lactis aerogenes

B. pyocyanique. . .

B. vert de l'eau. . . .

K. mesentericus vulg.

B. diphtérique . . .

Actinomyces bovis .

EabouilloB

Eb milieu de Cambier.

M. urex -|- » 60 heures + » 3 jours

B. de la diphtérie aviaire -j- » lâO » ^ v 4 m

B. subtilis — 4- » 3 »

On voit que la plus ou moins grande rapidité de passage peut être utilisée pour isoler telle espèce, surtout le B. dEberth, le B. coli, le V. cholérique,

P. Garxot et Garnier ont utilisé le même principe pour leurs cultures entubes desabU. La (figure i08) montre le dispositif. Un petit tube de verre en T, avec une branche fine (B), reçoit du liquide de culture {/) sur une hauteur de 0«",10 environ. On projette lentement dans celui-ci du sable de quartz très fin, purifié par un séjour de quarante-huit heures dans l'aide chlorhydrique, bien lavé pendant plusieurs jours et calciné au four. La couche de sable (s) charge la grosse branche (A) sur une hauteur dé 0",10. On stérilise à lautoclave. Un bourron de coton de verre (G) empêche le sable de gagner la petite branche. Il faut verser le sable lentement dans le liquide pour éviter les bulles d'air. On ensemence le bouillon de la petite branche et on attend que le bouillon qui surmonte le sable se trouble.

Le Vibrion cholérique, le B. dTEberth, le B. de la psittacose, les Colibacilles passent rapidement.

Fîg. 108.

Cultures en tube de sable (Car- NOT et Garnier).

^v 49 Isolement sur les milieux solides. — G'est la. méthode de KocH * ; c'est la plus couramment employée. Le principe est simple. Si on ensenie'nce de ta gélatine ou deTa gélatine-gélose à l'état liquide, de façon que les microbes soient uniformé-

• KocH. Zur Untersuchung ton pafhogenen Organismen, Mittheil. aus dem kaiserl. Gesundheimte. 1881.

ISOLEMENT DES AEROBIES

ment répartis dans le milieu, et qu'on fasse solidifier celui-ci en couche mince, chaque microbe donnera une colonie pure, végétant à la surface, complètement isolée des autres. On peut alors en prendre une parcelle et avoir une culture pure en tube de gélatine ou en ballon de bouillon. Les temps de Topération seront donc toujours les suivants : 1*» liquéfaction au bain-marie de la gélatine ou de la gélatine-gélose ; 2P ensemencement avec une très petite quantité du produit à analyser bactériologiquement; 3** agitation pour répartir uniformément les germes; 4® étalage du milieu en couche mince et refroidissement; 5<> prise aussi hâtive que possible de chaque colonie qui sera réensemencée.

Il est cependant des cas où on procède autrement ; on ensemence, par de nombreuses stries, un milieu déjà solidifié, sans recharger Taiguille de platine ou la pipette. L aiguille fait des stries de moins en moins contaminées et les dernières donnent des cultures pures; nous dirons deux mots de ce procédé.

Enfin nous renvoyons aux chapitres de V Analyse de Veau, de laiTy de la tetre pour la description des appareils spéciaux.

A. Cultures sur plaques de Koch. — La méthode primitive de Koch, étalant la gélatine sur des plaques, n'est presque plus

Fig. 109.

Plaques de Koch dans leur boîte en cuivre.

employée, en raison de foutillage compliqué et embarrassant qu'elle nécessite et de son peu de sécurité comme asepsie. Nous devons cependant la décrire ; elle a servi à isolerle Vibrion cholérique.

CCLTCRE KT IS0LEMB5T DES ABIOBIBS

yons supposons d'abord qu'on emploie la géUUme. 11 Ta sans dire qne ce milieu n'isolera que les microbes régétant à + 2^; c'est ainsi qu'on ne saurait obtenir des colonies de B. diphtérique, de B. de ia morve ^ de Pneumocoque, etc., sur gélatine. Cest son grand défaut.

L'outillage nécessaire est le suivant :

î^ Des plaques de yeire de vitre rectangulaires de 10 centi-

Fig. 110.

Triangle de bois à vis calantes pour les cultures sur plaques

de gélatine.

mètres de largeur sur 14 de longueur ; lavées comme il a été dit au chapitre u (p. 29), et stérilisées par la chaleur sèche dans la boîte de cuivre représentée figure 109 ;

2<* Trois tubes de gélatine stérilisée ;

3^ Un triangle de bois à vis calantes (Gg. 110) ;

4<* Une plaque de verre dépoli, large et épaisse ;

Fig. ill.

Pelils bancs en verre pour les cultures sur plaques de gélatine.

5° Un cristallisoir recouvert d'une plaque de verre très large ;

6^ Un niveau à bulle d'air ;

7° Une cloche en verre ;

8** Un second cristallisoir coifTé d'un couvercle en verre;

ISOLEMENT DES AEROBIES

90 De petits bancs en verre (fig. ili) ;

iO® Du papier filtre et une solution de sublimé ;

il*' Une aiguille de platine ou plusieurs pipettes.

On dispose (fig. 112) le triangle de bois (A) sur une table et on le recouvre de la plaque de verre dépoli (B) qui reçoit ellemême le premier cristallisoir (C). Ce dernier est rempli d'eau froide ou de glace, jusqu'au bord et recouvert par la plaque de

Fig. 112.

Dispositif pour le refroidissement des plaques de gélatine dans ane

situation horizontale.

verre large (D). Celle-ci est rendue horizontale dans toutes ses directions au moyen des vis calantes et du niveau à bulle d'air. L'horizontalité est indispensable pour l'étalement de la gélatine sur les plaques (F) ; l'eau froide est destinée à hâter la solidification de la gélatine. La cloche (E) est placée sur la lame de verre. Toutes ces opérations préliminaires sont bien plus commodes avec l'appareil perfectionné de Roux (fig. 113). C'est un tambour métallique supporté par des vis calantes, avec deux ajutages latéraux disposés de façon qu'une circulation d'eau puisse se faire à l'intérieur du tambour.

11 faut ensuite préparer le second cristallisoir (à couvercle) qui recevra les plaques solidifiées et constituera une chambre humide aseptique et antiseptique. Les deux parties ayant été soigneusement lavées, on place dans le fond du cristallisoir

174 crLTUttlL KT ISOLEMENT DES AÉROBIES

une reuiile de papier ftltre laillée en rond. On verse dans le crislallisoir quelques centiimèlr«& cubes d'une solution de sublimé à -^ qu'on promène contre les parois et qui restera en imbibant le papier ; on fait de même poiur la cloche qu'on vido compI<''tenH^ntet qu'on place sur le cristailisoir.

Fi|î. 113.

Tambour métallique réfrigérant de Roux, pour les cultures sur plaques de gélatine.

Trois bancs de verre trempent dans une solution de sublimé, ainsi que trois bandes de papier filtre, plus étroites que les bancs et numérotées 1, 2, 3.

Il vaudrait mieux st«*riliser toute cette verrerie à la chaleur sèche.

Tout étant ainsi préparé, on retire avec une pince flambée une des lames de verre de la boîte en cuivre (fig. 109) et on la dépose (F) sur la lame nivelée (D) sous la cloche (E) (fig. 112). On liquéfie ensuite trois tubes de gélatine, qu'on maintient dans un bain-uiarie à + 30<^ pendant tout le temps de l'opération. (Ne pas ensemencer de la gélatine trop chaude, qui tuerait les microbes introduits.) On ensemence le premier avec une très fine goutte de semence et on l'agite avec soin. On porte une goutte du premier dans le second, qu'on agite aussi. Une goutte du second ensemence le troisième, également agité pour bien répartir les microbes. Ces tubes sont numérotés 1, 2, 3. On prend alors le premier, on le débouche, on flambe l'orifice, et on le verse sur la plaque (F) en soulevant légèrement la cloche (E\ La gélatine ne doit pas atteindre les bords de la plaque. Dès que la solidification de celle-ci est complète

ISOLEMENT DES AEROBIES 175

on la dépose perpendiculairement sur un des petits bancs recouvert de la feuille de papier filtre 1, qu'on a placé dans le cristallisoir à cloche (chambre humide). On opère de même successivement pour les trois tubes de gélatine qui forment trois plaques superposées et numérotées dans la chambre humide (fig. 114) qu'on porte à + 21°.

L'opération est terminée. On n'a plus qu'à attendre le déve-

Fig. lU.

Cris iallisoir coniena,nt les plaques de gélatine ensemencée.

Il devrait contenir 3 plaques superposées au lieu de i. I^s baudos de papier devraien être numérotées.

loppement des colonies, qu'on ira puiser avec une aiguille de platine ou une pipette (quelquefois avec l'aide de la loupe si les colonies sont très rapprochées), pour les ensemencer en tubes. A ce moment, on s'aperçoit d'un nouvel inconvénient des cultures sur gélatine ; plusieurs colonies la liquéfient et peuvent envahir la plaque en une nuit; celle-ci est alors perdue, l'isolement des colonies n'existant plus. Nous verrons à propos des analyses d'eau (p. 400) comment on peut se préserver de l'envahissement des colonies liquéfiantes. Habituellement, les plaques 1 et 2 sont trop riches, les colonies sont trop rapprochées pour qu'on puisse les saisir isolément; la plaque 3, contenant naturellement beaucoup moins de germes (dilutions successives), sera habituellement la meilleure.

On aura avantage, en été, à se servir de gélatine-gélose au lieu de gélatine (voy. p. 111). La gélose ne peut être employée.

<:i:ltlhk et isolement des aérobies

n'étant liquide qu'à des températures qui tueraient ou tout au moins atténueraient les microbes ensemencés.

On peut conserver longtemps les plaques de gélatine fixées à la période de développement qu'on désire observer plus tard. On trempe la plaque dans une solution concentrée dalun pendant dix minutes. On lave plusieurs fois de suite pour enlever les traces d'alun et on laisse sécher. Tout développement microbien est arrêté.

B. Cultures sur plaques en boites de Pétri. — Nous avons

décrit les boîtes de Pétri (p. 27, fig. i8). Ce sont des cristalli-

Fig. ilâ.

Colonies sur gélatine en boîte de Pétr (voy. p. 640).

soirs minuscules, à couvercles, stérilisés, conservés dans leur enveloppe de papier stérilisé, et recevant directement la gélatine liquide ensemencée. Les bords du petit cristallisoir retenant la gélatine rendent inutiles les appareils compliqués destinés à maintenir Thorizontalité . Le procédé par boîtes de

ISOLEMENT DES AEKOBIES

Pétri a définitivement détrôné le procédé de Koch. La préparation des tubes de gélatine est la même que dans le procédé de Koch, mais chapun d'eux est versé dans une boîte de Pétri légèrement entr'ouverte. Une étiquette est collée sur chaque boîte. Les boîtes de Pélri peuvent être mises dans une chambre humide pour éviter la dessiccation de la gélatine, il sufiit de placer dans Tétuveun cristallisoir rempli d'eau. L'examen des colonies, leur prise se font d'après les principes généraux (fig. iir>).

^^ C. Cultures sur pl.\uues kx tubes de Roux. — Le tube de Roux est encore plus parfait que la boîte de Pétri, car il supprime toutes les chances de contamination du transvasement et permet donc la conservation à l'état de pureté des microbes à évolution lente. C'est un tube de verre long de 23 à 30 centimètres et large de 2 à 3 centimètres, sauf à la partie supérieure plus étroite (fig. 110). 11 est chargé d'une petite quantité de gélatine ou de gélatine-gélose, fermé à la ouate et stérilisé à l'autoclave (plusieurs séances sans pression). Au moment de l'utiliser, on fond la gélatine, on l'ensemence, on agile vivement, et on couche le tube sur le côté. La gélatine s'étend en plaques sans pouvoir pénétrer dans la partie étroite. Il est bon de coifTer le tube d'un capuchon de caoutchouc. On pourra naturellement faire des dilutions dans plusieurs tubes successifs.

Le procédé de Roux réduit l'opération à un seul temps, puisque c'est le tube même qui était versé sur la plaque ou en boîte de Pétri qui est couché et contient la plaque de gélatine.

Si on veut examiner à la loupe une colonie par sa surface libre, on coupe longitudinalemcnt le tube de verre parallèle-

PnÊCIS DE BACTÈRIOLOCIE, ^ cdit. 12

Fig. 116.

Tube de Roiupour cultures sur plaques de gélatine.

ment à la plaque de gélatine ; un des demi-cylindres contient la culture étalée.

La prise des colonies se fait comme dans un tube ordinaire.

L'inconvénient du tube de Roux réside dans la trop grande épaisseur de la gélatine au milieu de la plaque ; nombre de microbes sont inclus profondément.

On peut remplacer le tube par le flacon représenté (fig. 21] ; la gélatine s'étale en couche mince et égale.

D. Cultures, SUR plaques enroulées (méthode d'Esmarch*). — C'est le procédé de choix. La gélatine est enroulée le long des parois du tube. La couche de gélatine a ainsi une minceur très grande et uniforme.

Nous avons déjà parlé (p. 27) des tubes nécessaires à ce procédé et (p. 104, fig. 71) de la façon de les charger de gélatine. Il faut avoir de larges tubes à essai de la dimension des tubes à pomme de terre, mais sans étranglement. Ils sont stérilisés avec une très petite quantité de gélatine formant au fond un culot de 1 centimètre de hauteur au plus. On les liquéfie, on les ensemence, on fait une série de dilutions absolument comme dans les procédés précédents. La gélatine, une fois ensemencée et agitée, est enroulée. C'est là le point spécial de la technique. On bouche à la ouate, et on coiffe d'un large capuchon de caoutchouc. On couche alors le tube horizontalement en tenant chaque extrémité avec une main, et lorsque la gélatine n'est plus qu'à un centimètre ou deux du tampon, on imprime au tube un rapide mouvement de rotation sur son axe, de façon à enrouler la gélatine sur tout le pourtour des parois. Lorsqu'on voit que tous les points sont bien mouillés par la gélatine % on continue le mouvement de rotation sous un filet d'eau froide tombant d'un robinet sur le tube et s'éta-

• EsMARCH, Uber eine Modification des KocK sert Plattenverfahren; Zeitschrift fur Hygiène, 1H86.

' On peut s'aider de Taiguille de platine pour bien mouiller de gélatine toute la superficie du tube.

ISOLEMENT DES AEROBIES

lant sur lui. II faut porter alternativement toute la longueur tiu tube sous Teau froide et spécialement le fond du tube qui, au contact des doigts, se refroidit plus difficilement. Le capuchon de caoutchouc est indispensable pour empêcher le tampon de ouate d'être mouillé.

Jamais la gélatine ne doit toucher le tampon.

En quelques minutes la gélatine est solidifiée. Si Tenroulement est bien fait, la gélatine doit être répandue en couche si mince et si uniforme qu'elle est invisible. Le tube est étiqueté et porté à Fétuve.

On pourrait rouler, par la méthode d'Esmarch, les tubes de Roux précédemment décrits ; on serait plus sûr que la gélatine ne viendrait pas souiller la ouate.

L'examen des colonies (fig. 117), leur prise avec l'aiguille de platine ne présentent aucune difficulté avec la méthode d'Esmarch. On peut marquer d*un point à l'encre, sur la surface externe du tube, les colonies qu'on veut continuer à examiner; il n'en existe jamais deux superposées en épaisseur. L'inconvénient des cultures liquéfiantes subsiste naturellement comme dans toutes les cultures sur gélatine.

Fig. 117.

Tube d'Esmarch avec 3 colonies de Colibacille {a,a\à") etplusieurs petites colonies de microbes divers.

E, Cultures d'isolement par stries sur gélose. — On ne peut faire servir l'isolement par cultures sur gélatine à tous les besoins de la bactériologie . Le B, de Lôffler, le B. de la morve, le Pneumocope, et bien d'autres microbes, ne végètent pas aux températures inférieures à + 23<' où la gélatine reste solide. D'autre part, on ne peut ensemencer de la gélose à l'état liquide sous peine de tuer ou d'atténuer les germes de la semence, en raison de la haute température (+ 70<>) à laquelle se liquéfie ce milieu. On ne peut donc enrouler ou étaler de la gélose ensemencée. On se sert alors de la méthode suivante. On coule de la gélose dans une boîte de Pétri et on laisse

180 CULTURE ET LSOLEIIENT DES AEROBIES

refroidir. On fait alors, sur la surface de la gélose, avec l'anse de platine chargée de la semence, et promenée très légèrement, une série de stries disposées par exemple en quadrillage. L'anse de platine se dépouille des germes au fur et à mesure qu'on ressuie ainsi sur la gélose, et les dernières stries donneront des colonies suffisamment isolées.

On peut faire la même opération en faisant des stries succèssives sur plusieurs tubes ordinaires de gélose à surface oblique. Les derniers tubes ofTriront des colonies séparées.

On peut faire de même avec des tubes de sérum, ainsi que nous allons le voir.

Veillon épuise successivement la semence dans Teau de condensation de 3 ou 4 tubes de sérum ou de gélose, puis il incline les tubes pour que Teau ensemence la surface solide. La dilution favorise Tisolement des colonies.

V b^ Isolement par l'emploi de milieux spéciaux. — L'idéal ^ eh bactériologie, serait de posséder un milieu spécial à chaque espèce microbienne, permettant la végétation de ce microbe à Texclusion des autres. L'isolement serait alors facile. Si nous ne possédons pas de méthode générale aussi commode, nous savons cependant isoler certains microbes en nous servant de leur prédilection pour tel ou tel milieu ; pour certains même, la composition d'un milieu spécial est chose indispensable .

^ L'exemple le plus frappant de cette méthode est Tisolement du Bacille de Lôffler qui sert à faire le diagnostic bactériolo-

. ^ gique de la diphtérie (voir p. 631), et à obtenir, si on le désire, des cultures pures de ce bacille {voy. p. 611) Roux et Ykrsix

' recommandent l'ensemencement par stries sur des tubes de sérum gélifié (par la méthode que nous avons décrite page 92) avec une spatule de platine chargée d'une parcelle de fausse membrane. Le B. de Lôffler a la propriété de végéter beaucoup plus rapidement sur ce milieu que la très grande majorité des germes normaux de la bouche. On met les tubes à l'étuve à + 38<* et on les examine 15 à 20 heures plus tard (fig. 418). S'ils sont vierges de colonies, la fausse membrane ne contenait

ISOLEMENT DES ÂEUOBIBS

pas de B. de Lof fier ; s'il existe des colonies, on les examine,

on les réensemence.

C'est ainsi qu'on isole

facilement le microbe

de la diphtérie.

r Le Gonocoque pousse

1 volontiers la gélose de

j Wertheim(p. 112) ; son

i isolement s'elîectue-

1 ra de préférence sur

\£e milieu.

Le B. subtilis,\e Vibrion cholérique poussent en voile à la surface du bouillon : une parcelle de ce voile réensemencée aura des chances de donner une culture pure.

Le Vibrion cholérique pousse même en six à dix heures dans une simple solution salée de peptone (p. 89), c'est-à-dire avant le développement de la grande majorité des microbes des selles.

KocH a utilisé cette propriété pour faire rapidement le diagnostic du choléra et isoler son vibrion.

L'addition d'acide phénique (p. 106) à la gélatine empêche la pullulation des microbes liquéfiants des eaux, et permet la

Fijç. 118.

Isolement du B. de Lôffter sur sérum.

(Voy. p. 634).

182 CULTURE ET ISOLBUENT DBS AÉROBIES

culture sur plaques d'Esmarch du B. coli et du B. cTEberlh qu'elles peuvent contenir (Ghantemesse et Widal^).

La carotte est le milieu que préfère le champignon du Muguet (Roux et Linossier, Vellat^). Le Streptocoque 'pousse très vite sur les milieux au touraillon (G. Roux, Chatin^).

Le Bacille de la tuberculose, au sortir des ganglions du cobaye, doit être isolé sur sérum gélifié et ne pousse sur gélose glycérinée qu'après un accTimalément à ce milieu.

Le même bacille, contenu dans les épanchements pleuraux, végète directement si on Tensemence sur sang gélose (voy. p. 112).

Est-il besoin de rappeler la préférence qu'a YAspergillus niger pour le liquide de Raulin (p. 80), et sa sensibilité aux moindres modifications de ce liquide, même à celles aussi insensibles que l'exposition dans un vase d'argent? Mais nous entrerions dans le domaine des champignons.

* Chantbmbssb et Widal, Recherches sur le bacille typhique^ Ârch. de physiologie, 1887, p. 252.

■ Roux et LiNOssiBR, Arch. de médecine expérimentale, 1890. — Ybll^t. Thèse de Lyon, 1892.

* Roux, Soc. de Biologie, 1889. — Gratin. Thèse de Lyon, 1893.

La découverte des microbes anaérobies, faite parPASTKURS en 1861, fut une véritable révolution scientifique. On croyait jusqu'alors que tout être vivant avait besoin d'oxygène libre pour vivre et pulluler. Pasteur montra qu'à côté des microbes aérobies, c'est-à-dire exigeant pour vivre une grande quantité d'oxygène libre, il y avait des microbes anaérobies pour lesquels Foxygène est un véritable poison, microbes ne poussant que dans un milieu complètement dépourvu de ce gaz. Les premiers anaérobies connus furent le Vibrion butyrique et celui du lactate de chaux. Pasteur décrivit aussi des microbes facultatifs pouvant indifféremment végéter à Tair libre ou dans une atmosphère privée d'oxygène.

Presque tous les microbes aréobies sont facultatifs. Voici un tableau comprenant les nomenclatures des principaux types de ces trois classes de microbes :

M. AÉROBIES

^ B. anthracis.

vB. de la morve,

etc.