ont repris ces recherches. Les milieux solides (sang défribriné mélangé à de la gélose glycérinée), déjà utilisés par Mandelbaum et Heinemann, Neisser et Gins ne leur donnèrent que des résultats variables ou douteux. A l’aide des milieux liquides au contraire (bouillon préparé avec de l'extrait de Liebig), ils obtinrent des résultats constants.

À une culture de vingt-quatre à quarante-huit heures, il suffit d'ajouter une à deux gouttes de sang humain citraté. Quelques heures après, un nuage d'hémoglobine s'élève au-dessus du culot hémolytique ; bientôt le tube entier prend une teinte rouge ; celle-ci s'obtient, suivant les cas, entre trois et quarante-huit heures d’étuve quelques échantillons ne sont Rue qu'après trois à quatre jours. ;

Cette diphtérolysine parait, in vitro, adhérente aux corps microbiens ; elle est thermolabile : Le chauffage à 569 pendant trente minutes atténue son action qui est complètement annihilée à 60°. Elle ne paraît pas être en rapport ni avec la toxicité, ni avec la virulence des échantillons de bacilles.