DÉCOUVERTE DES PRODUITS SOLUBLES

parisienne de la soustraction a duré jusqu'en janvier 4887, époque à laquelle Pasreur, dans une lettre à DucLaux, se rangea à l'opinion dé CHauveau, ne pouvant expliquer autrement ses propres découvertes sur le traitement antirabique.

Cette même année 1887 vit surgir les preuves définitives du

rôle des produits solubles eu pathologie infectieuse. Les expériences de WoLrince, de Sazuox el Sur pouvaient être criliquées, Il n'en était pas de même de celles de CHarnix, qui annoneait, en mars 4887, la production de symplômes déterminés par injection des Loxines sûrement aseptiques (cultures flirées) du B. pyocyanique et, en octobre 1887, la possibilité d'augmenter la résistance du lapin, vis-à-vis du B. pyocyanique, par injection préalable de ces mêmes substances solubles extraites des cultures. Deux mois plus tard (décembre 1887), Roux et CuawwenLaxp vaccinaient contre le Vibrion seplique avec les produits solubles retirés des cultures. L'année suivante (février 1888) Roux démontrait que le B. Chauvæi fabrique aussi des substances immunisantes ; CHANTEMESSE et WibaL faisaient des travaux analogues avec le B. typhique. La vaccination chimique élait mise hors de toute contestation. Celle méme année 1888 vil naître la découverte, par S. AnLoixG, de lanature diastasique de cerlains de ces produits solubles. * On sait le nombre immense de travaux parus depuis cette époque sur le rôle et la nature des produits solubles microbiens, La voie ouverte par Toussaint el CHauvEAU à conduit au chapitre le plus important de la pathologie infectieuse expérimentale, prélude indispensable de l'étude des lésions microbiennes, des symptômes infectieux, de la vaccination, du sérodiagnostic, de la sérothérapie, ete. Le microbe est, avant lou, un fabricant de toxines ; la maladie infectieuse est une intoxication ;-la vaccination, la prédisposition sont des actes chimiques : telles sont les idées dominantes de la science bactériologique actuelle,

22 Produits extra et intra-protoplasmiques. — Insistons

d'abord sur un point capital. Une culture microbienne peut ne pas contenir de Loxines dans sa partie liquide, bien que le

334 PRODUITS SOLUBLES MICRÔBIENS

microbe ait fabriqué des substances très toxiques.

termes, la culture filtrée peut paraître inoffensive, sans qu'on puisse refuser au microbe lu propriété toxigène. C'est que certains microbes sécrètent des toxines qui diffusent hors de leur protoplasma et se répandent dans les liquides nutritifs {véritables toxines solubles, extraproloplasmiques), tandis que d'autres conservent ces toxines dans Jeur protoplasma ; à! n'y x pas de diffusion ; il faut extraire ces forines

miques (poisons des corps des microbes) à l'aide de procédés spéciaux.

La plupart des produits solubles que nous étudierons sont des toxines extraprotoplasmiques (poisons diphtérique, tétanique, etc.). On peut citer, parmi les intraprotoplasmiques : les tuberculines, la malléine, différents vaceins extraits du corps du bacille de la peste (vaccins de Harrkixe, de Teaxt et Banni), etc.

Les microbes morts sont toxiques à des doses qui varient, suivant les espèces, de quelques milligrammes à des grammes. Ils peuvent occasionner un empoisonnement aigu par libération de leurs toxines; ils peuvent engendrer des lésions. C'est ainsi que l'inoculation de Bacilles tuberculeux morts produit des tubercules (non réinoculables), comme l'ont vu Pauoves et HonnexpyL, Srnaus et GAMALErA.

Pour extraire les poisons des corps microbiens, on s'est adressé à la macération, à l'expression. On trouvera ces procédés à propos de chacun des microbes (Deuxième paxrir). On £e conlenité, le plus souvent, d'injecter Ja totalité de la eultüre tüée pur la chaleur : liquides et cadavres microbiens. Parfois on uliliséra les hümieurs riches en gerines, stériliases.

Îlu'y à pas toujours de limité bien tranchée entre lés toxines

es proprement dites ët les poisons des corps tiicroblènis, Telle toxiue diffuse, muis diffüse imparfäitément et léntettient.

8° Propriétés des produits solubles micrôbiens. — Les

solubles microbiens, quelle que soit leur nature intime, tit sé divisur 8h déux grandes classés suisätt qu'ils éngen- Ha Maladie où qu'ils modiflent simplement le lérrain que en tue d'ude Infection ulirrieure.

A.PaostrrésozueLes Tox1QUEs. — La première classe comprend les produits toxiques, les toxines dans la plus large acception de | ce mot. Les toxines engendrent lu fièvre, les hémorragies, les inflammations de toutes sortes, ete, les lésions et symptômes, en un mot, de toutes les maladies infectieuses. Les cultures filtrées des microbes pathogènes produisent chez l'animal des elets identiques à ceux causés par l'inoculation de la culture complète (culture complète signifie l'ensemble des produits solubles et du microbe vivant).

Citons quelques exemples. Cuaru a reproduit tous les symptômes et toutes les lésions de la maladie pyocyanique avec les toxines du B. pyocyaneus. AnLoixe a étudié les effets phlogogènes d'une diastase sécrétée par le Pneumobacillus diquefaciens bovis, les effets gangréneux des produits du Bacillus heminecrobiophilus. Dx Camsruas a fait du pus avec une diastase provenant de Staphylocoque pyogène. Kxuo Fasen a reproduit les contractures tétaniques avec la toxine du B. de Nicolaïer. Roux ét Yensrx ont fait des paralysies avec la toxine diphtérique. J. Counsoxr et Rover ! ont fait, avec la cullure filtrée du Staphylocoque pyogène : des contractures, de l'anesthésie, du Cheyne stokes, des troubles cardiaques, de l'hypothermie, des néphrites, elc. Les mêmes auteurs ont vu que la toxine du V: septique à hé action inhibitrice sur le centre inspirateur étqué celle du Séreptocoque pyogèñe ügit spécialement sur le cut, Cérldities toxines agissent sur les centres vaso-motéurs pour produire soit la vaso-dilitation (éctasines dé BovchAin) | (AnLoixc), soit la vaso-constriction (anectasines) (CHARRIN ëb | Gkër, Anboine, Monar ët Doro), On à même fait des tubércules Avec dés cadätres du B. tubéréiletr (Pavbbès et HohokKitz, | Srnaus et Gamaurta). Il faut nous borner. Ajoutons que la | mortest en général le terme de ces intoxications, si la loxine eslisses aclive et injectée à une dose suffisante.

#4: Côvnsénr et Rover, Etude expérimentale des substances solubles élaborées par le Staphylocoque pyogène, Soc. de Biologie,

93 1892, — Revue de médecine, février 1893. Lecons d'Ar- | isa Tübéréulose et les Septivéiniés. Létôhs 7 ét 9 sûr les Sep.

330 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

1 y a, dans un liquide filtré, non pas une loxine, mais un | mélange de toxines (notion depuis longtemps défendue par Boucuanp), à effets parfois antagonistes (Staphylocoque pyogéne,

| J. Counsoxr et Roper) et qu'il faut alors dissocier.

Les toxines peuvent se subdiviser en deux groupes.

a. Le premier comprend la majorité des produits solubles qui la agissent sur l'organisme comme une substance soluble quel- A conque. Ces toxines à effets immédiats sont des produits volatils pour Cnannix et GuiLLEMONAT (4902).

b. A propos de leurs études sur le poison tétanique, J. Coursroxr et Dovon! ont attiré l'attention sur un second groupe qui mérite d'être classé bien à part, en raison des propriétés partieulitres des toxines qui le composent et dont la doxine tétanique est le type. Ges propriétés sont les suivantes :

4° Période d'incubation constante entre l'injection de toxine et l'apparition des premiers symptômes objectifs; cette période d'incubation peut êlre raccourcie, mais ne peut être supprimée ; il y a un temps minimum nécessaire à l'éclosion des symptômes. On n'obsefve aucun accident morbide, pendant des heures, quelle que soit la dose injectée. Cette période d'ineubation n'existe pas avec les toxiques connus en physiologie;

% Importance relativement faible de la dose injectée. À partir d'une dose-donnée, on peut centupler la quantité de poison injectée, on ne raccourcit plus l'incubation, C'est un corollaire de la nécessité de l'incubation. Par contre, la période maladive peut être raccourcie par l'augmentation des doses; la mort est hâtée ;

4 Importance considérable de la température ambiante. La greuouille n'est sensible à la toxine tétanique que si elle est chauffée ;

#° Existence fréquente, mais non constante, dans le corps des madades de substances ämmédiatement toxiques, produites par l'or=

ganisme, qui réagit contre les toxines à incubalion ; We Absence de lésions anatomiques, nécessaires à la production

DE Counmdvr et Doxox, Société de Biolagie, 4803 à 1808. Archives Physiologie 4806, etc. Le télanos, monographie, Baillière, 4894:

dés symptômes, et qui expliqueraient la période d'incubation.

Ces toxines peuvent être seules (toxine tétanique ; J. Counmoxr et Doyox) ou mélangées à des toxines à elfet immédiat (toæine diphtérique, J. Couamoxr et Dovox, ExniQuez et HazL1oN). Elles ont d'ailleurs leurs analogues dans certains poisons végétaux qui n'agissent aussi qu'après incubalion.

Quelle que soit l'explication théorique que l'on donne de ces propriélés si spéciales de quelques toxines, la classe de J. Couroxr et Dovox doit être conservée, avec la nécessité de l'incubalion comme principal caractère. On & méme tendance actuel lement à les regarder comme les seules toxines spécifiques.

c. Pour l'étude des effets des produits solubles toxiques’ on . mettra en œuvre toutes les ressources de la physiologie et de l'nistologie. On injectera des doses variables à différentes espèces animales, par des voies multiples, on observera l'animal comme un véritable malade (température, urines, alimentation, amaigrissement, symptômes nerveux, etc., etc.). Le moyen le plus précieux d'investigation sera la méthode graphique introduite en bactériologie par Cuauveau et AnLorxG, CHarmix et GLEY, J. Courwonr et Rover. On se servira, autant que possible, de grands animaux. Pour faire une étude suivie des effets d'une loxine jusqu'à la mort de l'animal, ii est indispensable d'opé= rer avec de grands appareils graphiques, comme ceux qui existent dans les Laboratoires de Lyon, depuis leur création par CHauveau (voir page 4). L'expérience peut ainsi avoir une durée indéfinie, pour ainsi dire sans interruption du tracé. D'Ansonvaz et Caammx ont recherché les troubles de la calorification produits par les toxines, Ancoixé et LauLanté ont fait de même en y ajoutant l'étude des combustions organiques. A l'heure actuelle, un Laboratoire bien outillé de physiologie est indispensable au bactériologiste; celui-ci n'a pas fait le quart de sa tâche lorsqu'il a constaté les propriétés botaniques d'un microbe. Les lésions dues aux toxines seront soigneusement coupées et examinées au microscope (p. 287); il faut donc être également histologiste.

Canin et Levaurm (1869) ont attiré l'attention sur l'influence Alu litre isotonique ou anisotonique des solutions minérales sur

2 MRÉCIS DE BACTÉMIOLOGIE, 2e édil. a

È 338 PRÔDUITS SOLUBLES MICROBIENS

4 l'activité des toxines dissoutes dans ces solutions. L'anisotonie favorise l'intoxication; les produits microbiens pénètrent plus rapidement les cellules.

d. A côté des toxines, Enauice a créé le groupe des toxoïdes et dés toxones. Les toxoïdes sont des produits de transformation des toxines, ayant une composition analogue, et qui exislent dansles cultures filtrées alors que les toxines ont disparu ou, tout au moins, se sont considérablement atténuées. Ces toxoïdes peuvent, comme les toxines, servir à l'immunisation; ils peuvent neutraliserles antitoxines. Ils produisent des symptômes différents de ceux de la toxine. Ce sont des loxines mas-

quées dans le mélange par la toxine principale. Les towones ne sont pas le produit d’une transformation des toxines; ce sont des corps créés concurremment par le microbe et pouvant occasionner des troubles sérieux (paral. diphtériques).

Ces expériences ont été faites sur la toxine diphtérique (voy. p. 625).

Il faut ranger parmi les produits solubles toxiques, ceux qui ont la propriété de détruire les globules blancs (leucocidines) ou les globules rouges (hémolysines).

e. Leuvocidines. —Si on inocule du Sraphylocoque pyogène dans Ja plèvre d'un lapin, l'exsudat pleural, d'ailleurs très riche en leucocytes dégénérés, altère les leucocytes normaux qu'on lui ajoute. Un chauffage de 410 minutes à + 58° ou + 60° détruit celte propriété. La leucocidine existerait, à petite dose, dans les cultures (Vax ox Veuve, Krauss, Netssen, Bat).

» L'exsudat péritonéal du cobaye, inoeulé par cette voie, avec du B. pyocyanique, jouit des mêmes propriétés,

f: Hémolysines. — La culture filtrée du 8. tétanique contientde Ja tétanolysine (Mansex), qui disparaît d'ailleurs vite. Les hémalies du cheval et du lapin sont spécialement sensibles.

Nrexiste aussi une pyocyanolysine dans les cultures filtrées du H. pyocyanique (Buivocn et Hoxres). Un chauffage de 15

|minutes à + 100° la délruit. Les globules rouges de beaucoup

maux sont sensibles.

(1904) a signalé une staphylolysine; les cultures fil-

meuf à treize jours dissolvent les hématies du lapin.

PROLRIÉTÉS DES PRODUITS SOLUULES 339

Pour lui, sa production est un caractère constant du staphylocoque typique.

Le Streptocoque de Marmorelk fabrique in vivo sur le lapin une hémolysine très active. Besneoka l'a reproduite in vitro (p. 743),

B. Pnopuirs SOLUBLES VACCINANTS OÙ PhébisposanTs, — Le second groupe des produits solubles microbiens comprend ceux qui, toxiques où non, modifient la réceptivité du terrain animal qu'ils imprègnent, vis-à-vis d'une infection ultérieure.

Les uns sont vaccinants (Toussainr, CHauveau, CHARRIN, elc., elc,), ét ce sont les plus nombreux. On vaccine l'animal contre le tétanos, la diphtérie, le choléra, et contre la plupart des infections en lui injectant des doses progressivement croissantes de cultures tiltrées des microbes de ces maladies,

Mais il existe aussi des produits solubles qui ont un effet inverse, qui sont prédisposants. J'ai découvert cette classe de produits solubles en 1889!. Les cultures liltrées d'un bacille tuberculeux du bœuf que je venais d'isoler (sans rapports avec le bacille tuberculeux de Kocu; voy. p. 517) introduites sous. la peau d’un cobaye ou d'un lapin, à la dose de 4 centimère cube par kilogramme, rendaient pour longtemps ces animaux prédisposés à l'action du bacille dans la proportion de 4 à 16; ceux-ci mouraient 46 lois plus vile que les Lémoins. J'ai relrouvé, avec Roper, ces mêmes produits solubles prédisposants dans les cultures du Staphylocoque pyogène. Bovcuans les a constatés dans les cultures du B. pyocyanique, el Rocer dans celles du B. Chauvæi et du Streptocoque pyogène.

Ces produits prédisposants peuvent être mélangés à des produits vaccinants (J. Courwoxr et Rover, RoGen).

€. Nous résumerons les notions précédentes sur les propriétés des produits solubles dans le tableau suivant ;

LJ,Counuonr, Substances solubles prédisposant à l'action pathogène déleurssnicrobes producteurs, Ac. des sciences, 22 juillet 1889, Soc. de Biologie, 21 déc. 1889, Revue de médecine, oct. 1891, Soc. de Biologie, 21 mars 1891, et Ac. des sciences, octobre 1801.

340 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

| ; { Toxineshetfelsimméd Presque tous les microbes. Toziques .. } Tosinesäincubalion B. télanique, ele. Ü Tosones. Toroïdes.. B. diphlérique.

Leucocidines ; , ...:..... f Slapbylocoque progias, LB. pyocyanique.

mnonures |émelaines À Siaphsh Da { | Streptocoque de Marmorek.

SOLUBLES | Vaccinants. . à: 2: 4 +. à Presque tous les microbes, à action immédiate À D: Ée j mais passagère. ! Siaphylocoque progène.

B. tubereuleux de 1. Cour-

Prédisposants | à action lente ( mont.

| {mais durable. } Slaphylocoque pyogène, \ \ Slroptocoque pyogène.

4 Nature des produits solubles microbiens. — Au moment de la découverte du rôle des produits solubles microbiens en pathologie infectieuse, on savait bien que les microbes pouvaient sécréter des ferments solubles, des diastases digeslives ou autres ; mais on ne croyait pas que les produits solubles toxiques ou vaccinants puissent appartenir à cette classe de substance. On ne pensait qu'aux plomaines.

a. Depuis les recherches de Paxum (1856), de Bercmaxx et Seonmieoesenc (1868), de A. Gaurien (1872), de Sezmt, de Nexckr, etc., on avait l'attention attirée sur les alcaloïdes toxiques qu'on pouvait relirer des substances putréfiées, du pus, elc., et qu'on appelait plomaines!, où que sécrétaient les wellules des organes sains (leucomaines).

Le terme de « ptomaïnes » devrait, d'après HtGouxexQ, être réservé aux bases alcalines qui se produisent pendant la putréfaction cadavérique ; le terme général doit être : toxines alcadoïdiques,

Les toxines alcaloïdiques sont des corps basiques (CHAz ou CHAz0), qui se dissolvent bien dans l'alcool, l'éther et les dis-

Les ptomaïnes sont « les déchets ultimes, provenant de la désalle et par voie d'hydratation, des matières albumiabtaquées par les microbes de la putréfaction », (HuGouneNQ.)

À ONATURE DES PRODUITS SOLUBLES 3h

solvants des substances riches en charbon. Elles se combinent aux acides pour donner des sels solubles, bien eristallisés. Elles s'unissent au chlorure d'or et au chlorure de platine. L'oxygène, la lumière, les acides en excès les altérent. Elles sont précipitées par l'iodure de potassium ioduré, le tanin, l'acide picrique, etc. Elles ont la réaction de Selmi.

Les alcaloïdes oxygènés (CHAz0) cristallisent à l'état de liberté ou à l'état de sels. Ils se dissolvent médiocrement dans l'alcool (exemple : choline).

Les alcaloïdes résistent à dé hautes températures.

Ne parlons que des loxines alcaloïdiques retirées des cultures pures. BrirGen isola des ptomaïnes toxiques des cultures du B. éypique, du Staphylocoque pyogène, du Bacille de Nicolaïer, (4 alcaloïdes basiques), du Vibrion cholérique, Lessa fit du pus avec une ptomaïne relirée des cultures du Staphylocoque pyogène. Brel, on recherchait systématiquement les produits solubles microbiens dans le groupe des alcaloïdes.

b. C'estalors qu'Ancorxc! découvrit la nature diastasique des produits solubles phlogogènes contenus dans les cultures du Preumo-bacillus liquefaciens bovis, et dans la sérosité du poumon de bœuf atteint de péripneumonie. La voie était ouverte; la classe des substances solubles albumosiques, ayant des propriélés pathogènes, des toxulbumines, élait créée. Or, à l'heure actuelle, presque loutes les toxines sont considérées comme des corps albuminoïdes ; les ptomaïnes existent, mais ont une importance bien moindre en pathologie,

A lu suite des travaux d'AnLoixG, on découvre coup sur coup : Ja diastase pyogène du Staphylocoque pyogène (de Canisrmas), les propriétés diastasiques des substances vaccinantes du sang charbonneux (Roux et CuamsenLaxo), des toxines diphtérique (Roux et Yensiwx) el télanique (Kxco Fanen), des produits solubles du Bacillus heminecrobiophilus (AnLorxc), d'une partie des toxines du Stapäylocoque pyogène (1. Couumoxr et Rover), ete. Hucouxexo et Eravn font une étude soignée des toxines de

MAnLomnG, Ac. des sciences, 7 mai et 18 juin 1888,

? ge PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

l'Orchiocoque (1891-1893) et en retirent une substance gène voisine des peptones.

Ce sont donc les toxalbumines qui jouent le rôle » pathologie infectieuse. Ce sont des corps amorphes, solubles. dans l'alcool faible, insolubles dans l'alcool absolu, l'éther, le chloroforme, la benzine, le sulfure de carbone, ete, Fls sont très solubles dans l'eau. La plupart, à l'état de solution dans l'enu, s'altèrent à + 65°. Leur composition est très mal connue. Ils sont quatérnaires avec soufre et phosphore, Beaucoup s@ comportent comme de véritables albumines: beaucoup ont des propriétés zymotiques. Ces différents corps ont, en somme, entre eux des analogies plus apparentes que réelles, et semblent s'éloigner des véritables matières albuminoïdes par leur faible teneur en azote. HuGounexo estime que ces substances sont peut-être des intermédiaires entre les albumines vraies et les alcaloïdes. A. Gaurier vient de soutenir la même idée, Les toxalbumines agissent à des doses infinitésimales.

Les toxalbumines microbiennes ont leurs analogues dans les towines végétales (abrine, ricine) et dans les toxines animales (venins, sérums d'anguille).

€. Ajoutons que Cnannx, GLey, GuiLemoxar, font jouer un rôle important aux produits solubles volatils.

5° Origine des produits solubles microbiens. — On est encore bien peu fixé sur l'origine des toxalbumines microhiennes. Sont-elles sécrétées de toutes pièces par le microbe, ou ne sont-elles que des transformations des substances albuminoïdes existant normalement dans les bouillons de culture ? Pour résoudre la question il faudrait obtenir des toxalbumines en cullivant les microbes dans des milieux ne, conténant pas “de substances protéiques. C'est ce qu'ont fait certains auteurs et Cuanmx, Guocuer, Ovomxsky, etc), cultivant Je le Vibrion cholérique et le Bacille diphtérique des milieux dépourvus de substances albuminoïdes (voya position, page 81), Ouemxsky a reliré de ses liquides

, Les toxines microbiennes el animales, B. Leuuté, 1896,

des toxalbumines ayant les mêmes propriétés que celles qui proviennent des cultures en houillon. Les microbes pourraient donc fabriquer de toutes piñces, par synthèse, des substances albuminoïdes en empruntant l'azote à des corps minéraux. Malheureusement les conclusions d'OcenmsxY n'ont pu être confirmées (Hucouxexo, Dovox); on ne doit pas encore se prononcer. Ilse pourrait, d'ailleurs, que les toxalbumines ne soient pas des corps albuminoïdes, mais adhérent simplement à ces derniers. Brigcen et Baën, dans leur étude des toxines diphtérique et tétanique, concluent que la substance active n'a pas les réactions de l'albumine ou de la peptone et représente « un groupement atomique inconnu en chimie ». Peutêtre même les soi-disant toxalbumines ont-elles des proprié- Lés vitales qui les placent au-dessus des matières amorphes !

Pour préparer et isoler les produits solubles d'une culture, il faut opérer en plusieurs temps.

4° Virulence de la semence. — Il faut d'abord posséder à l'état de pureté un échantillon, aussi virulent que possible, du microbe dont on veut essayer les produits. Certains microbes se conservent longtemps avec leur virulence, d'autres (comme le 2. tuberculeux) ont une virulence assez fixe; il suflira de les employer tels quels. Le plus souvent il faudra renforcer la virulence de Ja semence, et ce premier temps sera quelquefois très laborieux.

On renforce, en général, la virulence d'un microbe, en le fai- Sant passer un grand nombre dé fois par l'organisme d'un animal très récepteur. On arrive ainsi à posséder des cultures d'une activité inouïe; or, les produits solubles en seront loxiques en proportion. C'est Pasreur qui a créé cette méthode, en. renforçant le microbe du rouget du porc par le passage dans l'organisme du pigeon, et celui du charbon en le faisant passer par le jeune cobaye.

On a exallé la virulence du Staphylocoque pyogène en le

Er PRODUITS SOLUNLES MICROUIENS

DL #4 faisant passer par le lapin (Rover) ; on injecte la culture duñs | le sang el, à la mort de l'animal, on puise la semence dans |@ sang du cœur; on injecté un nouveau lapin avec la culture très jeune, ou directement avec le sang, et ainsi de suite ; les lapins meurent de plus en plus vite, et les microbes qui en proviennent sont de plus en plus virulents. C'est par cette méthode (d'abord sur des souris, puis sur des lapins) que Marmorek a pu oblenir un Sfreplocoque tuant le lapin à L qu ou même quelquefois a dé centimètre cube. On renforce le Bacille de la diphtérie en le faisant passer par | le cobaye. Roux, MercuxIKorr et TAURELLI-SALIMBEXI ont exallé la virulence du Vibrion cholérique, au point de posséder des cultures tuant le cobaye à 4/160° de centimètre cube. Pour cela, ils alternent un grand nombre de fois des cultures sur gélose, et des cultures en solution de peptone dans un sac de collodion placé dans le péritoine du cobaye (voy. p. 150).

On n'a pas toujours besoin de faire passer un microbe par l'animal pour lui restituer sa virulence. AnLoixG et Tavonor ont pu renforcer la virulence du Streptocoque en changeant la composition du bouillon. ArLoixG conseille aussi de faire une sélection parmi les individus microbiens d'une culture. On fait végéler dans des conditions légèrement dysgénésiques, on réensemence dès le premier trouble, étainsi de suite pendant plusieurs passages. Ce sont les individus les plus vivaces qui ont résisté.

La semence virulente obtenue, il faut lu conserver à cet état, ce qui est souvent très difficile. Le Vibrion cholérique, le Pneumocoque, perdent très rapidement leur virulence. On cultivera les microbes dans des milieux appropriés. C'est ainsi que Man- Monex conserve la virulence de son Streptocoque eu le eultivant

“duns un mélange de sérum et de bouillon [voir p. 90). I faut surtout réensemencer fréquemment les cultures, le vieillisse- L étant une des causes les plus sûres de l'atténuation, 11 dé renouveler tous les quatre à cing jours des culs de Staphylocoque pyogène en bouillon ordinaire pour leur leur virulence,

qu'un microbe est très alténuë, on peut l'inoculer en:

le. =

l'associant à un autre microbe et obtenir ainsi la mort de l'animal (exemple : l'association du Staphylocoque au Bacille atténué de la morve).

I n’est pas prouvé, qu'il soit nécessaire pour avoir des produits solubles très vaccinants, d'employer une semence aussi virulente. Cette habitude de l'exaltation préalable sera peutêtre à réformer,

2° Culture définitive. — Lorsqu'on possède une semence bien virulente, il faut choisir les conditions dans lesquelles on fera la culture destinée à être expérimentée pour l'extraction des produits solubles.

Le milieu sera de préférence liquide ; il sera approprié au mierobe. On retrouvera, p. 90, et à la DeuxIÈME Parrte les bouillonsles plus convenables pour obtenir les toxines les plus communément employées (Staphylocoque pyogène, Strepto- * coque pyogène, Bacille de Lôffer, B. de Nicolaïer). Le Vibrion cholérique sera cultivé dans sa solution peptonée et gélatinée déjà indiquée (p. 89), avec l'addition d'un peu de sérum. Nous nous sommes servis, avec Roper, d'un bouillon très pauvre en peptone (simple infusion de viande) pour étudier les toxines du Staphylocoque pyagène.

11 sera bon d'avoir des bouillons assez riches en sels minéraux. On évitera, autant que possible, les sucres dont la fermentation engendre des acides.

La culture est faite en général à + 37.

Elle végétera, naturellement, dans le vide pour les microbes anaérobies. Husrre et Scnots croyaient même que le V. chalérique (facultatif) fabriquait plus de toxines dans le vide qu'à Vair; J. Counwowr et Dovox ont vu le contraire. On aura souvent avantage à fairé passer un courant d'air à la surface du bouillon de culture étalé en couche mince, comme cela se pratiquait autrefois pour la préparation de la toxine diphtérique (p. 823).

.! On a quelquefois extrait des produits solubles de cultures solides : par exemple la tuberculine, de cultures sur agar de Bacilles de Koch, mais ce sont alors des produits intraproloplasmiques.

ET PRODUITS SOLUNLES MICROBIENS

L'âge auquel la culture doit être employée, est trà: suivant les microbes. On filtre une culture bien aérée térie en bouillon ordinaire vers le vingt et unième bouillon Martin le cinquième jour, une culture de Staphylocoque pyogène vers le vingtième jour (J. Cocamoxr et Rover), une cul ture de tétanos vers le dix-huitième ou vingtième jour, une culture de Vibrion cholérique vers Je quatrième jour (Roux etses collaborateurs). En prin-

| cipe on essaye, en tâtonnant, MN | |

des cultures filtréesà différents âges, et on adople l'âge qui donne Ja toxine la plus active.

3 Séparation physique des substances solubles. | Stérilisation de la , — La culture est prête à être employée, Il faut séparer lensemble des substances solu= blesdes individus microhiens ; il faut obtenir un liquide débarrassé de tout germe vivant.

Plusieurs moyens out élé em ployés.

a. Décantation. — Ce serañt le procédé de choixs'iln'exposail à avoir une toxine renfer-

Fig 196. mant encore des microbes De pour la sé vivants ; il éviterait l'action

tation, filtration joujours nocive des filtres, de Ta ana Vos la chaleur, etc, Certains mi

crabes, tels que le Streptocoque leB. tubereuleur, ne troublent pas le bouillon, végétant, aier en flocons au fond du ballon, le second en croûtes ce ; on pourrait donc à la rigueur décanter avec soin pide, Pour les microbes qui troublent le bouil-

lon, il fant laisser reposer de vieilles cultures dans de hautes éprouvettes, On voit que tous ces procédés sont défectueux, et surtout n'offrent aucune sécurité pour l'asepsie de la toxine. C'est cependant par décantation suivie d'une filtration sur coton (fig. 496) qu'Ancoxe à pu isoler certaines substances solubles sécrétées par le Bacillus anthracis.

b. Filtration. — C'est le procédé le plus usuel. Nous avons donné tous les détails des procédés de filtration au chapitre 11, page 52 el suivantes ; nous n'avons rien à ajouter. Nous rappelons simplement que les filtres en porcelaine retiennent une très grande quantité de produits solubles et peuvent même modiflér ceux qui passent (AnLoix6, Hocouxexo, J. Counmonr et Rover, Prisazix, p. 52).

Certaines cultures sont tellement épaisses ou glaireuses que le filtre ést vite encrassé ; on fera bien de les filtrer au préalable sur papier. On éprouvera aussi de grandes difficultés à filtrer les bouillons glycérinés. Pour les liquides peu toxiques, on pourra évaporer dans le vide afin de réduire le volume du substratum.

ce. Dialyse. — Ce procédé a été employé par P; Canxor et L. Founxien (1900) pour étudier les produits solubles où Pneumocoque: Le principe consiste à cultiver le mierobe en milieu liquide contenu dans uw vase dont les parois dialysables laissentisortir les toxines et entrer de nouvelles substances nutritives. On peut ainsi maintenir longtemps la végétabililé de la culture et extraire journellement des toxines dont les modifications sont inté- Fig. 497. ressantes à étudier. Dialyseur de Can-

Un” ilacon (A) (Mg: 197) est bouché par nor el FouantEn. un bouchon en caoutchouc percé de deux orifices inégaux. L'un livre passage à un tube de verre (B), percé de trous et tapissé de collodion, absolument comme on Mabrique les sacs de collodion (voyez p. 150). L'autre maintient

348 PRODUITS SOLCULES MICROBIENS -

un petit tube en verre (C). Tous deux sont houchés à la ouate. Le liquide nutritif (D) remplit aux deux tiers le flacon (A) et le tube (B). Le tout est stérilisé à l'autoclave. ; On ensemence l'intérieur du tube (B), on prélève les toxines

et on ajoute les matériaux nutritifs par le tube (C).

Voyez page 354 el fig. 199.

d. Chauffage. — Un autre procédé consiste à slériliser la culture par la chaleur. On ne peut mettre ce procédé en parallèle avec le précédent, Tandis qu'avec la filtration on n'obtient que les substances solubles sécrétées par le microbe de son vivant et ayant diffusé dans le bouillon (et même une partie seulement de ces substances), on a, par le chauffage : lu totulité des produits solubles soit diffusibles (substances extraprotoplasmiques), soit retenus dans le protoplasma pendant la vie du microbe et que ce dernier abandonne en mourant (subslances intraprotoplasmiques), En outre, le chauffage peut modifier profondément les produits solubles, soil directement, soit en faisant sécréter des substances différentes par le microbe pendant sa période d'agonie. Le chauffage doit donc être employé dans certains cas, et la filtration dans d'autres. Certains microbes (B. anthracis, B. tuberculeux) retiennent leurs sécrétions dans leur protoplasma ; la filtration ne livrerait pas la toxine. Il est bon, après le chauffage, de filtrer sur papier pour se débarrasser des cadavres microhiens. La température et la durée du chauffage varieront naturellement suivant les microbes et seront toujours réduites au minimum nécessaire, J. Covawoxr et Rover tuent le Staphylocoque pyogène par un chauffage de vingt-quatre heures à + 55°. J. Counmoxr et Doyox tuent le Vibrion cholérique en l'exposant pendant qua-

- rante-huit heures à + 530. Il faut l'ébullition prolongée pour les microbes à spores, On obtiendra en général un liquide bonucoup plus toxique par le chauffage que par la filtration 0 pyogène): cependant, les cultures chauffées , cholérique ne sout pas plus actives que les cultures fil- |

(Rowx, 4. Covnmoxr et Dovox).

comme exemple la préparation de la fuberculine brute. de Bacille tuberculeux se cultive à la surface du

bouillon glycériné (p. 450). On fait bouillir la culture, au bainmarie, dans une capsule de porcelaine, en agitant fréquemment avec une baguette de verre. Lorsque le liquide est réduit au 1/10° de son volume, on filtre sur papier. L'ébulliion prolongée a tué tous les bacilles. C'est ainsi que la tuberculine est bien, comme l'avait dit Kocu d'une facon assez obscure : un

Fig. 4198.

Bain-marie avec régulateur mélallique de Roux,

extrait glycériné de cultures pures de bacilles de la tuberculose ; muis c'est un extrait des produits solubles intraprotoplasmiques des microbes.

Le chauffage d'une culture peut se faire à l'autoclave lors qu'on a besoin d'une température supérieure à + 100°. Sinon, on exposera simplement la culture dans une étuve réglée à la température voulue, ou on chauffera au bain-marie. Nous recommandons le bain-marie, schématisé figure 198, construit par Wirsseec sur les indications de Nocanp ; il est muni d'un régulateur métallique de Roux (voy. p. 140) qui est contenu dans un manchon métallique traversant l'eau. Ce bain-marie sérvira encore pour les évaporalions, elc,, ete.

e. Trituration mécanique des micrabes. — La tuberculine préparée par le procédé indiqué par Kocn, en 1891, et que nous venons de résumer, n'ayant donné que des résultats

350 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

désastreux, plusieurs auteurs (Barecen et Proskauen, Kuess,

Hunren, Küuxe, Rœwen) ont cherché à la purifier, à en extraire | le principe curateur entrevu par Kocn. En 1897, Kocu ® est revenu sur celle question en apportant les résultats de six.ans de travail. La première tuberculine était un extrait des subslances, solubles dans la glycérine, facilement livrées par le | protoplasma microbien. Elle n'était pas bactéricide, provoquait | des réactions fébriles, etc. Kocu a voulu extraire les substances | retenues par le protoplasma microbien, après les manipulations précédentes, et sa nouvelle tuberculine serait bactéricide, ne provoquerait pas de réactions fébriles, guérirait le cobaye | tuberculeux, etc. (voy. p. 496).

Voici ses procédés d'extraction.

Les acides minéraux dilués, les alcalis concentrés, employés à l'ébullition, détruisent les substances immunisantes el ne doivent pas être utilisés.

La tuberculine A (alcaline) s'obtient en laissant pendant trois Jours les bacilles, à la température de la chambre, au contact d'une solution de sonde caustique à 40 p. 400. On filtre sur papier et on neutralise. Les bacilles sont morts, mais il en reste un certain nombre dans le liquide. Cette tuberculine a les mêmes propriétés que la tuberculine brutes elle a, en plus, l'inconvénient de produire des abcès dus aux cadavres bacillaires ; il ne faut pas l'employer. | Les autres tuberculines sont obtenues en triturant les bacilles pour en extraire mécaniquement les substances intraprotoplasmiques. Cet écrasement des bacilles tuberculeux est très diflicile, impossible si on ne se soumet pas aux règles suivantes. On fait dessécher des cultures dans le vide, et on lestri- Lure, sans rien y ajouter, dans un mortier d'agate, avec un où dé même substance, longuement, jusqu'à ce que le mimontre la destruction des corps bacillaires. Pendant opération, très dangereuse, on vit au milieu de poussières par des bacilles tuberculeux à l'état de pureté, Avec ainsi obtenu, on peut obtenir deux tuberculines,

Wochensehritft, 191 avril 4807.

On émulsionne le résidu dans l'eau distillée, et on centrifuge pendant trente ou quarante-cinq minutes (4 000 tours par minute). Le liquide obtenu est la tuberculine O0, qui contient les substances solubles dans la glycérine, etse rapproche beaucoup de la tuberculine brute ou de la tuberculine A ; elle ne produit

pas d'aboès, mais n'est pas immunisante; elle ne sera pas em-

ployée pourle traitement de la tuberculose.

Lé précipité boueux, qui est resté adhérent aux parois du vase, après la première centrifugation, est repris, séché à nouveau, rétrituré, recentrifugé plusieurs fois de suite. On épuise ainsi presque tout le précipité; la masse entière de la culture des bacilles tuberculeux est successivement transformée en liquides, qui ont lesmèmes propriétés (sauf le premier : tuberculine 0). Ces liquides, mélangés, constituent la tuberculine À (résiduelle) qui constitue, pour Kocs, le liquide curateur de la tuberculose. Elle est bactéricide, ne produit ni abcès ni réaction fébrile à doses faibles, elle immunise le cobaye et le guérit s'il est déjà tuberculeux. Elle contient les substances insolubles dans la glycérine ; elle n'a donc aucun rapport de nature avec les autres tubereulines (voy. p.496),

Pour que la tuberculiue R produise lous ses effets, il faut + 4° posséder une culture très virulente (il y a de grandes diférences dans la virulence des cultures même récentes) ; 2% une culture très jeune ; 4 une culture ayant végété à l'abri de la lumière ; 4° dessécher dans le vide ; 5° employer de suite la poussière obtenue; 6 triturer longuement dans un mortier d'agate; 7 centrifuger avec un appareil puissant.

f. Antiseptiques. — On a essayé de tuer les microbesau moyen d'antiseptiques, mais la présence de ceux-ci dans la toxine est une mauvaise condition d'expérimentation. On a aussi tué les microbes par l'action prolongée du chloroforme.

g. Prévipitation. — Les toxines adhèrent à certains précipités. On peut ainsi les extraire du liquide ambiant.

On ajoute, par exemple, au liquide toxique quelques gouttes d'une solution concentrée de phosphate de soude, puis quels ques gouttes d'une solution de chlorure de culcium; le préeis pité de phosphate de chaux est rassemblé par centrifugation.

352 PRODUITS SOLUULES MICROBIENS

Ce sont surtout les substances diastasiques

aux précipités. Gette adhérence est tellement forte que pl lavages successifs ne suffisent pas, le plus souvent, à priver le | précipité des propriétés toxiques acquises.

4° Isolement chimique des substances solubles. — On | emploie, en général, les produits solubles à l'état de dilution et de mélange dans le bouillon de culture, simplement privé de germes vivants, comme il vient d'être dit. | Pour l'étude chimique de ces produits, il faut aller au delàt

A. EXTRACTION DES TOXINES ALCALOÏDIQUES (dont les ptomaïnes | font partie — plomaïne n'est pas synonyme d'alcaloïde).

a. Extraction par l'alcool. — Nous avons l'habitude de séparer les alcaloïdes par la précipitation des substances albuminoïdes au moyen de l'alcool.

Voici la marche suivie par Hucouxexo et Enaun (1894) dans leur étude des toxines de l'Orchiocoque. Le liquide filtré est légèrement acidulé à l'acide lartrique et addilionné immédiatement de 45 à 20 volumes, au moins, d'alcool à 95*. On laisse vingt-quatre heures à l'obscurité. On filtre ; les substances albumosiques ont précipité et restent sur le filtre. On distille sous pression réduite à + 45°. Tout l'alcool étant évaporé, on aci= dule franchement par l'acide turtrique, el on laisse digérer quelques heures à + 45°. On filtre et on lave le résidu à l'alcool fort. On évapore au bain-marie, à +- 45°, jusqu'à consistance sirupeuse. Le sirop est mélangé à 8 ou 10 fois son volume d'alcool absolu, pour précipiter les sels minéraux. On laisse vingt= quatre heures, on filtre et on chasse l'alcool en disposant ln capsule sur l'eau tiède.

Le résidu acide est épuisé à deux ou trois reprises par de Véther et du pétrole bouillant vers + 40° qu'on décante à tra

13 à ce sujet le remarquable article de Hovorxexg, in

de pathologie générale de Boucuann, t. 11, p. 243, ch, x, de dion de Caanmx. Nous lui empruntons beaucoup, Conï le chapitre svu du Précis de Chimie physiologique, de Doin, 1897, Mème bibliothèque.

vers un filtre déjà imprégné de dissolvant. L'éther est abandonné à l'évaporation spontanée.

Le résidu, toujours acide, est repris d'abord par la benzine, puis par le chloroforme.

On alealinise alors le résidu par un léger excès d'ammoniaque, et on l'épuise par l’éther de pétrole, la benzine, le chlorofarme, l'alcool amylique.

On évapore la liqueur mère et on traite le sirop par l'alcool fort ; on filtre, et on dissout le résidu dans l'eau. On peut encore extraire de nouvelles substances.

On purifle par redissolution et cristallisation.

En général, on se sert d'une méthode moins longue et moins coûteuse pour savoir si les alcaloïdes d'une culture ont des propriélés Loxiques. On précipite par 5 ou 6 volumes d'alcool à 959, maintenus vingt-quatre heures en présence, on filtre pour retenir le précipité, on évapore ce qui à passé, et on reprend le résidu par l'eau. C'est ce liquide qui est injecté, C'est ainsi que nous avons opéré, avec Roner, pour les alcaloïdes du Staphylocoque pyogène.

b. Extraction par l'éther. — On alcalinise par la potasse, et on épuise par l'éther. On décante et on évapore, L'alcaloïde est purifié en le transformant en sel qu'on fait cristalliser plusieurs fois. Le produit, dissout dans l'eau alcaline, cède à l'éther la base libre, pure.

Mais, tous les alcaloïdes ne sont pas solubles dans l'éther,'et la purification est diflicile.

©. Eztraction par le chlorure mercurique. — Le liquide est porté à l'ébullition, filtré et précipité par le chlorure mercurique. On filtre. Le précipité et la liqueur, traités séparément

par l'hydrogène sulfuré, fournissent un précipité de sulfure Deique qu'on sépare par le filtre, et deux liqueurs qu'ori réduit par évaporalion. On lave à l'alcool absolu. L'alcool dé est réuni aux eaux mères qu'on évapore. On, précipilg alors par le chlorure d'or et le chlorure de platine. L'ébullition qui est à la base de ce procédé, dû à Brecen, e# une condition très défectueuse, d. Extraction des alcaloïdes volalils, — Gavrten a donné un

PRÉCIS DE BACTÉMIOLOGIE, 2* édit. #

354 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

procédé pour isoler les alealoïdes volatils. Nous renvoyons au Bulletin de l'Académie de médecine, janvier 1886,

Gavrien et Éranu (Ac. des sciences, XCVII, p. 263) ont imaginé une méthode pour isoler tous les corps basiques. Nous ne pouvons entrer dans les détails de ces procédés spéciaux

B.EXxTRAGTION DES TOXINES ALBUMINOÏDES. — On u'obtiendra jamais que des produits impurs si on a eullivé le microbe en milieu contenant des matières albuminoïdes ou des peptonés ; ce qui est d'ailleurs

Fig, 199, le cas ordinaire,

Dialyseur. On traite le liquide filtré

{loxine) par 20 volumes

d'alcool à 95°. Au bout de vingt-quatre heures, on décante la majeure partie de l'alcool, on jette sur un filtre et on lave à l'alcool. On reprend le précipité par l’eau et on dyalise ? pendant quinze heures. On ajoute au liquide aqueux un grand excès d'alcool absolu, on laisse déposer, on filire, on lave à

* Voir le Précis de Chimie physiologique de Hucounexo, Loco cilala, p. 292 et 576 (méthode de Gaurien).

* Les toxines albumosiques ne dialysent pas.

Un dialyseur se compose de deux récipients et d'une membrane de papier purchemin. Le récipient le plus vaste est un cristallisoir contenant de l'eau distillée ; l'autre a une forme variable, mais est ouvert aux deux bouts; son extrémité inférieure est fermée par un tambour en papier parchemin fortement lié par un fil. Ce dernier reçoit la substance à dialyser et est plongé dans le cristallisoir de facon que le papier affleure l'eau distillée qui doit être changée de temps én temps. I faut s'assurer au préalable que le parchemin n'a pas de trous; pour cela on l'étend sur du papier filtré et on passe plusieurs fois une éponge mouillée; le papier filtré doit rester Nous recommandons le dispositif représenté figure 199. Deux lures latérales {(b, b,) du cristallisoir (B) permettent Meur rant d'eau. Le récipient central (A) repose sur des

l'alcool et on dessèche dans le vide. Opérer rapidement et à l'abri de la lumière, Si on distille l'alcool, on retrouve une certaine quantité de substance non précipitée.

Bruecen et Born! isolent la toxine diphtérique en traitant une culture en bouillon peptoné filtrée par une solution de chlorure de zincà { p. 100; ilsdécomposent le précipité insoluble par l’action successive du bicarbonate, du phosphate et du sulfate d'ammoniaque. La substance amorphe obtenue est s0luble ; elle tue le cobaye avec les symptômes classiques, et peut immuaniser. Elle ne donne pas les réactions de l'albumine ou de la peplone.

Certains produits solubles diastasiques adhèrent aux précipilés. C'est ainsi que Roux et Yensix ont vu la toxine diphtérique être entraïnée par les précipités d'alumine et de phosphate de chaux.

$ 3. — ConsEnVATION DES PRODUITS SOLUBLES

Les substances chimiquement pures, extraites des cultures filirées, seront conservées d'après les préceptes ordinaires, en se souvenant de leur grande altérabilité, tout spécialement pour les substances alcaloïdes.

Nous voulons seulement parler de la conservation des cultures filtrées. Elles doivent être recueillies dans des récipients permettant un puisage facile de petites doses sans crainte d'altérer toute la masse. Ces récipients doivent, en outre, répondre à des conditions spéciales à chaque toxine. Beaucoup de eultures filtrées, celle du bacille de la diphtérie par exemple, peuvent être conservées comme du bouillon ordinaire, sans perdre de longtemps leur activité. D'autres, telles que les toxines du tétanos, du choléra s'altèrent avec une rapidité ineroyable au contact de l'air. En quatre jours la toxine cholérique a perdu la moitié de son activité si on la laisse à l'air libre. (le Counwoxr et Dovon). Il faut conserver dans le vide des liquides aussi altérables. D'une façon générale, on devrait tou=

L Burecen et Born, Deutyche medic. Wochensch., 3 décembre 4806,

356 PRODUITS SOLUBRLES MICROBIENS

jours maintenir ses provisions de toxines, s soient, à l'abri du con

à Û de l'air.

Les cultures, que nons fillrons toujours par refoulement, sont reçues dansun des trois récipients figurés aux chapitres 1 et nr. Nous reproduisons ici les deux plus commodes (fig. 200 et 201); nous préférons le flacon à trois tubulures avec montage sans caoutchouc (Ag. 201). La fermeture du

Fig. 200.

Ballon contenant les toxines :

après filtration. tube (7?) se fait à la lampe, sans contamination pos-

sible. On règle la sortie de la toxine en soufflant dans le tube (f”},

On referme l'extrémité eflilée du tube {f!) à la lampe après l'opération. Les bouchons de liège devront être recouverts d'un enduit de gutta-percha (dissoute dans lechloroforme), ou de paraffine, ou de cire à cacheter. I faut avoir soin de ne pas laisser rentrer de l'air par le tube (f) à la fin de l'opération sans entourer l'oriice avec In flamme d'une lampe à alcool qui stérilisera Fig. 201.

J'air à son passage. Flacon contenant les toxines 4 après filtration.

, tube U le = ia ferré ayaul era l'E nione — f*, tube pour soufller,

les recevoir quelques centimètres cubes d'huile de Ja stérilisation. L'huile se stérilisera avec

l'appareil. Les toxines (d}, aussitôt dans le flacon, sont recouvérles d'une souche d'huile (e), qui surnage et les préserve du contact de l'air (fig. 202).

On pourra aussi employer notre appareil à conservation de toxines dans le vide (page 202; fig. 434),

On transvase parfois la culture filtrée dans des tubes de

Fig. 202. Fig. 203.

Conserve de lorine sous l'huile. Tubes à essai pour la conserve

d, toxine. — €, huile. dtosneee As tube rempli. — B, tube scellé à la Inmpe,

verre qu'on remplit bien et qu'on scelle à la lampe. J'ai pendant longtemps conservé mes provisions de toxine tétanique dans des tubes de verre de 20 centimètres cubes, semblables à des tubes à essai, muis présentant un long étranglement (fig. 203, A). Je remplissais jusqu'au milieu de l'étranglement et je fermais à la lampe (fig. 203, B). Les toxines ainsi conservées étaient encore actives au bout de deux ans. Il ne faut pas que l'étranglement soit trop étroit; on aurait dés difficultés pour introduire la toxine. 11 faut attendre quelques minutes après le remplissage pour fermer à la

le. |

358 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS ,

lampe ; si le verre était encore humide, il casserait. L'inconvénient de ce procédé est la perte à peu près fatale de toute la toxine contenue dans un tube quand on ouvre celui-ci. Nous préférons aujourd'hui la couche d'huile.

Quel que soit le récipient employé, il devra toujours être conservé à la glacière, à l'abri de la lumière.

On pourra conserver les toxines desséchées, à l'état pulvérulent. On opèrera comme pour les sérums (page 846).