SEV
Fig. 57.
Appareil des frères Lumière pour recueillir aseptiquement le sang des petits animaux.
Pour s'en servir, on adapte à (E) un court tube de caoutchouc muni d'une aiguille en platine iridié et stérilisé à l'autoclave. On introduit l'aiguille dans la veine ou l'artère et on aspire par (D) jusqu'à ce que le sang remplisse (A). On pince alors le caoutchouc, on retire Taiguille, on incline le tube, on enlève
le tube de caoutchouc, en maintenant rextrémité de E dans a flamme d'une lampe à alcool, on met un tampon d*ouate. Quand le caillot est formé, on retourne Tappareil : le caillot est retenu par les pointes de (Â) ; le sérum s'écoule par (D).
Pour avoir du sérum aseptique des grands animaux (cheval, âne, bœuf), on suivra la méthode que nous décrirons avec grands détails à propos de la Sérothérapie (p. 829) .
Pour le sérum humain, voir plus loin la méthode de prise aseptique du sang.
Le sérum liquide est employé pour conserver intacte la virulence de certains microbes {Streptocoque pyogène, etc.); il sert à toutes les expériences où on veut rechercher ses effets bactéricides, microbiophiles, agglutinants, etc.
BuMM, en 1885, a cultivé le Gonocoque sur sérum humain.
Plus on va, plus on utilise les sérums dans la fabrication des milieux de culture.
2^ Sang. — Les milieux à base de sang ont pris récemmen une grande importance en bactériologie.
On peut employer le sang directement. C'est le procédé employé par LiGNiÈREs pour cultiver le protozoaire de la Tristeza iPiroplasma bigeminum).
Il faut remédier à la coagulation, pour avoir un milieu liquide .
La défibrination (agiter pendant dix minutes dans un flacon résistant stérilisé, contenant des perles de verre) du sang aseptique est souvent employée.
On utilise aussi les propriétés anticoagulantes de certaines substances (peptone, têtes de sangsues, certains sels). On injecte, dans les veines d'un chien une solution, en eau physiologique, à 10 p. 100, de peptone Wilte (Ok^S par kilogramme) ; pendant les deux heures suivantes, la saignée donnera un sang incoagulable. Le lapin ne convient pas à ce procédé. Le sang ainsi obtenu finit par se coaguler ; parfois les chiens son t réfractaires ; le moyen n'est donc pas à recommander.
Pour utiliser les têtes de sangsues, on les durcit pendant quelques jours dans Talcool fort, on les dessèche et on les broyé. On fait bouillir dans l'eau (une tête pour 5 à 10
centimètres cubes d'eau), on filtre et on stérilise à+ 105^ pendant cinq minutes. On répartit dans les tubes destinés à recevoir le sang. Le sang se coagule à la longue.
Le citrate neutre de soude à 3 p. 1.000 rend le sang incoagulable.
En somme : c'est à la défîbrination qu'il faut s'adresser.
Le sang est plus fréquemment additionné à d'autres milieux, particulièrement à la gélose, soit incorporé, soit versé à la surface. C'estsur une gélose sanglante que Pfeiffer et Beck ont, en 1892, cultivé le Bacille de Vinfluenza. Elle a aussi servi à cultiver le- Gonocogue, le Bacille de Ducrey, le Bacille de Koch (Bezançon et Griffon, etc.).
Pour avoir du sang humain aseptique, on fait couler dans un tube stérilisé le sang du cordon ombilical, avant la délivrance, après avoir flambé la surface de section ; ou on puise le sang dans une veine du pli du coude avec une seringue stérilisée (voy. p. 325).
3*^ Lait. — Il convient à la culture de nombreux microorganismes. Il sert en outre à différencier certaines espèces (B. d'Eberih et B. Coliy par exemple) suivant que celles-ci le coagnlent ou le laissent liquide.
On peut le recueillir aseptiquement au pis de la vache (nettoyé et lavé au sublimé) et le distribuer en ballons stérilisés. Un grand nombre de ceux-ci placés à l'étuve, resteront stériles. On s'en assurera en ensemençant une goutte de chacun en bouillon .
En général, on stérilise à l'autoclave à + H0<> ou -}- 115<^ pendant un quart d'heure. Le lait est alors privé de ses parties grasses qui restent à la surface.
La méthode de tyndall (une heure à -f 65<^ ou -f 70<» pendant six jours de suite) est applicable.
Le lait doit être choisi alcalin.
Pour savoir si les microbes coagulent le lait par formation d'acide ou par sécrétion de présure, on peut additionner le lait de teinture bleue de tournesol stérilisée. Le lait acide virera au rouge.
Nombre de microbes redissolvent (production de présure et de caséase) le caillot formé (B. pyocyanique, B. subtiliSy etc.)
4^ Petit lait. —Le petit lait est employé pour la fabrication de certaias milieux. On l'obtient, en chauffant à une douce chaleur, d\L lait additionné d'une petite quantité de solution étendue d'acide chlorhydrique. On filtre, on neutralise, on stérilise. (Voyez Petruschky, page 88.)
5<> Urine. —Pasteur s'est beaucoup servi de l'urine pour cultiver certains ferments (1876) et, plus tard, la Bactéridie charbonneuse. Ce milieu est bien abandonné aujourd'hui. On peut recueillir l'urine aseptiquement, et se contenter de l'éprouver à rétuve ; sinon elle sera filtrée, neutralisée et stérilisée comme du bouillon. A + HO® l'urine acide devient franchement alcaline. Pour Miquel, l'urine normale est peu putrescible ; elle l'est davantage après une neutralisation par la soude.
Les solutions d'urée sont quelquefois employées. Il faut savoir que si l'urée sèche supporte bien + 105'^ pendant une heure, une solution d'urée se décompose vers + 90^
On a cultivé le Gonocoque dans de l'urine additionnée de 1/2 p. 100 de peptone.
6"" Sérosités naturelleSy Humeur aqueuse. — L'humeur aqueuse a été employée par Koch pour cultiver « cm cellule « la Bactéridie charbonneuse et étudier son évolution. On sacrifie un animal. On stérilise, avec un agitateur chauffé, la surface de la cornée qu'on ponctionne avec une pipette en verre ou une seringue stérilisées.
On peut imaginer tout une série de liquides naturels (liquide céphalo-rachidien, extraits d'organes, etc). Il va sans dire qu'on ajoutera fréquemment, suivant les besoins, aux liquides naturels, des peptones,de la glycérine, du glycose, etc. Ils seront neutralisés si besoin est.
7° Sérosités pathologiques. — On utilise de plus en plus des liquides d'hydrocèle, de pleurésie, d'ascite, (cultures de nombreux microbes exigeant des milieux albumiiieux).
On peut les recueillir aseptiquement dans un appareil de Potain stérilisé. Gomme ces liquides contiennent souvent le microbe pathogène de la maladie, il faut les éprouver avec soin. On pourra les stériliser comme le sérum (méthode de Tyndall) .
8® Œufs. — Les œufs peuvent être employés liquides. Il faut savoir qu'ils ne sont pas toujours aseptiques.
HuEPPE a ainsi cultivé le V. cholérique. On secoue violemment un œuf frais pour mélanger le jaune avec le blanc ; on lave la coquille au sublimé, et on flambe le bout où se trouve la chambre à air ; on ponctionne en ce point avec Taiguille d'une seringue qui contient la semence, et on pousse quelques gouttes. L'œuf est alors recouvert d'une couche de collodion et mis à l'étuve.
On peut, aussi retirer le blanc seul avec une pipette et le distribuer dans des ballons ou le faire coaguler dans des tubes.
Le jaune est, le plus souvent, employé d'après la formule :
Jaune d'œuf 100 ce.
Eau distillée 1 000 —
Soude à 10 0/0 5 —
B) Liquides artificiels
Ce sont des liquides inventés pour les besoins de la bactériologie.
±^ Liquenrs chimiquement définies. — Elles ne contiennent pas de substances organiques.
Si. Liquide Pasteur. — Il date de 1859 ; c'est la première solution minérale employée comme milieu de culture *. En voici la formule :
Eau distillée 100 grammes.
Sucre candi 10 —
Cendres de levure de bière 0 gr. 075
* Pasteur, Mémoire sur la fermentation lactique^ Annales de physique et chimie, 1859.
Pasteur modifia plus tard cette formule de la façon suivante pour cultiver la levure de bière :
Eau distillée 100 grammes.
Sucre candi 10 —
Tartrate d^ammoniaque 0 gr. i
Gendres de 1 gramme de levure. . . .
b. Liquide Cohn, — Le liquide de Gohn est ainsi composé :
Eau distillée SOO grammes.
Tartrate d'ammoniaque S —
Phosphate de potasse 2 —
Sulfate de magnésie i —
Phosphate' tri basique de chaux .... 0 gr. 1
C'est le liquide de Afayer avec addition d'une substance azotée, le tartrate d'ammoniaque.
c. Liquide Raulin. — Raulin a fait son remarquable travail * sur les conditions de développement de YAspergillus niger (champignon) avec le liquide suivant :
Eau 1 500 grammes.
Sucre candi 70 —
Acide tartrique 4 —
Nitrate d'ammoniaque 4 —
Phosphate d'ammoniaque 0 gr. 60
Carbonate de potasse U gr. 60
Carbonate de magnésie 0 gr. 40
Sulfate d'ammoniaque 0 gr. âo
Sulfate de zinc 0 gr. 07
Sulfate de fer 0 gr. 07
Silicate de potasse 0 gr. 07
Avec ce milieu, la récolte d'Aspergillus était tellement abondante qu'elle équivalait à 10.000 kilogrammes à l'hectare pour un végétal ordinaire.
Malheureusement, toutes ces solutions minérales, excellentes
' Raulin, Etudes chimiques sur la végétation, Recherches sur le développement d'une mucédinée dans un milieu artificiel, Ann. des sciences naturelles, 1870.
pour la végélalion des champignons, ne conviennent que très mal à celle des microbes.
d. Liquide Arnaud et Charria. — Le liquide d'ARNAUD etCHAR- RiN (1892), permettant la végétation du B. pyocyanique est le suivant :
PO*KH* 0 gr. dOO
PO*Na«H + li Aq . . 0 gr. 100
CO'KH 0 gr. 134
Ca Cl* 0 gr. 050
Mg SO* + 7 Aq 0 gr. 050
Asparagine cristallisée 5 gramme*.
Eau : Q. S. pour faire 1 litre.
Il a permis d'étudier le sort de l'azote, du carbone et de l'oxygène, pendant la végétation du microbe. L'azote est fourni par l 'asparagine.
e. Liquide Ouchinsky (1893). — Il est une modification du liquide de Nckgeli.
Eau 1 000 gr.
Glycérine 50. 0
Chlorure de sodium 7,0
Laclate d'ammoniaque 10,0
Chlorure de calcium 0,1
Sulfate de magnésie * . 0,2
Bi-phosphate de potasse 1,0
L'azote est fourni par le lactate d'ammoniaque. Ouchinsky ajoute quelquefois 0,5 p. 100 d'urée ; 0,02 à 0,03 p. 100 d'acide urique ; 0,8 à 1,5 p. 100 de sucre. On ne s'inquiète pas du précipité formé pendant la neutralisation. La plupart des microbes, sauf le D. d'Eberth et le Bacille tuberculeux, pousseraient dans ce milieu. Hugounexq et Doyox n'ont pas réussi à y cultiver le B. de Lôfflcr et le B. du Choléra qui avaient si bien végété entre les mains d'OucHiNSKV.
f. Liquide Lepierrc^. — L'auteur a voulu composer un
* Ch. Lepierre, Les gluco-protéines comme nouveaux milieux de culture chimiquement définis pour V étude des microbes. C. R. Acad, des Sciences, 8 juillet 1901.
PHBCIS DB DACTBRIOLOGIE, 2* édlt 6
milieu azoté, chimiquement défini, suffisamment nutritif pour la plupart des microbes. C'est, ainsi que nous l'avons dit page 70, un des principaux desiderata du bactériologiste. Lepierre a utilisé les produits de dédoublement des albuminoïdes, nommés g lucopr oléines a. Ces substances sont nutritives tout en n^étant plus protéiques.
Eeu 100 grammes.
Glucoprotéine pure (C à G") 1 gr. 5 à 2 gr.
Glycérine, glucose ou saccharose . . â à 3 gr.
Chlorure de sodium 0 gr. 5
Sulfate de magnésium 0 gr. 5
G lycéro phosphate de calcium .... 0 gr. 2 à 0 gr. 3
Bicarbonate de potassium 0 gr. 1 à 0 gr. 2
Suivant l'auleur, 43 microbes .étudiés ont poussé dans ce milieu aussi bien que dans les bouillons ordinaires.
g. Eau de mer. — Diflocq, Lejkuxe et Bertrand (1900) ont utilisé l'eau de mer comme milieu de culture. Ils additionnent d'eau distillée (pour arriver à 9 grammes de sel par litre), de lactate d'ammonium, d'azotate d'ammoniaque et de quelques phosphates. Ils alcalinisent, slérilisent et IJUrent. C'est un milieu dépourvu de matières albuminoïdes, et cependant les microbes poussentbienetsécrèlent des produits albuminoïdes. L'intérêt de ce milieu résiderait précisément dans ce dernier fait.
2"" Infusions végétales. — On a préconisé des décoctions de plantes. L'eau de foin a joui d'une grande faveur. Les qualités nutritives de ces infusions sont en général faibles. Elles sont excellentes pour cultiverle? champignons, très inférieures pour cultiver des microbes. La préparation se compose des temps suivants : macération, neutralisation, filtration, stérilisation.
Veau de pomtue de terre est obtenue en incorporant, à un demi-litre d'eau, iO à 20 grammes de pulpe de pomme de terre obtenue à l'aide d'une râpe de nickel. Macération pendant deux heures : ébullition ; filtration ; stérilisalioii. O milieu est lécèrement acido.
LuBiKSKi cultive le Bacille de Koch dans de Teau de pomme de terre additionnée de 4 p. 100 de glycérine.
Veau de levure se prépare ainsi. Mettez 100 grammes de levure dans 1000 grammes d'eau, et délayez lentement. Faites bouillir. Neutralisez ou alcalinisez légèrement avec une solution de soude. Filtrez. Stérilisez à Tautoclave k + ii^^ pendant un quart d'heure.
Veau de malt est une solution à 10 p. 100 de malt (orge germée) dans de l'eau. Chauffez à + Sb^^-SS** pendant une heure, sans dépasser cette température, sous peine de détruire la diastase. Portez ensuite à Tébullition, filtrez, stérilisez à + H5«, etc.
G. Roux (1889) a préconisé Veau de touraillon comme un liquide souvent supérieur aux meilleurs bouillons, pour la culture des microbes et particulièrement de certains streptocoques. Le touraillon est le résidu desséché du malt qui a servi aux brasseurs. L'infusion est à 10 p. iOO comme Teau de malt. Les milieux au touraillon ne permettent pas le développement du Vibrion cholérique; ils sont antiseptiques vis-à-vis de ce microbe (G. Roux).
Pour la décoction de fruits (prunes, etc.), on laisse macérer pendant un jour dans de Teau, on fait cuire dans cette eau sans écraser. On filtre, on neutralise, on stérilise.
On a aussi employé des décoctions de crottin de cheval ou de toMt autre herbivore. On met macérer une partie de crottin frais dans trois parties d'eau pendant vingt-quatre heures ; on fait bouillir, on filtre, etc.
Le vin neutralisé et stérilisé avait été employé par Pasteur pour cultiver en grand le Bacillus anthracis.
.3^ Infusions animales (bouillons). — Le bouillon est le milieu universellement employé pour cultiver la grande majorité des bactéries. C'est le liquide nutritif courant dans les laboratoires. f*
a. Bouillons de viande. — Ce sont les liquides de choix. Pasteur s'était d'abord servi de bouillon de poulet. La viande de bœuf ou de veau est préférable. Le bouillon simple est peu usité :
on y ajoute en général différentes substances, destinées à augmenter sa puissance nutritive, spécialement do la peptone.
On prend UOO grammes de viande choisie, débarrassée des os, de la graisse, des tendons, etc., et hachée finement. On les place dans un récipient contenant 4000 grammes d'eau distillée*. On mélange soigneusement. On peut alors laisser macérer à froid pendant vingt-quatre heures, ou à cliaud pendant une demi-heure (à -f- 50^^ environ, c'est-à-dire à une température qui ne coagule pas Taibumine) ; la macération à froid est préférable. On exprime sur un linge mouillé, et on ramène la quantité à 1000 grammes. On ajoute iO grammes de chlorure de sodium (la viande est pauvre en chlore et en sodium), 20 grammes de peptone Chapoteaut, et quelquefois i gramme de phosphate de soude. On fait bouillir pendant vingt ou trente minutes. On écume, on dégraisse, on filtre sur papier épais et on neutralise. Le bouillon est normalement acide ; il rougit le papier de tournesol bleu ; or, la grande majorité des microbes réclament un milieu neutre ou légèrement alcalin. On verse goutte à goutte dans le bouillon une solution de carbonate de soude y jusqu'à, ce que le papier de tournesol. donne une réaction neutre ou légèrement alcaline. On filtre de nouveau si c'est nécessaire.
Il faut alors mettre le bouillon dans le récipient où il sera stérilisé et conserve. Nous employons des flacons à deux tubulures d'une contenance d'un litre (fig. 58) : les deux tubulures sont bouchées par un tampon d'ouate. A travers le tampon de la tubulure latérale (A) passe un tube de verre (B) qui plonge jusqu'au fond du flacon et est recourbé en U renversé au dehors du flacon. La branche externe de l'U est reliée par un petit tube de caoutchouc (G), long de o centimètres, à un tube de verre (D) dont l'extrémité inférieure est effilée et fermée à la lampe comme une pipette. Le flacon est rempli de bouillon aux deux tiers et stérilisé à l'autoclave par une exposition de
* Il va sans dire qu'on peut modifier la proportion de viande et d'eau pour avoir, s'il en est besoin, des bouillons moins riches. Chauveau a cultivé son vaccin charbonneux dans du bouillon de veau très pauvre à 1/5 au lieu de 1/2.
vingt à trente minutes à + 110<* à 120^ Pendant le chauffage les tubes B, C, D se sont purgés d'air et remplis de vapeur d'eau qui se condense au refroidissement ; le bouillon les envahit alors, le siphon s'amorce donc de lui-même et le flacon a l'aspect représenté dans la flgure 58.
11 se produit en général un dépôt assez abondant (surtout si le chauffage a été trop intense ou trop prolongé), qui se condense rapidement au fond du récipient, et ne trouble que les dernières gouttes lors de la décantation.
Pour s'assurer que la stérilisation a été parfaite, on place pendant vingt-quatre heures le flacon chargé de bouillon dans une étuve à + 38<>; il doit rester limpide. Un flacon de bouillon ainsi préparé peut être indéfiniment conservé dans une armoire à l'abri de la poussière; le liquide perd cependant à la longue ses propriétés nutritives.
Lorsqu'on veut transvaser le bouillon du flacon dans des ballons, on opère de la façon suivante (fig. 58). On place une pince de Mohr (E) sur le tube en caoutchouc (C) ; on flambe l'extrémité effilée du tube de verre (D) et on la casse avec des pinces flambées; on reflambe l'extrémité ouverte et on l'introduit dans le goulot d'un ballon stérilisé. Le ballon doit être penché presque horizontalement, et le capuchon de papier tenu verticalement l'ouverture en bas, afin d'éviter la chute des germes de l'atmosphère dans le ballon ou dans son capuchon. Ces ballons ont été décrits page 24 et figure 12. Une seule main suffit à tenir le ballon et son capuchon, ce dernier par les deux derniers doigts (fig. 59). On presse alors de l'autre main sur la pince, et le liquide coule par siphonnement dans le ballon. On lâche la pince lorsque le tiers inférieur du ballon est chargé de bouillon, on retire le ballon dans une position aussi horizontale que possible, on flambe le goulot et on remet le capuchon avec la main devenue libre. On remplit ainsi un grand nombre de
Fig. 58.
Flacon pour la conserve et la distribution du bouillon (système du siphon).
MILIEUX DR CULTUHE
ballons* et on les éprouve pendant vingt-quatre heures à l'étuve à + 38**; ceux qui sont rest€*s clairs sont prêts à être ensemencés.
La manœuvre sera identique pour le transvasement du bouillon dans des récipients quelconques. Si les ballons sont bouchés à la ouate, on tiendra le tampon en Tair avec une
Distribution du bouillon en petits ballons à l'aide du flacon-conserve
représenté figure 58 (système du siphon).
pince et on le flambera avant de reboucher. Lorsque le flacon ne contient plus que quelques centimètres de liquide, on le penche latéralement, dans un tiroir par exemple, pour que le siphon ne se désamorce pas. On s'arrêtera dès que le dépôt du fond troublera le bouillon.
Nous employons aussi un autre dispositif dans lequel le bouillon est chassé dans le siphon par refoulement (flg. 60). Le flacon à deux tubulures est alors bouché avec deux bouchons en liège laissant passer deux tubes de verre. Celui du milieu(A) ne dépasse pas la surface inférieure du bouchon ; il est coudé à angle très obtus au sortir du flacon, et bouché à la ouate. Celui de la tubulure latérale (B) est un U renversé dont une des branches de calibre uniforme, plonge jusqu'au fond du flacon, et dont la branche extérieure est effilée en pipette et
est presque de même longueur. Après stérilisation à Tautoclave, les deux bouchons sont vernis à Textérieur avec de la guttapercha dissoute dans le chloroforme, ou mieux sont enduits de paraffine qu'on verse chaude avec une plume ou un petit pinceau.
Lorsqu'on veut transvaser le bouillon, on adapte au tube (A) un petit tube de caoutchouc (C) qui permet de souffler dans le flacon ; Tair sera filtré à mesure dans le tampon de ouate. On flambe, on casse, on reflambe la pointe eflilée et on op^re comme précédemment. On suspend Técoulement du bouillon en -serrant le tube de caoutchouc entre les dents, ou en appliquant la langue contre son orifice.
Cette disposition ne vaut pas la précédente ; on s'expose à perdre du bouillon ou à laisser rentrer de Tair entre chaque remplissage de ballon.
Elle a le seul avantage de rendre libre les deux mains de Texpérimentateur, et de permettre un écoulement plus rapide lorsqu'on veut transvaser le bouillon dans de grands récipients.
Dans la plupart des laboratoires on stérilise le bouillon dans un grand ballon bouché à la ouate. Pour transvaser on y plonge une pipette Chamberland (fig. lo, p. 26) bien stérilisée, et on aspire. On écoule ensuite dans les petits ballons le bouillon de la pipette Chamberland, en l'inclinant suttisamment. Nous rejetons cette façon de procéder comme longue et exposant trop aux contaminations par l'air pendant les difl'érents temps de l'opération.
On fera naturellement varier la composition du bouillon depuis la simple infusion de viande saléCj (le bouillon salé est bien supérieur au bouillon simple comme valeur nutritive (Miquel), et permet de conserver plus longtemps la virulence de certains microbes tels que le Streptocoque pyogène (Arloixg),
Pig. 60.
Flacon pour la conserve et la distribution du bouillon (système du refoulement).
88 MILIEUX DE CCLTUBE
en passant par le bouillon peptoné, pr^^cédemmenl décrit et le plus usité, jusqu'aux bouillons glycosés, lactoses, glycérines, etc. Pour le bouUlon glycosé on ajoute 1 à 2 p. 100 de glycose pure en même temps que le sel marin ; pour le bouillon lactose : 2. p. 100 de lactose *. Pour le bouillon glycérine on ajoute 5 à 10 p. 100 de glycérine pure, après toutes les filtrations, au moment de verser le bouillon dans le flacon où il sera stérilisé. On s'assurera que le bouillon est resté neutre, et on le neutralisera si besoin est. Ce bouillon sert spécialement à la culrtire du Bacille tuberculeux (Nocard et Rorx, 1887).
A la place du tissu musculaire on peut employer différente viscères (foie, rate, poumons). Ces bouillons ne sont jamais clairs.
b. Bouillons colorés. — On additionne le bouillon de diverses matières colorantes, pouvant renseigner sur certaines réactions qui accompagnent le développement microbien, et servir à la diagnose de l'espèce. Di'claux est le premier qui ait ajouté de la teinture de tournesol aux milieux liquides, pour savoir, à la simple inspection de la couleur, si le liquide était devenu acide ou était resté neutre. Nous verrons (p. 673) qu'on différencie le Bacille cVEberth du Colibacille en cultivant ces deux microbes dans du bouillon lactose (à 2 p. 100) et tournesolé, stérilisé par filtration ; seule la culture du Colibacille tourne au rose.
La sensibilité des milieux lactoses et tournesolés est relativement faible. Un Coli-bacille peu actif, fabriquant peu d'acide, pourrait passer pour un B. cTEberth.
Petruchsky a préconisé le petit lait tournesolé (caséine précipitée par l'acide chlorhydrique). Ce milieu est diflicile à neutraliser (on ne peut le faire qu'avec la soude). En outre, le B. d'Eberth l'acidilie légèrement, parce que le milieu renferme du glucose (sous l'influence de l'HCl). Ce procédé est donc à rejeter.
* P. CoiRMoNT a remarqué que la lactose subissait au chauffage une certaine altération la rendant plus fennentescible. Il vaut mieux tériliser le bouillon lactose par la filtration sur porcelaine.
BOCJILLONS 89
Grimbert et Legros ont recommandé un excellent milieu. 11 faut que le lactose soit bien pur (le B. d'Eherth est encore le meilleur réactif de cette pureté). On porte à Tébullition :
Lactose pnr 2 grammes.
Peptone 0 gr. 50
Eau distillée 0 gr. 100
et on y ajoute une petite quantité de carbonate de chaux pur, on filtre au bout de cinq minutes, et on s'assure que la réaction est neutre. La neutralisation au carbonate de chaux exclut tout danger d'un excès d'alcali. On filtre sur bougie ; on répartit en ballon, et on ajoute la quantité sullisante de teinture de tournesol stérilisée à l'autoclave.
Ce liquide est extrêmement sensible.
RoTHBKRGER a imaginé le bouillon coloré suivant, pour faire des cultures différentielles du B. dEberth (voy. p. 414).
On fait bouillir 425 grammes de viande de bœuf dans 150 grammes d'eau; on ramène à 500, grammes; on filtre ; on ajoute :
Peptone Dufresne 10 grammes.
Sel marin 10 —
Glucose 2 gr. 50
On fait bouillir ; on laisse refroidir. On ajoute 5 c. c. d'une solution aqueuse de Neutral-Roth à 5 p. 100. On stérilise à + 115^ On répartit en ballons.
c. Solutions de peptone. — Une simple solution de peptone à 1 p. 100, salée à 0, 5 p. 100, avec 2 p. 100 de gélatine, est le milieu de culture type pour le Vibrion cholérique (Durham, 1887). KocH recommande la peptone de Wittk, une dose de 1 p. 100 de sel, et d'alcaliniser fortement.
d. Solution de somatose. — Gerkst (1896) préconise une solution de somatose (succédané de la peptone) à 10 p. 100 comme un milieu de préparation facile et rapide.
e. Bouillon Massart et Bordet. — Massart et Bordkt (1892) ont cultivé nombre de microbes dans le liquide suivant :
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peut clarifier, après le premier chaufTage, avec un fragment de chlorure de calcium et un morceau de phosphate de soude.
Tel est ce milieu très peptoné et non sucré. H a également servi à cultiver le Microbe de la péripneumonie bovine.
h. Bouillon Massol. — Également pour le Bacille de Lôf/ler.
Viande de veau faisandée 500 grammes.
Eau 1000 —
Peptone de Witte iO —
On neutralise avec une solution de soude causti'que normale à 40 p. 1000. On ajoute, en plus, 6 à 7 centimètres cubes de la solution de soude, par litre. Filtration sur papier. Stériliser en filtrant sur bougie Chamberland ou à + 120<>.
i. Bouillon Spronck. — Milieu recommandable pour la culture du Bacille de LÔffler, qui y produit, en 5 à 6 jours, une toxine très active.
Levure du commerce (van Marken) . . 1 000 grammes. Eau 5 000 —
Ébullition pendant 20 minutes, en agitant avec une spatule. Repos de vingt-quatre heures, au frais, dans un vase cylindrique. Décantation. On abandonne la levure.
Liquide louche 1 litre.
Chlorure de sodium 5 grammes.
Peptone de Witte (Rostock) 20 —
Neutralisation à la soude. En plus : addition de 7 centimètres cubes de solution de soude normale, par litre (forte alcalinisation). Chauffage. Filtration sur papier. Stérilisation à
Ce milieu est bon marché, et reste alcalin (le Bacille de LÔffler ne produit pas d'acides, en raison de la pauvreté en sucre de la peptone de Witte).
j. On se souviendra que des quantités, même très faibles de substances antiseptiques peuvent empêcher le développement des microbes dans le bouillon, ou en modifier profondément
la morphologie, comme Tont vu Guignard et Charrin (page 9, fig. 3).
Milieux solides
Les milieux solides se divisent, comme les milieux liquides, en naturels et artificiels.
Nous avons déjà parlé (p. 71) de leur découverte par Kocu, en 1881. On se reportera au chapitre vu (p. 223) pour trouver l'explication des avantages de leur emploi.
A) Milieux naturels
On peut solidifier des liquides naturels ou artificiels, ou employer des substances naturellement solides.
±^ Sérum sanguin. — Le sérum sanguin est le plus souvent employé à l'état solide, d'apri's la méthode de Koch.
Supposons que le sang ait été recueilli sans précautions aseptiques, à l'abattoir par exemple, au sortir de la veine d'un bœuf, d'un cheval, ou de tout autre animal. On le reçoit dans de grands cristallisoirs en verre de Bohême à couvercle (fîg. 61), d'une contenance de deux litres environ, et préalablement stérilisés à l'autoclave *. (La stérilisation par la chaleur shchf- a l'inconvénient de faire adhérer le caillot aux parois, ce qui diminue la récolte de sérum.) Il ne faut pas se servir d'éprouvettes pour recueillir le sang, car le caillot peut occuper tout
* Bien que ropération ne se fasse pas aseptiquemeut, il faut néanmoins stériliser les récipients, et manipulor avec le plus de propreté possible, la stérilisation ultérieure ne devant s'effectuer qu'à -j- 60® et deux jours plus tard. Il faut introduire le moins de germes possible.
Fig. 61.
Cristallisoir en verre de Bohème pour recueillir le sang du bœuf à l'abattoir.
le diamètre de l'éprouvette et empêcher la prise d'un sérum clair. On préparera plusieurs cristallisoirs de deux litres, pour profiter de la saignée totale d'un bœuf ou d'un cheval.
Ces cristallisoirs, remplis de sang aux trois quarts de leur hauteur, sont laissés sur place dans un endroit frais. Il ne faut
Fig.;6i.
Bain-marie, avec régulateur métallique de Roux, pour la stérilisation
du sérum liquide par la méthode de TyndalL
pas les transporter sous peine d'avoir un sérum rouge; il faut les mettre dans un endroit aussi frais que possible pour éviter le développement des germes avant la stérilisation. Le sérum est un milieu relativement inférieur pour la pullulalion des microbes; aussi cette précaution suffit-elle. Au bout de vingt-
quatre ou quarante-huit heures de repos, le caillot s'est rétracté et occupe le centre du cristallisoir. On répartit le sérum avec une pipette (en ayant soin de ne pas toucher le caillot) dans des tubes à essai bouchés à la ouate, stérilisés d'avance. On met environ 10 centimètres cubes de sérum dans un tube à essai. Le sérum ainsi obtenu varie d'aspect suivant l'espèce animale dont il provient; celui du bœuf est jaune ambré, celui du cheval est presque blanc, celui de l'âne est lactescent, celui du lapin est limpide.
Les tubes sont alors apportés au laboratoire et stérilisés par la méthode de Tyndall ou du chauffage discontinu (p. 48). Ils
Fig. (JX Étuve de Kock pour la gélification du sérum icoupe schématique),
sont placés, trois heures par jour, pendant plusieurs jours de suite, dans un bain-marie réglé de + 58*^ à + 00*. Entre ces séances, ils doivent être maintenus à + 25<> ou + 30® pour permettre la germination des spores non détruites, et dont le mycélium naissant sera tué aisément par le chauffage suivant. Ainsi préparé, le sérum peut être employé liquide.
Le sérum se solidiflo à + 65" ou + 70''; s'il est porté à une température trop élevée, il perd sa transparence; il faut donc
* On a construit un baïa-marie spécial muni d'un régulateur à membrane d'Arsonval représenté figure 0*2. Il est inutile d'avoir cet appareil qu'on peut aisément remplacer en réglant un bain-marie quelconque. Voir, page 349. le bain- marie de Wiesnegg.
le chauffer au degré minimum nécessaire à sa coagulation, c'est ce qu on appelle \a gélification ou gélatinisation du sérum. Les tubes doivent être chauffés dans une position inclinée, pour
Étuve de Koch pour i^éiUiCQitiondM sérum y avec réyulaleur iVArsonval.
que le sérum solidilié offre une longue surface; il ne doit pas toutefois venir toucher le tampon de ouate. Koch a fait construire un appareil spécial pour cette opération. C'est une étuve quadrangulaire peu profonde dont la coupe est représentée figure. 63. L'espace (A) est rempli d'eau par le tube (B). Un couvercle en verre (G) est recouvert d'une lame de feutre (D). Une cale (K) permet linclinaison convenable de l'appareil.
Dans lés appareils français Tétuve de Kogh est muni« d'un régulateur d'Arsonval (Hg. 64). Elle est réglée à + ^^^ ou + 68^
Le temps nécessaire varie entre une demi-heure à une heure. Il faut surveiller étroitement l'opération à travers le couvercle vitré. Dès qu'un tube prend une demi-transparence ambrée, il doit être examiné, et immédiatement retiré s'il est de consistance solide; les tubes restés trop longtemps à la chaleur de Fétuve deviennent opaques. Le sérum ainsi obtenu est plus ou moins transparent suivant resi)èce animale dont il provient et la perfection de la gélatinisation. 11 va sans dire qu'on peut solidifier du sérum sans posséder une étuve de Koch.
Après avoir été éprouvés à Tétuve à + 38<*, les tubes de sérum seront placés verticalement (à cause de l'eau de condensation qui s'accumule à la partie inférieure) dans une armoire avec un capuchon de caoutchouc pour éviter une trop rapide dessiccation (fig. 65); un tube dont la surface est desséchée ne pourra plus servir; la végétation ne s'opérerait pas. ^
Les capuchons de caoutchouc seront stérilisés dans le sublimé; sans cette précaution ils propagent des moisissures qui, descendant le long du coton contre le tube de verre, atteignent le sérum et le contaminent.
Si le sérum a été recueilli aseptiquement, la gélatinisation se fait par le même procédé.
Le sérum solide sert à cultiver le Bacille de la tuberculose (Koch), à faire le diagnostic bactériologique de la diphtérie, etc. Le sérum humain serait le milieu sur lequel pousserait de préférence le Gonocoque.
La glycérine a été ajoutée par Nocahd et Roirx (ISSl) aux milieux de culture qui conviennent au Bacille de la tuberculose. Pour avoir du sérum glycérine, on ajoute 6 à 8 p. 100 de glycé-
Fig. 65.
Tube de sérum
gélifié.
I , capuchon de caoulchouc. ' — t^ lampoii de colon. — 3, sérum. — 4, eau de condensation.
rine stérilisée au sérum avant la distribution dans les tubes à essai. Il faut une température de + 75<> à + 78° pour gélifier le sérum glycérine. Il se dessèche moins que le sérum simple.
Pour le diagnostic bactériologique de la diphtérie on se sert de sérum de bo^uf simple.
Voy. p. 771 les géloses à base de sérum pour la culture du Gonocoque,
2^ Liquides pathologiques. — On pourrait traiter par les mêmes procédés des liquides pathologiques tels que : liquide d'hydrocèle, d'ascite, de pleurésie, etc.
8^ Blanc d'oauf. — On a cultivé sur des blocs de blanc d'œuf cuit les bactéries colorées qui tranchent bien sur ce fond blanc. On découpera aseptiquement des petits cubes de blanc d'œuf dur, et on les mettra dans des tubes à essai, comme s'il s'agissait d'un morceau de pomme de terre (voy. plus loin). ScHENK a recommandé, en 1887, l'usage des œufs de vanneau !
40 Pomme de terre. — La pomme de terre est très riche en hydrocarbures ; elle constitue un bon milieu, très fréquemment employé. Elle peut être utilisée crue, mais la végétation des microbes se fait mieux sur la pomme de terre cuite.
Le procédé primitif de Koch consistait à faire cuire à l'eau une pomme de terre entière, à la couper par le milieu avec un couteau llambé, et à déposer les deux moitiés dans un cristallisoir lavé au sublimé et muni d'un couvercle. Il a été modifié de la façon suivante, pour les cas, d'ailleurs rares, où on a besoin d'une grande surface de pomme de terre.
On choisit des pommes de terre de bonne qualité, de variété blanche, ayant la peau fine. On les lave en les frottant avec une brosse dure pour entraîner toutes les impuretés de la surface ; on enlève à la pointe du couteau tous les yeux, tous les points malades, et on les plonge pendant une heure dans une solution de sublimé à 1 p. 1000. Toutes ces précautions sont indispensables, car la pomme de terre est fréquemment souil-
PRÉCIS DE BACTÉRIOLOGIE, 2* édit. 7
MILIEUX DK CULTURE
Fig. 66.
Cristallisoir contenant une moitié de pomme de terre, prête à être ensemencée.
lée par le B. mésentëricus vulgatus, communément appelé Bacille de la pomme de terre (Kartoffelbacillus), microbe extrêmement répandu dans le sol, et dont les spores peuvent résister quelque temps à + 130<*. La pomme de terre peut aussi contenir le Bacillus mésentëricus fasctis (bacille brun) et le B. mésenruber (bacille rouge de Globig) dont les spores sont également très résistantes. On voit fréquemment ces bacilles se développer, malgré la stérilisation, sur la pomme de terre mal préparée.
On lave au sublimé de grands cristallisoirs (10 centimètres de diamètre sur 5 de haut) à couvercle rodé, en verre de Bohême (pour supporter de hautes températures), et on place dans le fond de ceux-ci plusieurs disques de papier filtre, humecté de sublimé. Les pommes de terre sont alors coupées en deux moitiés égales et chacune de celle-ci est placée, la face plane en Tair, dans un cristallisoir (fig. 66).
On a construit des couteaux en verre pour sectionner les pommes de terre sans laisser à leur surface des sels de fer qui la rendraient noirâtre. On peut
couper la pomme de terre avec un couteau quelconque à large surface, et laver la surface avec de Tean stérilisée.
Les cristallisoirs, fermés hermétiquement par leurs couvercles rodés, sont soumis pendant une heure à -f- 100°, et à+ 125° pendant vingt minutes, dans Tautoclave. On éteint, on retire l'appareil qui est prêt à l'ensemencement.
Certains cristallisoirs (fig. 67) présentent, vers le tiers supé-
Fig. 67.
Cristallisoir à pomme de terre présentant un orifice (a) pour renseiiiencement.
MILIEUX SOLIDES NATUBELS
rieur, une petite ouverture circulaire qu'on obture avec un tampon de ouate, et qui peut servir à ensemencer la pomme de terre sans soulever le couvercle.]
Le procédé de Rotix est bien préférable au précédent ; il est presque uniquement employé. Le récipient est composé d'un tube à essai de 2 ^'", 15 de diamètre environ sur 25 cm. de long, qui porte vers son quart inférieur un étranglement qui empêche la tranche de pomme de terre de tomber au fond : dans la chambre inférieure se condensera Teau qui sortira de la pomme de terre pendant la cuisson (fig. 68).
On pourra toujours étrangler soi-même un gros tube à essai (tube d'Esmarch). Un tampon-ouate placé au fond du tube remplacerait l'étranglement à la rigueur.
On coupe les pommes de terre crues, avec un couteau ou un emporte-pièces» en cubes rectangulaires pouvant entrer dans le tube : on les lave à l'eau pour enlever les sels de fer, on les essuie au papier buvard. Un tampon de ouate recouvert d'un capuchon de papier filtre ferme le tube qui est placé dans l'autoclave. On chauffe une demi-heure à -f- 100", et un quart d'heure à -f 115*^ ou -|- 120». Les tubes sont prêts à être ensemencés. On peut, avec eux, faire des cultures anaérobies, impossibles dans les cristallisoirs (voy . page 205) .
RoDET a imaginé un petit appareil tout en verre pour faciliter l'observation simultanée de plusieurs cultures végétant sur des cubes de pomme de terre, lesquels peuvent provenir de la même pomme de terre. La figure 69 nous dispense d'une description. On coupe, dans une grosse pomme de terre, de tous petits cubes d'égale grosseur qu'on pique sur chaque pointe ; on place le tout dans un cristallisoir (comme il a été dit plus
Fig. 68.
Tube à pomme
de terre.
1 , capuchon de caoutchouc. — 2, Umpon de colon. — 3, cubo de pomme de terre. — 4, rétrécissement. — 5, eau rendue par la pomme de terre.
100 MILIEUX DE CrLTURK
haut), et on fait stériliser. On a ainsi sous les yeux 18 ou 24 colonies ayant poussé dans les mêmes conditions sur la même pomme de terre.
La pomme de terre a aussi été employée en purée (bouillie) qu'on distribue dans des boîtes de Pétri (iig. 18} ou dans de petits cristallisoirs.
La pomme de terre entre dans la composition de la gélatine iVElsner (voir p. 106).
Les cultures sur pomme de terre sont surtout commodes pour étudier les caractères macroscopiques des colonies ;
Fig. 69.
Support de Hodet, pour robservation simultanée de plusieurs cul.
tures sur des cubes provenant de la même pomme de terre.
c'est ainsi que la distinction du B. coli et du B. d'Éberth se faisait, il y a quelques années, par l'ensemencement sur pomme de terre. Aujourd'hui, les caractères macroscopiques des cultures ont beaucoup perdu de leur importance dans la diagnose des espèces : les cultures solides en général, et sur pomme de terre en particulier, ont subi un sort parallèle. On obtient de belles cultures du Bacille tuberculeux en humectant la pomme de terre avec de l'eau glycérinée, dont l'excès occupe la partie inférieure du tube.
5^ Artichaut. — Roger recommande l'artichaut, qui peut, parfois, servir à la diagnose bactérienne.
On enlève les feuilles, on coupe le fond en petits cubes, en ayant soin de conserver le foin. On introduit les morceaux dans des tubes dont l'extrémité fermée est remplie d'ouate humide. On place le foin en haut. On ferme avec de l'ouate et on stérilise un quart d*heure à + US*», dans l'autoclave. On ensemence au point où se fait l'insertion des fleurs.
MILIEUX SOLIDES ARTIFICIELS iOi
Certains microbes (B, Ihyphique) végètent sans coloration spéciale, d'autres (Colibacille, etc.) colorent Tartichaut en vert émeraude.
Les levures poussent également bien.
La coloration verte est due à une substance soluble dans Teau, insoluble dans l'alcool, Téther et le chloroforme ; elle rougit sous rinfluence des acides et redevient verte par l'adjonction d'un alcali.
6^ Fruits, Racines. — Différents fruits, des racines ont été directement employés comme milieux de culture. C'est ainsi que la carotte convient très bien à la végétation des streptocoques, du champignon du muguet (G. Roux). Les figues, les fraises, les abricots, les amandes ont été utilisés. On traitera les racines ou tubercules comme la pomme de terre ; on partagera aseptiquement les fruits avant de les placer dans un tube ou un petit cristallisoir.
7^ Milieu de Soyka. — Soyka a recommandé, pour ses cultures en vases clos, le mélange suivant, qui est un milieu mixte, en partie artificiel et en partie naturel (animal et végétal) :
Riz en poudre 10 grammes.
Lait 15 —
Bouillon neutre 5 ce.
Bien mélanger, et distribuer dans des cristallisoirs en verre. Stériliser en plusieurs temps, dans la vapeur, deux jours de suite. On obtient un milieu solide, blanc opaque.
B) Milieux artificiels
Pour les obtenir on solidifie un des milieux liquides artificiels déjà étudiés.
^ 1<» Gélatine. — La gélatine est, depuis les travaux de Koch, un des milieux les plus usités dans les laboratoires. On peut la définir en deux mots : du bouillon rendu solide par l'addi-
i02 MILIEUX DE CULTURE
lion d'une certaine quantité de gélatine. C'est un milieu très transparent. Son seul inconvénient est de fondre à une température relativement basse (+ 21<> à + 22**) ; seuls peuvent donc pousser sur la gélatine solide les* microbes qui végètent à cette température. C'est ainsi que le Pneumocoque, le Streptocoque pyogène ne végètent pas ou végètent mal sur la gélatine. Il faut des étuves spéciales pour les cultures sur gélatine en hiver et en été (voy. p. 131). Un des grands avantages de la gélatine, à ajouter à' sa transparence et sa malléabilité, est sa liquéfaction sous l'influence des diastases sécrétées par quelques microbes, lesquelles opèrent une véritable digestion de la gélatine (voy. p. 241).
Il faut employer de la gélatine répartie assez récemment en tubes ; si elle a eu le temps de se dessécher, la surface est absolument impropre à la végétation microbienne. On peut alors, pour régénérer la gélatine, ajouter au tube quelques gouttes de bouillon, fondre au bain-marie et laisser refroidir à nouveau. Comme tous les milieux solides, la gélatine est moins nutritive que le bouillon qui a servi à la fabriquer.
a. Gélatine-peptone. — La gélatine ordinaire est la gélatinepeptone. Nous supposons le bouillon peptoné, fabriqué comme il a été dit plus haut, neutre ou légèrement alcalin.
La gélatine est livrée dans le commerce sous forme de plaques minces (gélatine extra-fine). On les coupe avec des ciseaux en petits morceaux qu'on lave dans Teau distillée. On ajoute au bouillon 10 p. 100 de gélatine, soit 100 grammes pour un litre. Le mélange est fait dans un vase émaillé, une capsule de porcelaine ou tout autre récipient qu'on met chauffer dans un bain-marie à + 100^, pendant dix minutes environ, jusqu'à ce que la gélatine soit fondue en totalité. On remuera constamment. ^
Il faut ensuite neutraliser avec une solution de cirbonate de soude, car la gélatine acidifie souvent le bouillon. On prolonge l'ébullition quelques minutes après la neutralisation.
On ne dépassera jamais la température de -f 105® sous peine d'avoir une géhatine qui ne se solidifierait pas par le refroidissement.
Pendant qne la gélatine est encore très chaude, on la filtre sur papier Chardin, en ayant soin d'amorcer le filtre au préalable ; elle passe très claire et assez rapidement. Si la gélatine n'était pas suffisamment transparente, on lui ajouterait, à + 50<*
Fig. 70.
Entonuoir bain-marie pour filtrer la gélatine.
A, vue d'ensemble de l'appareil. — B, schéma de rentonooir*
environ, deux blancs d'œufs bien battus dans 50 centimètres cubes d'eau, et on reporterait à Tébullition ; l'albumine du blanc d'œuf en se coagulant clarifiera la gélatine. La filtration s'opère en général très bien dans un entonnoir de verre ordinaire ; si la gélatine se solidifiait avant la fin de l'opération, on placerait l'appareil quelques instants à l'autoclave sam pression. On peut même laisser la filtration se faire complètement dans l'autoclave ou dans un poêle de Koch.
On a imaginé un entonnoir bain-marie pour filtrer la gélatine.
Il est représenté «t schématisé dans la figure 70. C'est un entonnoir, à doubles parois métalliques, (a) contenant de l'eau qu'on verse en (d). Un bec de gaz chauffe continuellement le prolongement (6) pour maintenir l'eau chaude pendant toute la filtration. Un simple entonnoir en verre {e) avec papier Chardin est contenu dans Tentonnoir métallique et le dépasse inférieurement (c). Quel que soit le dispositif dont on se serve, on reçoit la gélatine dans un flacon stérilisé (pour contaminer le moins possible la gélatine qu'on ne peut stériliser à de hautes températures) et on la répartit de suite dans les tubes à essai bouchés à la ouate (fig. 7i). On chauffera au bain-marie ou à l'autoclave si la gélatine s'était solidifiée. On aura soin, en versant la gélatine dans les tubes, de ne pas en souiller la partie supérieure du tube sous peine d'avoir une adhérence du bouchon de ouate aux parois ; l'emploi du tube serait impossible.
On a imaginé un appareil compliqué et inutile (fig. 72) pour pouvoir distribuer la gélatine dans les tubes, au fur et à
Tubes de gélatine.
sirics."— ^^B'^Tube^urciU- mesure de sa filtration, à l'aide de la
lurc par piqûre. - C lube pjnce (f). pour culture par la méthode * ^' '
d'Esmarch. " Les tubes à essai remplis au i/4 de
leur hauteur avec la gélatine, et rebouchés à la ouate, doivent être aussitôt stérilisés. Ils seront exposés, deux jours de suite, pendant quinze à vingt minutes, à la chaleur humide de + 100° dans le poêle de Koch. ou l'autoclave fonctionnant .sans pression chauffage (discontinu ; voy. p. 48) le chauffage au-dessus de + 100° abaissant rapidement le point de fusion de la gélatine. Au sortir de la seconde stérilisation, une partie des tubes, destinée aux cultures en stries, sera inclinée pour que la gélatine se solidifie étalée comme dans le dessin de la figure 71 (A) avec une grande
surface libre ; une autre partie sera conservée verticale pour les cultures par piqûre {fig, 71, B). Il sera bon, pour éviter la dessiccation et la contamination du coton, d'envelopper la partie supérieure du tube d'un capuchon de caoutchouc stérilisé au sublimé, ou à son défaut d'un simple capuchon en papier (litre.
Fijf. 7i.
Appareil pour la filtration de la gélatine et sa distribution immédiate
dans des tubes.
Pour avoir des tubes prêts à être roulés par la méthode d'Esmarch (voy. p. 178), on distribuera de très faibles quantités de gélatine (1 ou 2 centimètres cubes) dans de larges tubes à essai de la dimension des tubes à pomme de terre (fig. 71, C).
b. Gélatines glycoséeSy lactosées, etc. — Pour avoir de la gélatine pepto-glycérinée ou glycosée, lactosée, pepto-glyco-glycérinée, etc., on emploiera des bouillons glycérines, etc., comme il a été dit plus haut, et on opérera comme ci-dessus.
Pour cultiver le Vibrion cholérique, Kahlinski se sert de bouillon de pancréas additionné de 50 p. 1000 de peptone et de 5 p. 1000 de sel marin, avec 100 p. 1000 de gélatine.
c. Gélatine phéniquée. — Elle a été imaginée par Chantrmessk et WiOAL pour isoler les colonies de B, coli et de B. d*Eberth de la plupart des microbes vulgaires des eaux, qui sont très souvent liquéfiants ; ces derniers ne poussent pas sw gélatine phéniquée. U suffit d'ajouter, avant la flltration. 4 ou 5 gouttes d'une solution phéniquée à 1/20 pour 10 centimètres cubes de gélatine.
d. Gélatine cTElsner. — La gélatine d'ELSNER (1895) est un mélange de gélatine, de décoction de pomme de terre et d'iodure de potassium. Elle sert à déceler le B. (VEberth dans les selles typhiques (voir Diagnostic de la fièvre typhoïde, p. 652), et à le distinguer du B. coli.
On prend 500 grammes de pommes de terre, qu'on pèle soigneusement, et qu'on râpe. On les fait macérer pendant trois ou quatre heures dans un litre d'eau. On tamise, et on laisse déposer pendant toute une nuit. On décante le liquide et on lui ajoute 150 à 250 grammes de gélatine. On fait dissoudre à feu doux. Ce milieu est très acide. On ajoute 20 à 30 centimètres cubes d'une solution de soude jusqu'à ce que la réaction devienne faiblement mais encore nettement acide. On filtre, on stérilise et on répartit en ballons de 100 grammes environ. Quand on veut se servir de cette gélatine, on ajoute à chaque ballon de 100 grammes 1 gramme d'iodure de potassium, et on le répartit en larges tubes à essai destinés à être roulés, d'après la méthode d'EsMARCH. Pour Grimbsrt, le milieu d'ELSNER devrait ses qualités à l'acidité de la gélatine.
Grimbert a modifié la technique de fabrication de la gélatine d'EIsner. Après macération, le liquide est filtré pour le débarrasser de l'amidon, puis porté à l'autoclave pendant 10 minutes pour coaguler les matières albuminoïdes. On filtre de nouveau, on ajoute 15 p. 100 de gélatine. L'acidité est alors titrée de façon que 10 centimètres cubes soient neutralisés par 4 à 5 centimètres cubes d'eau de chaux.
e. Gélatine de Piorkowsky. — On prend un litre d'urine,
émise depuis quarante-huit heures, ayant donc une réaction aloaline. On y fait dissoudre à chaud, 5 grammes de peptone et 33 grammes de gélatine. On refroidit à 55^. et on ajoute un blanc d'œuf battu dans 50 grammes d'eau. On stérilise à + 115<^. On répartit en tubes à essai. On peut stériliser à nouveau à + H0<>.
f. Raisin gélatine. — Le raisin gélatine est une décoction de 250 grammes de raisin sec dans un litre d'eau, avec 10 p. 100 de gélatine. Ce milieu a été utilisé pour cultiver les levures.
g. Gélatines colorées, — Les gélatines colorées sont constituées par de la gélatine peptone ordinaire additionnée de différents mélanges de substances colorantes. Les microbes, en se développant, produisent, sur ces milieux, des changements de coloration qui peuvent servir à la différenciation de l'espèce. Les gélatines colorées n'ont pas donné tous les résultats qu'on espérait à ce point de vue. Elles se décolorent spontanément à l'air si on tarde à les employer.
DucLAux avait déjà coloré du lait avec de la teinture de tournesol, pour savoir si ce liquide devenait acide ou restait alcafin sous l'influence de la végétation microbienne. Spina, dès 1887, avait montré qu'en colorant de la gélatine avec quelques gouttes d'une solution concentrée de sulfo-indigotate de soude ou de bleu de méthylène, on avait un milieu qui changeait de teinte suivant le microbe cultivé. C'est Ncbggerath (1888) qui fit la première application de ces faits pour le diagnostic des microbes en général et du B. typhique en particulier.
La gélatine de Nœggerath est assez ditticile à fabriquer. On mélange dans Tordre suivant des solutions aqueuses saturées de couleurs d'aniline :
Bleu de méthylène 2 centimètres cubes.
Violet (le gentiane : • * —
Vert de méthyle .' . 1 —
Chrysoïdine 4 —
Fuchsine 3 —
et on ajoute de l'eau distillée jusqu'à 200 centimètres cubes. Le liquide ainsi obtenu est brun, tirant sur le bleu, et colore le
papier à filtrer en gris foncé. On attend une quinzaine de jours : il se produit des changements de coloration qu'on corrige en ajoutant un peu de Tune ou de l'autre des couleurs ci-dessus de façon à revenir au bleu noirâtre. 11 faut 6 à 8 gouttes de cette solution pour colorer à point un tube ordinaire de gélatine. On ensemence par stries et on met à Fétuve. Chaque microbe fixe telle ou telle couleur qui imprègne la colonie ; autour de celle-ci est une zone décolorée qui peut s'étendre à tout le tube de gélatine. La culture de B, typhique est d'une belle teinte violet évêque.
Gasser (1890), n'ayant pas réussi en employant la gélatine de Nœggerath, colora simplement la gélatine avec quelques gouttes d'une solution de fuchsine. Il vit que le Colibacille et le Bacille d'Eberth sont les seuls microbes qui poussent en colonies rouges avec décoloration du milieu. On peut les distinguer. Le Colibacille décolore en trois jours et forme des colonies restant sur la strie d'ensemencement ; le B. d'Eberth met huit jours à décolorer, et ses colonies diffusent largement sur la gélatine.
Legrain (1891) a cultivé plusieurs microbes sur les milieux teints à la fuchsine.
WuRTz (1892), mettant à profit la remarque de Ghantembsse et WiDAL sur la mise en liberté d'acide succinique parle B, coli cultivé en bouillon lactose, a préconisé les milieux toumesolés qui ne changent pas de teinte sous l'influence du B, (TEberth et deviennent rouges avec le B. coli,
RA.MOND* fait remarquer qu'il faut une dose assez forte d'acide pour faire virer la teinture de tournesol ; il propose de la remplacer par la rubine acide, réactif très sensible de l'acidité. La gélatine, ou mieux la gélose, lactosée à 4 p. 100, est additionnée de quelques grains de rubine acide jusqu'à coloration rouge cerise. On porte ie tube à + 70" ou + 80<», et on ajoute deux gouttes de solution aqueuse saturée de carbonate de soude ; le milieu se décolore. On filtre et on stérilise. Ce milieu
* Ramoxi). Presse médicale, 1896, p. 395, et Soc. biol.. 7 novembre 1896. Voir aussi Robin, .Soc. biol., 1897, p. 49.
MILIEUX SOLIDES ARTIFICIELS i09
se colore en rouge, en quelques heures, sous rinfluence du B, coli, et reste incolore avec le B. d'Eberth.
^ 2<* Gtôlose. — 'La gélose, ou agar-agar^ a sur la gélatine le grand avantage de rester soliile' auxTempératures inférieures à + 10^. Elle peut donc être mise à l'ctuve aux mêmes températures que le bouillon. En outre, très peu de microbes liquéfient la gélose ; son inconvénient est d'être toujours plus ou moins louche. Son emploi en bactériologie date des travaux de KocH, en 1881.
L'agar-agar, ou varech corné, provient d'une algue des mers des Indes nommée Gelidium spiriforme (ordre des Floridées). La matière gélatineuse qu'on en retire a été étudiée, en 1859, par Paybn qui lui donna le nom de Gélose, C'est une substance amorphe, isomère de la cellulose, dure et cornée à l'état sec, se gonflant et se dissolvant dans l'eau bouillante. Elle se solidifie en gelée par le refroidissement. Elle solidifie cinq cents fois son poids d'eau, c'est-à-dire forme, à poids égal, dix fois plus de gelée que la meilleure gélatine. A elle seule la gélose serait très peu nutritive ; il faut lui incorporer du bouillon. On la trouve dans le commerce sous forme de longs filaments roulés en paquets.
MiQUEL a conseillé, en 1885, l'emploi de la mousse d'Irlande, gelée provenant du Chondrus crispus, algue également de l'ordre des Floridées, qu'on rencontre sur les côtes de l'Atlantique. Ce milieu a été peu employé.
a. Gélose-peptone . — Pour préparer la gélose-peptone, on se sert, comme pour la gélatine, de bouillon-peptoné et alcalinisé, qu'on solidifie avec la gelée d'agar-agar.
Deux procédés sont préconisés. Le premier est une modification de celui de Macé, recommandé par Thoixot etMAssRLix; le second est dû à Roux.
Premier procédé, — On fait digérer pendant vingt-quatre heures 10 à 15 grammes de gélose coupée en petits morceaux, dans un demi-litre d'eau acidulée à l'acide chlorhydrique à 0 p. 100 ; on remue à plusieurs reprises. On filtre sur un linge, on lave largement à l'eau distillée la gélose qui reste sur lé
iiJtre; ou lave enfin à la solution de carbonate de soude jusqu'à ce que Teau de lavage ne présente plus traces d^ acidité. L'algue gonflée qui est restée sur le filtre est alors ^ jetée dans 500 grammes de bouillon peptoné, neutre ou alcalin, sans dépôt, chauffé préalablement au bain-marie à TébuUition. On s'assure que le mélange est neutre (la gélose bouillant en milieu acide se transformerait en sucre) ; on agite constamment avec an agitateur en verre. Dix minutes d'ébullition suffisent en général à incorporer la gélose au bouillon. Quelques auteurs ajoutent alors 10 grammes d'une solution aqueuse concentrée de gomme arabique, pour faire adhérer plus intimement la gélose aux tubes à essai ; mais la gomme rend la gélose assez louche ; nous ne l'employons pas en général. La solution de gomme arabique doit être conservée neutre et stérile.
On filtre alors sur papier Chardin. Cette filtration doit se faire à chaud, plus nécesairement encore que pour la gélatine, car la gélose se solidifie vers + 50^. On opérera avec un des dispositifs décrits pour la gélatine, pages 103 et 105. Nous conseillons de faire cette filtration avec un simple entonnoir en verre., garni de papier filtre, introduit dans un flacon ; le tout sera placé dans le poêle de Koch, ou dans l'autoclave sans pression. On répartit alors en tubes à essai, en ayant soin de ne pas souiller de gélose la partie supérieure du tube qui touchera le tampon de ouate. La stérilisation se fera en portant, pendant quinze à vingt minutes, les tubes de gélose dans l'autoclave à -h H5^ ou par la méthode du chauffage discontinu comme pour la gélatine. Le chauffage à de hautes températures présente moins d'inconvénients pour la gélose que pour la gélatine ; nous conseillons l'autoclave.
Les tubes, une fois stérilisés, seront refroidis dans la position inclinée pour que la gélose pré.sente la surface nécessaire aux cultures par stries ; son peu de transparence rend la gélose impropre aux cultures par piqûre ; en raison de sa tempéra-
* Macè recommandait de maintenir pendant vingt-quatre heures Talgue gonflée dans 500 grammes d'eau additionnée de 25 grammes d ammoniaque, avant de la jeter dans le bouillon. Ce temps est inutile.
tuf e élevée de fusion, elle ne peut être enroulée en tubes d'Esmarch (les microbes de la semence seraient tués ou atténués).
Le tampon de ouate sera entouré de papier filtre ou d'un capucbon de caoutchouc lavé au sublimé, et le tube sera conservé dans une armoire après avoir été éprouvé vingt-quatre heures à Tétuve à -f* 38^. On aura soin de conserver les tubes verticaUmeniy car la gélose rend souvent une notable quantité d'eau (fig. 73) qui viendrait souiller le coton; après Tensemencement la même position verticale est de rigueur pour ne pas diluer les colonies. Cette précaution n'avait pas de raison d'être avec la gélatine.
Procédé de Roux. — Il diffère du précédent pour les premiers temps de l'opération.
A 1000 grammes de bouillon peptoné alcalinisé, on ajoute 15 grammes de gélose en morceaux ; on chauffe à + 100^ pendant une heure, en agitant; on tamise sur de la mousseline, on laisse refroidir à + S0<*, et on ajoute un blanc d'œuf. On mélange intimement, on réchauffe à -|- liO» pendant trois quarts d'heure, on filtre à chaud, etc.
Nous préférons le premier procédé de digestion à froid au procédé à chaud de Roux.
b. Géloses glycérinées, lactosées. — La gélose glycérinée est, depuis les travaux de Nocard
et Roux, en 1887, le milieu le plus employé pour la culture du Bacille de la tuberculose aviaire ou humaine . On se servira pour cela de bouillon glycérine à 5 p. iOO et on opérera comme ci-dessus. Il en sera de même pour les géloses glycosée, lactosée, glyco-glycériaée, etc. On prépare le milieu nutritif qu'on désire et on le solidifie avec la gélose.
La gélose glycérinée se dessèche moins que la gélose-peptone ordinaire.
c. Gélatine-gélose, — La gélatine gélose (Jensen) est un milieu où la solidification du bouillon est obtenue par un mélange de gélose et de gélatine. Les avantages de ce mélange sont les
Fig. 73.
Tube de gélose.
1, capuchon de caoutchouc. — 2, tampon de coton. — 3, ^loso. — 4, eau de condensation.
suivants : transparence , liquéfaction à basse température, mais au-dessus de + 30<). C'est donc un milieu clair malléable et moins liquéfiable que la gélatine ; il sera très utile en été. On prépare la gélatine comme il a été dit plus haut et on ajoute 1/2 p. 100 de gélose. Il faut veiller à ce que cette addition n'acidifîe pas la gélatine.
d. Gélose sanglante. — On puise aseptiquement du sang dans la veine céphalique de Thomme, dans Tartère fémorale du chien, dans la carotide du lapin, et on mélange à + 40^ à la gélose (1/3 de sang) (Bezançon et Griffon). On incline les tubes. On peut aussi (Pfeiffer) étaler simplement quelques gouttes de sang sur la surface de la gélose solide.
e. Géloses colorées. — Les géloses colorées se prépareront exactement comme les gélatines colorées (voy. p. 107). L'usage en est le même.
f. Gélose Wertheim. — Le milieu de Wertheim, pour cultiver le Gonocoque j est un mélange d'une partie de sérum humain ou de veau et de deux parties de gélose. Ajouter le sérum stérile à un tube de gélose qu'on fait liquifier; ajouter et laisser refroidir (voy. p. 771).
g. Gélose Chantemesse, — Pour T'isolement du B. d'Eberth. On fait bouillir 10 grammes de gélose dans 500 grammes d'eau peptonée à 3 p. 100 (peptone Defresne). On ajoute ensuite 10 grammes de lactose. On filtre sur papier, on stérilise à + 120«.
Au moment de s'en servir, on ajoute, par 10« du mélange, lY gouttes d'une solution phéniquée à 3 p. 100 et l"""" de teinture de tournesol bleue sensible.
Voir l'emploi, page 416.
h. Moushe d'Irlande. — La mousse d'Irlande se prépare comme il suit : d'après Miquel. 300 grammes d'algue sont mis ù digérer dans 10 litres d'eau bouillante ; on maintient l'ébullition pendant plusieurs heures, et on passe au tamis. Le liquide est de nouveau porté à l'ébullition, et filtré à chaud. La liqueur est évaporée au bain-marie, et on la laisse sécher dans des cuvettes de porcelaine. Ce résidu dur est ajouté au bouillon dans la proportion de 1 p. 100, pour faire une gelée nutritive.
qu'on stérilise à + 110<>. Le milieu ainsi obtenu ne fond qu'à 4- 550 à + 00".
En d890, PrcciNELLi a conseillé de mettre simplement 6 grammes de Fucus crispus dans 200 grammes de bouillie de viande neutralisée, et de placer le tout pendant une heure dans le stérilisateur à vapeur. Le liquide, filtré à chaud, se solidifie par le refroidissement.
i. Moût de bière agar, — Le moût de bière agar (parties égales de moût et d'eau avec 1,H p. 100 d'agar) sert surtout à cultiver les levures.
3<* Mie de pain. — La mie de pain a été utilisée, il y a quelques années, comme milieu de culture des champignons.
On peut se servir simplement de tranches de pain blanc, stérilisées à la chaleur sèche, et imbibées d'eau, de bouillon, de jus de prunes, do décoction d'engrais, etc. (Brkfkld).
Il est préférable de préparer de la poudre de pain. On émiette de la mie de pain blanc et on la laisse sécher à l'air. Lorsqu'elle est bien sèche, on la moud très finement dans un moulin à café. On met quelques grammes de cette poudre au fond d'un ballon, on ajoute deux fois et demie le poids d'eau et on stérilise à la vapeur pendant une demi-heure, deux fois, avec un jour d'intervalle.
4° Substances inertes imbibées de liquides nutritifs. —
On a imbibé de liquides nutritifs des substances solides inertes, telles que le sable ou le phUre.
SoYKA (1886) a cultivé le B. anthracis dans un « sol artificiel » composé de 25 grammes de sable stérilisé, imbibé de 2 à 4 centimètres cubes de bouillon peptoné. La formation des spores serait ainsi considérablement activée.
ExGKL, IIaxsex ont cultivé des levures sur du plâtre humide. On fabrique des blocs de plâtre, en forme de tronc de cône de 3 centimètres de hauteur, et on les place dans des cristallisoirs de verre contenant l^'",îi de hauteur d'eau stérilisée pour faire tremper la moitié du cône. Le cristallisoir est recouvert
PRÉCIS DE BACTÉRIOLOGIE, 2* édit. 8
et le tout stérilisé. La sporulation des levures s'opérerait très rapidement dans ces conditions.
Salomonsen a utilisé des cylindres de plâtre, moulés dans des tubes de verre, et stérilisés à l'étuve sèche à + liS^ dans une éprouvette bouchée à la ouate.
