I. — PROCÉDES DE CULTURE HABITUELS
Le principe général est de cultiver en présence de l'air, On varie la forme des récipients et, éventuellement, la disposition des milieux suivant le but qu’on se propose.
Récipients de cultures. — Les récipients peuvent affecter les formes les plus diverses ; toutefois la pratique a montré les avantages de certains modèles ; il nous suffira de signaler rapidement ceux qui sont d'usage courant.
Pour milieux liquides. — Le récipient le plus employé est le simple tube à essais. Diamètre habituel : 15 centimètres X 15 millimètres. [1 faut en outre des tubes petits (0®,12 X 0,011) et grands (0m,20 x 0m,020).
On y répartira les milieux sur une hauteur de 3 travers de doigt environ (lLubes moyens).
Quand on veut pratiquer les cultures en plus grande quantité,
Fig. 66. — Matras Fig. 67. — Fiole Fig. 68. — Fiole de Gayon. Pasteur. d’Erlenmeyer.
ou bien donner au milieu plus de surface (plus d’aération), on emploie des ballons ou fioles ; les plus utilisés sont : Le matras Pasteur (fig. 66), bouché à l’émeri, excellent mais fragile
La fiole d'Erlenmeyer (fig. 67);
La fiole de Gayon (fig. 68);
La fiole de Vivien (fig. 69);
Les ballons ordinaires, à fond plat (fig. 70) ou à fond rond. Les
ballons à fond rond nécessitent des supports spéciaux (valets). Dans certains cas, les cul-
tures demandent une aération.
très large : les dispositifs seront .
indiqués à propos de la préparation de la toxine diphtérique.
Pour milieux solides. — Ici encore, on emploie le plus souvent le simple tube à essai. La gélatine ou la gélose y seront ré-
Fig. 69, — Fiole Fig. 70. — Ballon parties soit en couche profonde,
LACS SE à fond plat. ÿubes droits, pour ensemence-
ments en piqûres ; soit en large
surface, tubes inclinés, pour ensemencements en stries, RARE cultures en masse (Voy. p. 126).
En vue d'appliquer les méthodes d'isolement (Voy. ci-dessous), ou d'obtenir une culture très abondante, il est souvent nécessaire d’ensemencer en large surface. On utilisera alors :
cn fioles de Gayon, d'Erlenmeyer ou de Vivien, citées plus haut;
1, de préférence :
RE fioles plates de Roux (fig. 71) ou analogues, pour cultures massives ;
Les boîtes de Petri (fig. 72), pour les isolements. Les hotte de Petri se prêtent mal aux cultures prolongées, parce qu’elles se
Fig. 71. — Fiole plate de Roux. Fig. 72. — Boîte de Petri.
contaminent facilement; par contre, elles permettent aisément l'observation etle prélèvement des colonies, opérations essentielles dans les isolements.
Les cultures sur pommes de terre demandent des tubes spéciaux (fig. #5).
Ensemencer, c’est porter un germe dans un milieu nutritif.
L'ensemencement est une opération tellement courante qu’on ne peut même énumérer en détail ses indications ; citons le repiquage des microbes (ou leur transplantation d'une culture ancienne sur un milieu neuf); la recherche de microbes pathogènes dans les produits pathologiques ; etc.
Suivant les circonstances, les modes d'ensemencement peuvent varier. Maisilest desrègles fondamentalesqu'ilfaut toujoursobserver :
L'ensemencement sera pratiqué sur des milieux stériles, avec des instruments stériles.
Il ne modifiera en rien la semence (ne pas la contaminer ; ne pas la stériliser).
Il sera pratiqué purement, c'est-à-dire qu’on n'’introduira dans le milieu neuf rien d'autre que la semence elle-même.
Ne jamais oublier de stériliser le porte-semence (fil de platine, pipette), sitôt après usage. |
Le débutant doit s'exercer à ensemencer automatiquement, suivant les règles voulues.
On se mettra à l'abri de tout courant d'air (portes et fenêtres fermées ; pas de mouvements brusques).
Les ensemencements sont généralement faits au fil de platine ou à la pipette, plus rarement à l’aide d’une spatule d’étalement.
On se servira du fil toutes Les fois qu'il sera possible; il est plus maniable et plus facile à stériliser.
Préparation des fils de platine. — 1] existe des fils de platine d'épaisseurs variées; il faut posséder trois épaisseurs différentes : fil fin, moyen, gros, mesurant environ 3/10, 7/10 et 1 millimètre.
On peut donner aux fils bien des dispositions ; les suivantes (fig. 73) répondent à la plupart des besoins : fil droit, mince, et Fig. 73. — Fils de platine fil droit, moyen ; fil en anse (üse des Alle- droit, en anse, en spatule. mands), mince, et fil en anse, moyen; fil écrasé en spatule, gros. On dispose en anse à l’aide d'une pince; en spatule, en écrasant avec un marteau.
Le fil, bon conducteur de la chaleur, et d’ailleurs toujours trop mince pour être rigide, doit être monté,
Montage des fils. — A. On peut monter soi-même, sur verre.
a. Prendre du verre plein, ou verre en baguettes, de 4 à 6 millimètres d'épaisseur, couper (couteau à verre) des segments de 20 à 95 centimètres de long. — Pour couper le verre : à l’aide du couteau, entailler d’un trait franc, bien transversal; placer un doigt de.
chaque côté du trait, briser la baguette.
Couper d'autre part des fils de platine de longueur voulue (en moyenne 6 à 8 centimètres).
b. De la main gauche, porter dans la flamme chauffante (bleue) du chalumeau (Voy. ci-dessous) l'extrémité d’une baguette sur À à2centimètres; tourner constamment ; chauffer jusqu’à ramollissement.
En même temps, de la main droite, prendre avec une pince le fil de platine, porter une extrémité dans la flamme et chauffer au rouge blanc.
c. Toujours dans la flamme, enfoncer le fil dans le verre, ramolli, suivant l'axe du verre, sur
Fig. 74. — Chalumeau à gaz. 1 centimètre environ. Continuer à chauffer doucement (flamme blanche), pour laisser refroidir progressivement.
Enlever ensuite ; donner au fil la forme voulue.
Chalumeau à gaz. — On emploie générale-
ment les chalumeaux à gaz et à air sous pression (fig. 74); l’air comprimé par la soufflerie (à pédale) s'échappe par le tube O, qu’on rac-
corde au tube H; en C, amenée de gaz. On rend la flamme à volonté chauffante (bleue) ou non (blanche), en propulsant plus ou moins d'air par O. D'autre part, on varie également à vo- S lonté la hauteur {et la largeur) de la flamme, en NS ouvrant plus ou moins le robinet d'’amenée du gaz. On peut substituer au chalumeau à gaz la lampe de soudeur. Fig. 75. — Spatule et ba- B. On trouve dans le commerce des fils de guelte d'étalement. platine montés sur manches métalliques.
Préparation des spatules ou baguettes d’étalement. — a. Spatules (fig. 75). — Couper des segments de fil de fer, épaisseur 3 milli-
mètres, longueur 18 centimètres; disposer comme l'indique la figure: Stériliser.
b. Baguettes (fig. 75). — Porter dans la flamme du chalumeau un tube de verre plein, de 4 millimètres d'épaisseur et 20 centimètres de longueur; couder comme l'indique la figure 75. Stériliser.
Préparation des pipettes Pasteur (fig. 76). — On se sert du verre en tubes du commerce; diamètres courants, 4 à 10 millimètres. Avoir soin d'exiger un verre suffisamment épais.
a. Couper un tube (longueur, 1 mètre) en quatre segments. Roder les extrémités à une forte flamme, laisser refroidir. Boucher au coton les deux extrémités; les bouchons ne doivent pas déborder.
b. Porter au four Pasteur, stériliser.
c. Après refroidissement, étirer au chalumeau : saisir la pipette aux deux extrémités, la présenter à la flamme obliquement, de manière à chauffer une assez grande surface, au milieu du tube; tourner constamment entre les doigts; chauffer jusqu’à ramollissement.
d. Rapidement : appuyer les coudes, écartés, sur la table : éloigner le tube de la flamme; l’étirer, horizontalement, à la longueur dési-
Fig. 76. — Préparation des pipettes Pasteur.
rable : en moyenne, la partie effilée mesurera 30 à 40 centimètres. Maintenir en position jusqu’à refroidissement. e. Baisser la flamme du chalumeau; fondre dans la pointe de la flamme le milieu de l’effilure; séparer les deux pipettes.
Remarques. — 1° La technique précédente donne des pipettes d’effilure moyenne. On peut avoir besoin d’effilures plus petites (augmentation de la capillarité) ou plus grosses (aspiration de liquides visqueux ou grumeleux). Il suffit de modifier le temps c.
Pour obtenir des effilures petites : diminuer la surface de chauffe, en présentant le tube presque normalement à la flamme.
Pour obtenir des effilures plus grosses : augmenter la largeur des segments de verre (35 à 40 centimètres); au temps c, présenter le tube très obliquement.
20 On se sert également de pipetles à étranglement (fig. 77). La pipette est d'abord préparée comme ci-dessus; après refroidissement, porter dans la flamme, sur environ 1 centimètre, la partie sous-jacente au bouchon; ramollir incomplètement, étirer doucement à longueur voulue.
39 Il est économique de fabriquer soi-même les pipettes à boules (fig. 78). Prendre une pipette
Pasteur, effilure scel-
CRT + lée ; présenter” à la flamme chauffante du chalumeau la partie large du tube, en tour-
nant constamment et régulièrement entre les doigts, jusqu'à ramollissement complet; enlever alors la pipette, souffler progressivement par l'ouverture libre.
Fig. 77. — Pipette à étranglement.
Ensemencement au fil de platine. — 1° Ensemencement de tube liquide à tube liquide (fig. 79). — Fil de platine petit, en anse.
a. Prendre dans la main gauche, entre le pouce et l'index, Le tube ensemencé ; maintenir le tube en position très inclinée (pour éviter la chute des poussières).
S'assurer que le bouchon est bien libre; le tirer légèrement. Fig. 78. — Pipette à boule.
De Ia main droite, saisir le manche du fil de platine à anse, vers son extrémité libre; le maintenir comme une plume à écrire. Stériliser dans la flammelle fil de platine et la partie du manche voisine du fil.
Fig. 79, — Ensemencement d'un tube de bouillon (vue de face).
b. Le fil refroidi, déboucher le tube en prenant et maintenant le bouchon entre l’annulaire fléchi et la paume de Ia main. c. Flamber rapidement l'orifice du tube-semence. Plonger l’anse
de platine dans la culture, en veillant à ce que le manche ne touche pas le liquide. Retirer le fil, sans toucher aux bords du tube.
Flamber l’orifice, reboucher, poser le tube.
d. Prendre le tube neuf dans la main gauche, maintenir incliné, déboucher (comme en à).
e. Ensemencer (même opération qu’en b).
f. Avant d'abandonner le fil de platine, le stériliser.
g. Flamber et assujettir les deux bouchons. Mettre une étiquette désignation, date, etc.). Porter à l’étuve.
Si les tubes doivent être conservés longtemps, placer un capuchon.
Au lieu d’étiquette, on peut porter les indications sur le tube même, au crayon gras ou à l'encre de vitrier.
2° Variantes suivant le milieu à ensemencer. — A. Ensemencement sur milieux solides, en strie. — Fil de platine petit, droit.
Temps a à d, comme ci-dessus. Ne pas trop incliner le tube neuf, pour éviter que l’eau de condensation ne dissémine les germes à la surface.
e. Plonger l'extrémité du fil de platine jusque près du fond du tube. La ramener vers l’orifice, en ligne droite ou sinueuse en frottant légèrement la surface, sans enfoncer.
f et g. Comme ci-dessus.
Pour ensemencer sur pomme de terre, il faut prendre un fil moyen-ou gros. Certains microbes (tuberculose) doivent être inoculés en plein tubercule et non simplement déposés à la surface.
Pour la gélatine, tenir le tube entre le pouce etl’index, au-dessus de la gélatine, non au niveau de cette dernière (pour éviter la fusion).
B. Ensemencement sur milieux solides, en surface. — Fil de platine petit, en anse.
Comme en A, sauf au temps e :
e. Promener le fil sur toute la surface du milieu (barbouiller).
