QUELQUES PRÉCAUTIONS

— a. Pour allumer le gaz, approcher d'abord du bec une flamme (allumeur à alcool, par exemple), puis ouvrir le robinet et attendre l’allumage. Si l’on ouvrait le robinetavantde présenter l’allumeur, le gaz se répandrait dans le cylindre, et le contact ultérieur de la flamme pourrait provoquer une explosion. Une fois le gaz allumé, voir si la flamme est bleue (non blanche) comme elle doit l'être; si elle est blanche, le gaz brûle en dedans: il faut alors éteindre et rallumer correctement.

b. Pour régler le gaz, on à souvent quelques difficultés; les mouvements de la main sont trop brusques et on éteint. Le réglage est plus facile quand on manie le robinet non avec les doigts directement, mais en le frappant à petils coups secs avec un objet pesant, clef d’autoclave ou instrument analogue.

c., Ne pas chauffer au delà du degré voulu, sans quoi le coton ou le papier se carbonisent et dégagent des produits huileux légèrement antiseptiques, qui coulent sur les récipients et les tachent.

De plus, le coton en partie détruit et le papier devenu cassant bouchent ou protègent mal leurs récipients.

d. Ne pas ouvrir le four pendant l'opération; le contact de l'air frais peut suflire à casser la verrerie.

e. Surveiller constamment la marche de l'appareil, et surtout ne jamais abandonner l'appareil en fonctionnement.

Fig. 28. — Stérilisateur de Jouan.

Stérilisateur à air de Jouan. — Pour obtenir une meilleure répartition du chauffage, et une utilisation plus complète du calorique, M. Jouan a fait construire un stérilisateur qui rappelle les fours de pâtissiers; allongé d'avant en arrière, il s'ouvre en avant pour le passage d’un tiroir grillagé dans lequel on dépose la verrerie à stériliser. M. Jouan conseille de ne mettre qu'une hauteur d'objets : tubes ou ampoules, rangés régulièrement (fig. 28).

Le stérilisateur est calorifugé, et l’air qui arrive dans la chambre de combustion, à rampes flamme bleue, est au préalable échaufféen contournant tout l’appareil; le brunissement des cotons, signe de la stérilisation, est obtenu en moins de 30 minutes.

Elle comporte quatre modalités différentes :

Par la vapeur d'eau sous pression ; — par chauffage continu dans la vapeur à 100°; — par chauffage discontinu dans la vapeur d’eau à 100°; — par chauffage discontinu vers 56o.

Nous dirons en outre quelques mots de l’ébullition.

À. Stérilisation par la vapeur d'eau sous pression. — Elle est basée sur le principe suivant : dans une atmosphère de vapeur d’eau, exempte d'air, tous les germes sont tués par exposition pendant vingt minutes à une température de 115.

On sait que la température d’ébullition de l’eau, et par suite la température de la vapeur d’eau produite à l’ébullition, varie suivant la pression que supporte le liquide. A la pression atmosphérique, l’eau bout à 1000, Quand la pression augmente, la température d’ébullition s'élève ‘ elle est de 1120,2 à 1,5 atmosphère ; de 1219,4 à 2 atmosphères; de 1350,1 à 3 atmosphères. On peut élever la pression en faisant bouillir l’eau dans des vases clos, basés sur le principe de la marmite de Papin.

La stérilisation sous pression est la plus couramment employée en bactériologie; elle est sûre, rapide et d'application facile.

Elle est spécialement indiquée :

Pour les milieux de culture (exception faite pour ceux qui ne

supportent pas les températures élevées : sérum, gélatine); — pour les seringues destinées aux prélèvements ou aux injections ; —pour les récipients susceptibles d’être bouchés au coton; — pour les

objets en caoutchouc; — pour les cultures des microbes pathogènes, dont on veut se débarrasser, et qu'il serait dangereux d’abandonner sans stérilisation préalable.

On emploie presque toujours l’autoclave Chamberland.

Autoclave Chamberland. — Il se compose (fig. 29) :

D une chaudière cylindrique À, en cuivre rouge brasé, portant à

sa partie supérieure un rebord aplati; — d'un couvercle, fermant la’ chaudière, reposant sur elle par un rebord plat; entre les rebords de la chaudière et du couvercle s’interpose un anneau de caoutchouc, destiné à assurer une fermeture hermétique. Des boulons mobiles permettent d'assujettir l'un à l’autre les deux rebords. Ce couvercle :

RTE : porte en outre : un manomètre, = à indiquant la pression et la H cl | à température dans l'appareil ;

ie 4 L un robinet d'échappement d'air CT et de vapeur ; une soupape de

sûreté ; — d’un panier en toile métallique, P, reposant par des pieds sur le fond de la chaudière ; — d’un manchon cylindrique en tôle, F, enveloppant la chaudière ; d’une ou deux couronnes de bec de gaz, placées sous la chaudière, dans l'enveloppe.

Certains appareils portent en outre une charnière ou un levier, m permettant de soulever le couverdes) cle sans l’enlever; d’autres pos- ” sèdent un régulateur automatique de température.

Le gaz peut être remplacé par de fortes lampes à alcool ou à pétrole.

Préparation des objets à stériliser.— Boucher comme pour la stérilisation à sec. [Ilestbon de couvrir au préalable les bouchons d’un cornet de papier ou d'une compresse épaisse; sans quoi la vapeur d’eau se condense sur euxet les mouille.

Fig. 29. — Autoclave Chamberland. Dans les récipients stérilisés vides,

on laissera toujours un peu d’eau.

Les objets non bouchés à la ouate

seront enveloppés de plusieurs doubles de papier ordinaire. — Disposer ensuite les objets dansle panier, ouverture en haut. Eviter de mettre leurs orifices au contact des parois latérales du panier,où l’eau va se condenser.

FONCTIONNEMENT. — 10 Verser dans la chaudière de l'eau en quantité suffisante. Mettre en place le panier chargé. Le niveau de l’eau doit arriver un peu au-dessous du fond du

panier. Si l’eau encrasse (eaux calcaires), employer l’eau distillée.

2° Poser la rondelle de caoutchouc ; placer ensuite le couvercle. Serrer modérément les écrous deux à deux (les deux placés aux extrémités d'un même diamètre) à la main.

Le serrage à la clef est trop brutal ; il met rapidement hors d'usage la rondelle de caoutchouc ; il peut toujours être supprimé quand l’autoclave est confié à une seule personne. — La plupart des appareils portent deux marques (généralement O) placées l’une sur le rebord de la chaudière, l’autre sur le couvercle ; ces marques seront placées vis-à-vis l’une de l’autre. — Dans l'intervalle des stérilisations, enlever la rondelle de caoutchouc et la suspendre au mur ou à un écrou, pour éviter l’aplatissement.

30 Ouvrir le robinet d'échappement. Allumer le gaz, chauffer doucement. Pour les autoclaves petits ou moyens, il suffit d'allumer une seule couronne.

4° Surveiller le robinet. Au bout de quelques minutes, la vapeur s'échappe, d'aborden jet faible et discontinu; plus tard, en jetcontinu et en sifflant. Quand le jet estneftement continu, fermer le robinet.

Pendant cette première partie du chauffage, l’air contenu dans la chaudière et dans les objets à stériliser se dilate peu à peu et s'échappe par le robinet. Il faut attendre, avant de commencer la stérilisation, que l'air soit évacué ; sans quoi l'opération s’effectuerait dans un mélange d'air et de vapeur, et les indications du manomètre seraient fausses, trop élevées, la pression de l'air venant s’adjoindre à celle de la vapeur d’eau ; la stérilisation serait inopérante. — En réalité, il reste toujours un peu d'air, mais la pratique montre que la présence de cet air résiduel n'empêche pas la stérilisation d’être efficace, si l'opération a été conduite comme il vient d’être indiqué.

Surtout ne pas faire de décompressions, en ouvrant brusquement le robinet du couvercle pendant la stérilisation, comme on le fait avec les étuves à désinfection ; la décompression amènerait une ébullition tumultueuse des liquides et chasserait ou au moins inonderait les bouchons,

5° Surveiller maintenantle manomètre. L’aiguille se déplace peu à peu vers la droite. Quandelle est arrivée au degré voulu (1150 d’habitude), baisser la flamme en fermant plus ou moins lerobinet; réglerla flamme partâtonnement, de manière à maintenir latempérature à 115°.

Pour régler le gaz, voyez page 98. — Si, au début, on avait allumé deux couronnes, une seule serait maintenue allumée pour le réglage. — La flamme aura en moyenne 10 à 15 millimètres de hauteur une fois l'appareil réglé. — Éviter les courants d’air, qui éteignent facilement le brüleur.

6° Maintenir la température au degré indiqué pendant le temps nécessaire : généralement vingt minutes. Eteindre le gaz.

Ce temps est très variable. Il dépend de la nature des milieux, de leur paisseur,des récipients, etc. Les conditions indiquées (vingt minutes à 1150)

sont valables pour la plupart des milieux ordinaires en tubes : bouillon, gélose, etc., de même que pour les objets. Les milieux qui demeurent solides à température élevée, comme la pomme de terre, demandent un temps plus long ou une température plus haute (1200). Il en sera de même d’un ballon de gélose solidifiée avant stérilisation, car il faut compter le temps nécessaire à la liquéfaction. En réalité, la stérilisation commence seulement quand toute la masse a été portée à la température voulue.

1° Laisser refroidir jusqu’à ce que l’aiguillesoit au zéro. A ce moment, ouvrir Le robinet du couvercle pour laisser échapper la vapeur; puis dévisser les boulons; enlever le couvercle; retirer lesobjets, les poser sur un Corps mauvais conducteur de la chaleur (bois, linge, papier) pour éviter de les refroidir brusquement et de les casser. Si un peu d’eau s’est condensée sur les bouchons ou enveloppes, porter quelques heures à l’étuve pour sécher.

Ne jamais ouvrir avant la chute complète de l'aiguille, pour éviter la décompression et ses inconvénients (voy. plus haut, 40). — Ouvrir le robinet avant de dévisser les boulons, sans quoi la vapeur filtre sous le couvercle et peut brüler l'opérateur.

Contrôle de la stérilisation. — La stérilisation étant le plus souvent confiée aux aides, il est bon de pouvoir la contrôler. On peut placer avec les objets à stériliser des substances fusibles à températures connues : soufre, antipyrine à 1140; résorcine à 1190. Ou bien on emploiera le mélange suivant, dans lequel la coloration apparaît seulement si la fusion a eu lieu (Demandre) :

Benzonaphtol.... ..... ... 100 grammes.

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Mais tous ces procédés indiquent seulement si la température voulue a été atteinte, sans préciser pendant combien de temps on l’a maintenue. Mieux vaut ajouter à chaque fournée de stérilisation un ou deux tubes de bouillon, artificiellement souillés d'une trace de terre ou de poussière (tubes témoins) ; on porte vingt-quatre heures à l’étuve à 370 après la stérilisation. Si cette dernière est imparfaite, les tubes donnent lieu au développement de germes, le plus souvent B. subtilis ou B. mesentericus.

Autres appareils. — A défaut d'autoclaves de bactériologie, on peut utiliser les autoclaves de chirurgie, en ayant soin toutefois de ne jamais opérer de décompression.

Pour des objets très volumineux ou pour des chargements exceptionnellement importants, on utilisera avec avantage les grandes étuves à désinfection (systèmes Genesteet Herscher, Vaillard et Besson).

B. Stérilisation par chauffage dans la vapeur d'eau à 1000. — Elle est peu utilisée en France, où on la réserve généralement pour la gélatine, qui supporte mal les températures plus élevées. Pourobtenirunestérilisation absolue,le chauffage à 100°doit être prolongé pendant longtemps, ou bien, —ce qui vaut mieux, — on le

répète trois jours de suite {Voy. plus loin, Chauffage discontinu).

Stérilisateur à vapeur d’eau à 100. — Il est très employé en Allemagne pourla stérilisation des milieux d'usage courant, en place de l’autoclave, mais sans avantage connu sur ce dernier. 11 com prend (fig. 30) : un bouilleur en cuivre D, pouvant contenir 2 à 3 litres d’eau, avec tube à niveau d’eau sur le côté.

Surmontant le bouilleur, deux cylindres concentriques, l'extérieur B ouvert en bas, l’intérieur À ouvert en haut. En dedans de À, un panier métallique P, destiné à contenir les objets à stériliser.

Un foyer de chaleur au-dessous du bouilleur.

Pour faire fonctionner l'appareil :

Verser de l’eau dans le bouilleur; placer le panier, le cylindre, puis le thermomètre. Allumer. La vapeur passe en P, se condense de sur la paroi B, et l’eau condensée tombe en CD. Quand le thermomètre atteint 100°, prolonger l'opération pendant le temps voulu, deux à trois heures pour la stérilisation en une seule séance.

Les bouchons d’ouate sont très mouillés; il faut sécher à l’étuve.

C. Stérilisation par chauffage discontinu dans la vapeur d'eau à 1000. — Indiquée surtout pour stérilisation de la gélatine.

Fig. 30. — Stérilisateur à vapeur à 1000.;

Principe. — Le principe est dû à Tyndall : des bactéries qui résistent à une séance de chauffage faite dans des conditions délerminées, peuvent

étre délruiles quand on répète à intervalles espacés el à plusieurs reprises la même opération.

Une infusion de foin, qui renferme toujours, on le sait, les spores très résistantes du B. subtilis, n’est pas stérilisée par un chauffage à 1000; mais on assure la stérilisation en répétant trois fois le même chauffage, à un jour d'intervalle. — Tyndall supposait que le premier chauffage détruit les bactéries,en respectant les spores; celles-ci germent ensuite, et un nouveau chauffage à 1000 assure la destruction des bactéries nouvellement formées; . une nouvelle incubation complète la germination et un troisième chauffage complète la stérilisation. Après Duclaux, on admet plutôt aujourd'hui que l'action prolongée de la chaleur modifie les spores, en les hydratant, et les rend moins résistantes.

La température de 100° est celle de la vapeur d’eau, quand l’ébullition se fait à l’air libre.

Dans tous les cas, la stérilisation comporte au moins trois séances, de trente minutes chacune en moyenne, séparées par un intervalle de vingt-quatre heures.

Application.— La stérilisation discontinue à 100° estassurée par :

L'autoclave Chamberland fonctionnant sans pression;

Le stérilisateur à vapeur à 100° (Voy. plus haut);

Ou simplement un appareil improvisé, comportant une bassine d'eau, surmontée d’un cylindre disposé pour recevoir les objets, et chauffée par une forte flamme.

Fonctionnement de l’autoclave comme appareil à vapeur Sans pression (à 400°). — Nous connaissons déjà l’autoclave.

On effectuera les temps 1° à 4° ci-dessus (p.100); mais à la fin du temps 4e, on laissera le robinet ouvert; l'aiguille du manomètre restera au zéro, la vapeur sera à 100°. Baisser ensuite le gaz de manière à obtenir un dégagement de vapeur continu, mais léger. Maintenir le temps voulu, au plus trente à quarante minutes; au bout de ce temps, il ne reste plus guère d’eau dans la chaudière. Éteindre, ouvrir l'appareil, traiter les objets comme ci-dessus.

D. Stérilisation par chauffage discontinu vers 56° — Elle est indiquée spécialement pour le sérum sanguin, quand il n’a pu être recueilli aseptiquement.

Le sérum se coagule (ou se solidifie) vers 65°-68°. II faut le stériliser à une température nettement inférieure, 56° à 57e,

Principe de la méthode. — Voyez ci-dessus C.

Préparation du liquide à stériliser. — Le liquide devant être plongé dans l’eau sera placé en récipients scellés. On emploie généralement des ballons à long col, scellés après remplissage.

L'appareil ordinairement utilisé est le bain-marie à régulateur automatique de d’Arsonval.

Bain-marie à stérilisation de sérum. — L'appareil (fig. 31) se compose d’une chaudière en cuivre, À, communiquant latéralement avec un cylindre plus petit, C, muni d’un régulateur métallique de ROUSMERE D. 145) :

dans le réservoir, un panier métallique, D, fermé en haut par un disque grillagé, E, mobile sur un axe médian. Couvercle avec thermomètre ;

brûleur à gaz et con-

duite de gaz.

Pour le fonctionnement’: remplir

d'eau aux trois quarts le réservoir; placer les ballons (<cellés à la lampe) remplis de sérum, les tenir immergés à l’aide du disque. Placer le couvercle, allumer le gaz; surveillerle thermomèlre. Quand la tempéralure atteint 58°, régler le régula- Fig, 31, — Bain-marie à stérilisation de sérum. teur pour cette température (Voy. p. 145) le maniement du régulateur) ; maintenir perndant une heure.

Laisser les ballons dans le bain-marie; recommencer la même opération le lendemain, et ainsi de suite pendant sept jours.

L'appareil est réglé une fois pour toutes à la température voulue. Il suffit de surveiller de temps à autre son fonctionnement.

Nous avons supposé qu'on stérilisait le sérum en ballons. On peut également le stériliser en tubes; dans ce cas, verser l’eau de manière que son niveau supérieur demeure assez loin des bouchons des tubes. l’rotéger les bouchons par plusieurs doubles de papier.

Ce procédé n’est guère valable que pour le sérum, peu favorable à la culture des saprophytes. Ilserait insuffisant dans la plupart des autres cas.

E. Ébullition. — L’ébullition dans l’eau ordinaire assure mal une stérilisation absolue." En effet, d’après Miquel et Lafraye, il faudrait

cinq heures d'ébullition pour tuer toutes les spores du B. subtilis, saprophyte extrêmement répandu.

Néanmoins l’ébullition est suffisante pour désinfecter ; trente minutes d’ébullition suffisent à détruire presque tous les microbes pathogènes. Seules persistent quelques spores, très résistantes. Aussi l’ébullition est-elle utilisable dans quelques cas :

Pour tuer des cultures de microbes pathogènes non sporulés, qu'il seraitimprudent d'abandonner au hasard dans un laboratoire ; pour désinfecter les instruments qui doivent servir à une opération aseptique de laboratoire.

Une pratique simple consiste à disposer chaque matin un vase métallique assez large, renfermant de l’eau, pour y jeter au cours des manipulations les objets souillés hors d'usage (pipettes après prélèvements, tubes ou ballons de culture) de même que les instruments ayant servi à des prélèvements de produits pathologiques; on fait bouillir quelques minutes le soir, ou plus souvent si besoin.

On peut élever la température d’ébullition en ajoutant à l'eau certaines substances ; en solution saturée, le carbonate de soude élève le point d'ébullition à 1040,6,1e carbonate de potasse à 1350. Pasteur se servait d’un bain-marie à chlorure de calcium (1040).

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