partie de la portion large de la pipette. Puisage dans

On ouvre et on flambe une nouvelle pipette une pipette, vide (B) qu'on tient à la bouche; on enlève le tampon de ouale de la pipette chargée de semence (A), et on le jette. On flambe alors avec grand soin l'orifice de la pipette

chargée, tenue presque horizontalement avec la main gauche; puis saisissant la pipette vide avec la main droite, on la flambe rapidement une dernière fois, et on la plonge dans le liquide de semence (fig. 97). On aspire avec la bouche, on pose dans un verre à pied la pipette primitive (pour ne pas souiller la table), et on saisit de la main gauche le ballon de bouillon à ensemencer. On opère alors comme il a été dit plus haut.

L'aiguille de platine pourrait remplacer la seconde pipette si on ne désirait pas puiser une notable quantité de semence.

2^ Cultures liquides en sacs de collodion. — Les cultures n sac de collodion, imaginées à l'Institut Pasteur, ont pour but de faire végéter le microbe dans Te sac peritonéal d'un animal vivant. Le microbe se trouve à l'intérieur d'un sac de collodion absolument clos ; ce dernier est introduit, aussi aseptiquement que possible, dans le péritoine d'un animal, et la plaie est refermée. L*animal supporte bien ce corps étranger et ne présente aucune atteinte à sa santé, si le microbe contenu est inofTensif. Les échanges se font à travers la membrane de collodion, sans que le microbe puisse sortir ni les leucocytes entrer. Il y a filtration pour les corps solides, et dialyse pour les liquides. Le microbe végète donc, en réalité, dans le suc peritonéal, à l'abri des phagocytes ; il fabrique ses produits solubles qui sortent du sac et se répandent dans l'organisme. C'est en somme, une culture m n'vo, avec une barrière empêchant le microbe soit de se répandre dans l'organisme soit d'être attaqué par les cellules de celui-ci.

Cette méthode a son origine dans les travaux de .Vaillard qui entourait les spores tétaniques de papier à filtrer, avant de les inoculer, pour les mettre à Tabri des phagocytes et leur permettre d'engendrer ainsi le tétanos, sans le secours d'associations microbiennes. Les sacs de collodion ont été employés, tantôt pour obtenir des cultures, impossibles par d'autres moyens {Péripiieumonie du bœuf y Nocard et Roux, 1898), tantôt pour relever la virulence d'un microBe (V. du cfiolcra, Metch- NiKOFF, Roux et Taurelli-Salimbem), tantôt pour modifier les propriétés d'un microbe, l'acclimater à un milieu [B. tubercu-

CULTURE DES AEROBIES i51

letLCy Nocahd), tantôt pour modifier Torganisme animal récepteur.

On admet, en général, que la membrane de collodion se comporte comme un filtre parfait, c'est-à-dire qu'elle permet l'entrée des substances solubles de l'organisme dans le sac et la sortie du sac des toxines microbiennes. Hodet et Guechoff ont vu qu'il n'en était rien. Toutes les substances solubles ne pénètrent pas également dans les sacs et les toxines contenues (la toxine diphtérique entre autres) en sortent parfois assez lentement pour ne pas produire leurs effets. L'animal peut, par exemple, être vacciné au lieu d'Otre intoxiqué. En somme : le sac de collodion est relativement peu perméable ; des expériences négatives réalisées avec lui n'ont aucune .signification. Gela n'empêche pas les résultats positifs d'être très appréciables. 11 ne faut demander à cette excellente méthode que ce qu'elle peut donner.

On se contentait, au début, de faire des sacs en moulant du collodion autour d'un agitateur en verre. On obtenait ainsi, avec un peu d'habitude, de petits boyaux de collodion, fermés à une extrémité, ouverts à l'autre. Ils étaient alors stérilisés. L'ensemencement une fois pratiqué, on obturait l'ouverture en la liant et en ajoutant un peu de collodion. Ces sacs étaient friables, s'aplatissaient, étaient difficiles à manier ; en outre, une fois enkystés dans le péritoine, ils étaient presque impossibles à enlever, sans se crever ; aussi a-t-on modifié la fabrication du sac en le moulant autour d'un support en verre qui reste à demeure.

Voici comment nous conseillons l'opérer. On se procure de l'excellent collodion riciné. On a une provision de tubes en verre perforés, de la dimension reproduite figure 98, A : ils serviront de tuteurs aux sacs de collodion. On prend un tube à essai ordinaire de diamètre un peu supérieur à celui du tuteur (A), et on le nettoie avec soin. On le plonge successivement et à plusieurs reprises dans le collodion. On place le tube verticalement et on laisse s'écouler l'excès de liquide. On laisse sécher, en ayant soin que le tube ne touche aucun objet. On décolle alors avec l'ongle le sac obtenu, et on l'a-

daple au tuteur (A). On le fixe au goulot par plusieurs tours de fil fin (fig. 98, B) qu'on recouvre d'une légère couche de col- Jodion. I/appareil est bouché à la ouate et stérilisé à Tautoclave. Quand on veut l'utiliser, on le remplit du liquide ense-

Fig. 98.

Sacs de collodion.

A. Tuteur en verre. — B, Le môme avec son sac de collodion. — C, Le môme, rempli et fermé, prêt à ôtre introduit dans le péritoine.

mencé avec une pipette et on ferme le goulot à la lampe (fig. 98, C). C'est ainsi que le sac est introduit, aussi aseptiquement que possible, dans le péritoine d'un animal quelconque : vache, chien, lapin, cobaye. 11 est admirablement toléré. Il s'enkyste, au bout d'un certain temps, dans des fausses membranes qui rendent son extraction parfois assez délicate. Nous préférons le collodion riciné au collodion élastique ordinaire. L'aspect du sac est plus blanchâtre, moins transparent, mais l'élasticité est plus grande ; il se déchire plus rarement, surtout pendant la stérilisation à l'autoclave.

CULTURE DES AEROBIES

La difficulté d'extraire aseptiquement le sac du péritoine, après son enkyst^ment, l'intérêt qu'il y aurait à puiser journellement le liquide du sac sans Textraire, ont conduit D/ouNKOwsKY a imaginer des dispositifs restant en communication avec l'extérieur. Voici le plus intéressant (fig. 99) .

Un tube de verre est fermé à une extrémité par une pellicule de collodion (a), tandis que son goulot donne passage à deux tubes plus petits {d) et (e), serrés par un ajutage (^). Le tube {e) sert au remplissage, et soutient l'appareil par les deux fils (f, f) fixés dans la plaie. Le tube (d) est une pipette plongeante, se continuant par un tube de caoutchouc (6) et un tube de verre (c). Ce dernier tub^ (e) sort de fabdomen par la plaie et permet de prélever ou d'ajouter du liquide dans le sac, sans faire de nouvelle laparotomie.

Fig. 99.

Dispositif de Djounkowsky.

3^ Cultures sur milieux solides. — Nous supposons qu'on veuille cultiver sur un milieu solide une parcelle de culture

solide ou une goutte de culture liquide. L'aiguille de platine sera seule employée. On se servira des tubes chargés de gélatine, de gélose, de sérum gélifié, de pomme de terre, etc., préparés et éprouvés à Vétave comme il a été dit plus haut (ch. m). On s'assurera que la surface des milieux n'est pas trop desséchée, qu'elle ne se fend pas sous l'action de la piqûre. Nous avons dit comment on régénérait un tube trop sec (p. i02).

On commence par enlever le capuchon de caoutchouc, et on

154 CULTURE ET ISOLEMENT DBS AÉROBIES

le dépose dans un crislallisoir ou un verre à pied rempli d'une solution de sublimé à 1/1000; on s'assure ensuite, en les retirant à moitié, que les tampons de ouate n'adhèrent pas aux parois du tube. Les tubes de gélatine peuvent être couchés horizontalement sur une table, les tubes de gélose» sérum, pomme de terre, contenant souvent de Teau à leur partie déclive, devront être maintenus presque verticalement.

Pour puiser la semence avec une aiguille de platine dans une culture liquide, on opère exactement comme il a été dit plus haut, il suffit de tremper une fois Taiguilie dans le liquide. I^ prise d une parcelle de culture solide n'en diffère pas essentiellement. On se servira de Taiguille droite ou à boucle, suivant les cas. L'aiguille chargée est prise par son manche entre les deux premiers doigts de la main droite (ou portée aux lèvres) pendant que les deux derniers débouchent le tube à ensemencer maintenu par la main gauche. La pince tenant le tampon de ouate passe dans deux doigts de la main gauche, el la main droite devient libre pour manier l'aiguille de platine. Le tube est incliné aussi horizontalement que possible, flambé à son orifice et l'aiguille introduite va déposer la semence.

On appelle culture par stries le procédé qui consiste à tracer longitudinalement sur la surface du milieu solide un sillon ou une série de sillons parallèles; le microbe se développera eu colonies superficielles le long des sillons. La culture par stries est la seule employée sur les milieux opaques ou peu transparents : pomme de terre, sérums, œufs, gélose. Elle se fait sur les tubes obliques (voy. p. 96, 104, 111).

Sur la gélatine, on pratique concurremment l'ensemencement par piqûre, pour, observer, par transparence, les caractères des colonies développées dans le sillon profond au sein de la gélatine. On emploie alors des tubes solidifiés dans la position verticale {lubes droits); le tube de gélatine peut être complètement renversé pendant l'ensemencement (fig. 100), pour éviter les germes de Tair. Cette position n'est pas pos.sible pour les autres milieux solides dont l'eau de condensation balayerait la surface.

Lorsqu'on ensemence un tube de pomme de terre, il estpru-

CULTURE DES AEROBIES

dent de remarquer la face utilisée : certains microbes, tels que le B. typhiqiie, donnent des cultures tellement minces qu'on hésite souvent à les découvrir.

Les tubes sont ensuite ilambés à Torifice, rebouchés avec leur tampon et leur capuchon de caoutchouc.

On colle une étiquette à la partie supérieure de chacun d'eux avec toutes les indications nécessaires (voy. p. 147) et on les place à la température convenable. La gélose, le sérum, la pomme de terre seront mis à Tétuve à + 38<*; la gélatine sera laissée dans un placard du laboratoire ou mise dans une étuve à "f 22** indispensable en hiver, souvent utile en été (étuve à refroidissement; voy. ch. IV p. 131)*

Si Ton porte directement une parcelle de culture solide sur un milieu solide avec Taiguille de platine, il arrive souvent qu'on fait une irainée apparente qui gène l'observation du développement. Cela est très net par exemple avec les cultures de bacille de la tuberculose. Il vaut mieux, dans ces cas, faire une dilution dans un ballon de bouillon, et ensemencer une goutte de ce mélange.

Lorsqu'on voudra ensemencer sur milieux solides des liquides recueillis aseptiquement sur un animal vivant ou autopsié, on fera exactement comme il a été dit pour les cultures liquides (p. i48). On promènera la pipette (à extrémité très effilée) ou l'aiguille de platine ayant plongé dans la pipette primitive à la surface du milieu solide.

L'ensemencement de la pomme de terre stérilisée et déposée dans un cristallisoir (p. 98) demande quelques détails complé-

Fi^'. iOO.

Ensemencement de la gélatine par piqûre.

mentaires, bien que ce procédé ne soit presque plus employé.

Si le cristallisoir n'a pas d*ouverturc latérale : on soulève obliquement le couvercle, aussi peu que possible, et on introduit l'extrémité de l'aiguille ou de la pipette qui ira strier la surface de la pomme de terre.

Si le cristallisoir a une ouverture latérale (fig. 67), on enlève le tampon de ouate, on ensemence en faisant passer l'aiguille à travers l'orifice, on flambe le tampon et on rebouche.

L'étiquette collée, le cristallisoir est mis à l'étuve à + 38<».

Tous ces principes techniques seront naturellement modifiés dans les détails suivant les cas particuliers: mais les grandes indications subsisteront : transporter aseptiquement la semence d'une culture ou d'un produit pathologique dans un milieu neuf.

4P Cultures sous le microscope. — Le procédé des entres sous le microscope a permis à Koch d'observer le cycle complet de la Bactéridie charbonneuse et de découvrir sa sporulation. Il est indispensable pour étudier le développement d'un microorganisme. Le problème est le suivant : faire végéter un microbe sous le microscope, en couche liquide assez mince pour qu'on puisse observer d'une façon continue les modifications qui se produisent. Koch employait primitivement le procédé de la goutte suspendue; on se sert aujourd'hui d'une chambre humide (cultures en cellules).

Nous disons une fois pour toutes que les petits appareils que nous allons décrire devront être soigneusement stérilisés, puisqu'ils constitueront en somme des récipients à culture. Nous ne traitons ici que des aréobies, il faudra donc toujours conserver dans la cellule une quantité d'air suffisante pour la végétation microbienne; il conviendra enfin de chauffer la cellule à la température eugénésique exigée par certains microbes.

Les lamelles couvre-objets seront lavées dans l'acide chlorhydrique, dans l'alcool puis dans l'eau distillée, séchées, et déposées dans de petits cristallisoirs en verre de Bohême qu'on enveloppe de papier et qu'on stérilise à -j- 150^ comme des boîtes de Pétri (voy. p. 39). Les lamelles ne seront extraites

CULTURE DES AÉROBIES 157

qu au moment d'être utilisées; on les passera rapidement dans la flamme pour plus de sûreté.

Les lames et autres pièces seront traitées de même, et directement stérilisées à la chaleur sèche à + 150** dans du papier filtre ou dans un cristallisoir bouché. Ou préparera toujours plusieurs lames en cas de contamination accidentelle.

Le milieu nutritif ne sera pas trop ancien.

Il ne faut pas ensemencer trop abondamment; trois ou quatre microbes seulement doivent, au début, occuper le champ du microscope. Pour cela on aura soin d'ensemencer la cellule avec une dilution de la culture mère. On en met une goutte dans un ballon de bouillon qu'on agite pour bien mélanger; une goutte de ce ballon est portée dans un second et une goutte du second dans un troisième ; c'est avec cette troisième dilution qu'on ensemence la cellule.

a. Goutte suspendue. — Le procédé de la goutte suspendue (Koch) exige une lame creuse. C'est une lame semblable aux

Fig. 101.

Culture en goutte suspendue.

A, b, lame creuse. — C, lame, lamcUc et goulle suspendue.

lames ordinaires pour préparations microscopiques, mais présentant à son centre une dépression circulaire de 15 millimètres de diamètre environ (fig. 101, A, 6). On dépose une goutte de la culture à observer, ou une goutte de bouillon récemment ensemencé, sur une lamelle qu'on renverse sur la partie excavée préalablement entourée de vaseline; la goutte reste sus-

pendue dans latmosphère de la cavité de la lame (fig. 101, C). Les bords de la lamelle sont lûtes extérieurement avec de la vaseline pour empêcher Tair de pénétrer dans la cellule. La goutte ne doit pas naturellement s'étendre jusqu'aux bords de la cellule, car elle disparaîtrait par capillarité entre la lame et la lamelle.

La lame ainsi préparée est fixée sur la platine du microscope qui est mis au point pour Texamen à un fort grossissement.

b. Chambre humide de BœUcher. — La chambre humide de BcETTCHER (fig. 102, A et B) est une lame à laquelle est fixée un

anneau de verre de 2o milli-

mètres de diamètre » au moyen d'une substance adhésive résistant à + 150® (solution de gélatine dans l'acide acétique avec bichromate de potasse finement pulvérisé au moment ^^S' ^02. de s'en servir : Hansen^. Une

Chambre humide de Bcettcher. lamelle est superposée, adhérant au moyen de la vaseline.

Hansen a employé ce dispositif pour étudier le développement de colonies de levures végétant sur une plaque de gélatine étendue sur la lamelle. On met un peu d'eau distillée au fond de la cellule.

La goutte suspendue a le grand défaut d'avoir une épaisseur trop considérable et inégale; les microbes peuvent se déplacer pendant Texamen. La petite plaque de gélatine ne peut remplacer les milieux liquides; il faut donc employer des dispositifs plus perfectionnés. On pourrait à la rigueur écraser simplement la goutte de culture entre une lame ordinaire et une lamelle, ou ajouter un fragment de lamelle qui adhérerait à la face inlërieure de la goutte suspendue; mais ce sont là des procédés bien imparfaits.

c. Chambre humide de Hanvier. — La chambre humide de Ranvier est une lame de verre creusée à son centre d'une rainure profonde circulaire, circonscrivant un disque rond dont

CULTURE DES AÉROBIES 159

la surface plane est inférieure d'un dixième de millimètre à celle de la lame (fig. 103, Â, B). La goutte de culture est placée sur cette petite plàte-forme; les bords sont enduits de vaseline.

Fiff. 103.

Chambre humide de Ranvier.

A. b, lame. — C, lame, lamoile et goutte écrasée, entourée de la chambre à air.

On applique une lamelle en appuyant un peu, et la goutte est écrasée entre les surfaces planes parallèles, allant par ses bords jusqu'à la chambre à air constituée parla rainure (fig. 103, C). d. Chambre humide de de Bary et Geissler, — La chambre humide de de Bary et Geissler a permis à Brepeld de suivre le cycle entier du développement duBaci7/u«su6^t7tô. Cet appareil

Fig. lOi.

Chambre humide de de Bart et Geissler.

est cher et fragile. Il consiste en un tube de verre de 20 centimètres de longueur, dilaté dans sa partie médiane en une cellule ronde, aplatie, de 2 millimètres de hauteur, dont les parois ont répaisseur d'une lamelle (fig. 104). Les deux extrémités sont bouchées à la ouate et le tout est stérilisé à + 150^. On ensemence un ballon de bouillon avec la dilution voulue de semence et on aspire en plongeant dans le liquide un des bouts du tube privé de son tampon. Quand la cellule est pleine,

160 CULTURE BT ISOLEMENT DBS AEROBIES

on laisse tomber au dehors le liquide aspiré, od remet le tampon de oaate, et on obture les deux bouts avec de la cire à cacheter. La paroi interne de la cellule est ainsi tapissée d'une pellicule de bouillon ensemencé, suffisamment mince pour que les microbes restent immobiles. Les deux extrémités du tube sont ensuite fixées sur une lame qui est portée sur la platine du microscope.

e. Chambres humides improvisées. — Il faut pouvoir improviser des chambres humides.

BrcHXER cultivait leBacUlus anthrtu^is entre une lame et une lamelle maintenues à une distance suffisante Tune de l'autre par des morceaux de lamelles brisées; il luttait avec de la vaseline.

Salomonsex découpe un orifice carré dans un morceau de carton épais, le fait stériliser dans Tautoclave et l'interpose entre la lame et la lamelle. Imbibé ensuite d'eau stérilisée, ce carton sert encore à maintenir Thumidité.

f. Platines chauffantes, chambres chaudes. — 11 importe de hâter le développement des microbes en plaçant la chambre humide à une température eugénésique. On peut porter la chambre dans Tétuve à + 38** entre les examens microscopiques. Mais il est difficile de remettre ensuite la préparation exactement au même point qu'auparavant sous le microscope. On peut cependant y arriver au moyen de l'artifice suivant dû à HoFMAXN. On trace de chaque côté de l'orifice de la platine du microscope une croix, droite d'un côté+, oblique de Tautre X ; lorsque le point intéressant est bien au centre du champ du microscope, on fait à Tencre, sur la lame, deux croix exactement superposées aux deux premières; elles serviront de points de repère très exacts.

Il vaut mieux employer la platine chauffante qui permet d'examiner, sans la transporter, une culture^végétant à température fixe, et de dessiner à la chambre claire les différentes phases de développement d'un même point.

La platine cftauffante de Ramier reliée à une étuve suffit: nous préférons cependant la platine chauffante de Reichert, modifiéecomme il va être dit (fig. 105). La pièce (A) àfixersurle microscope (B) est une chambre chaude très mince, munie d'un

CULTURE DES AEROKIES

thermomètre (G) incrusté dans la paroi et d'un orifice central avec condensateur Abbe (D)(voy. p. 250). Aux deux extrémités latérales sont deux tubulures sur lesquelles s'adaptent deux tubes de caoutchouc. L'un d'eux (E) se termine par un isUnipI'^

Platine chauffante de Reichert modifiée par radjonction d'une petite étuve d*Ar8onval.

embout métallique, l'autre (F) par une pièce métallique en deux morceaux vissés l'un à l'autre. L'eau circule dans la chambre prise dans un réser\'oir par la pièce en deux morceaux et s'écoule par l'autre tube dans un réservoir situé plus bas, après aspiration. Une pince (G) règle le débit. Dans l'appareil de Reichert, l'eau est chauffée par un bec de gaz dans un tube métallique en spire. Le réglage est bien difficile: Nous*

PRÉCIS DE BACTÉRIOLOGIE, 2* édit. U

mi CILTIRE ET ISOLEMENT DES AEROBIES

avons fait construire une toute petite étuve d'Arsonval (H), munie d'un régulateur; nous remplissons d'eau la cavité centrale; nous faisons pénétrer le tube aspirateur de Reichert par un des orifices du couvercle; il entraine ainsi de Teau à une température fixe (flg. 105). Cette petite étuve peut aussi servir à chauffer la platine de Ranvier par deux tubulures latérales (I et 1') communiquant avec la cavité centrale. La préparation est déposée sur les platines chauffantes.

Fig. iOG.

Chambre chaude de Yignal.

La chambre chaude de Vignal(C\g. 106) est elle-même une petite étuve d'Arsonval dont la forme seule est modifiée. La préparation est introduite dans la cavité de Tétuve par la porte (B). On peut se servir du condensateur Abbe, ce qui est impossible avec la platine de Ranvier.

ISOLEMENT DES AEROBIES 163

Nous employons maintenant une chambre chaude, à vaseline, chauffée et réglée à rélectricité, construite par Maury, de Lyon.

On verra, page 209, quels sont les dispositifs employés pour cultiver les anaérobies sous le microscope.

On peut avoir intérêt à compter les microbes d'un volume donné de culture. La meilleure méthode est celle de Klein. On colore un volume connu avec une solution alcoolique de violet de gentiane; on prend une goutte qu'on étale sur une lamelle de surface connue et on compte 50 champs de microscope. On fait le calcul proportionnel.

§ 2. — Isolement des aérobies

Nous étudierons plus tard les méthodes spéciales à Tisolement des aérobies de l'eau, de l'air, de la terre, etc. (ch. xiv, xv et xvi). Nous ne voulons traiter ici que des grands principes généraux qui doiventguider l'expérimentateur dans Tisolement des aérobies, c'est-à-dire dans la façon d'obtenir une culture pure d'un microbe aérobie ^uT'est mélangé avec cTâutres j espèces bactériennes. Cet isolement s'obtient à l'aide de deux méthodes principales : par culture directe ou par culture des produits pathologiques d'un animal inoculé avec le mélange microbien. Dans le premier cas, la séparation est toute mécanique; dans le second, la séparation se fait par sélection; l'organisme animal ne se laisse envahir que par l'espèce qui lui est pathogène, et la livre à l'état de pureté. La méthode par culture directe a naturellement besoin d'artifices pour arriver à l'isolement des aérobies : dilution, étalement de la gélatine sur plaques, addition d'antiseptiques, chauffage, exposition à des températures dysgénésiques, emploi de milieux spécialement favorables à telle espèce, prise de la semence après un court espace de temps, etc. Nous allons étudier successivement ces différents procédés.

1^ Isolement par la température ambiante. — La température peut être employée soit très élevée, soit très basse.

A. IsoLEXKitiT PAR DES TEMPÉRATURES ÉLEVÉES. — Ces températures seront mortelles ou simplement dysgénésiques pour les autres germes.

a. Températures tuant les autres germes. — On chauffe la semence à une température suffisante pour tuer tous les germes autres que celui qu'on désire cultiver. Cette méthode ne s'adresse naturellement qu'aux microbes très résistants, se reproduisant par sporulation ; on sait que la plupart des spores résistent à des températures supérieures à + 100«. Une des spores les plus résistantes est celle du Bacille de la pomme de terre {bacillus mesentericus) qui n'est pas toujours tuée par un chauffage à + 130«; aussi voit-on fréquemment les fragments de pommes de terre, quoique stérilisés, se recouvrir d'une pellicule plissée qui n'est autre qu'une culture de Bacillus mesentericus. La stérilisation, ayant tué tous les autres germes, avait isolé ce microbe à l'état de pureté.

On savait depuis longtemps que plusieurs liquides organiques, bien que soumis à l'ébuUition et maintenus à l'abri des germes de l'air, arrivent à être souillés par des végétations microbiennes. C'est Cohn qui montra le premier, en 1876, par une expérience faite sur l'infusion de foin, que ces cultures sont composées de microbes à spores très résistantes et spécialement de Bacillus subtilis. Brefeld a d'ailleurs vu directement sous le microscope les spores germer après ébullition. C'est en échouant dans la stérilisation des infusions de foin par la simple ébullition que Tynuall a dû imaginer la stérilisation par chauffage discontinu pour se débarrasser des germes provenant des spores du B. subtilis (voir p. 48).

Pasteur a directement appliqué le principe du chauffage à l'isolement des anaérobies et particulièrement du Vibrion septique (voir ch. vi, p. 211). En 1879, Miqurl a isolé le Bacillus ureœ en chauffant, à + 80<> et + 90o pendant deux heures, de l'urine putréfiée ou de l'eau d'égout.

Citons un exemple avec détails. On veut obtenir une culture pure de Bacillus subtilis (espèce d'ailleurs mal définie et comprenant nombre de variétés). On met une poignée de foin dans de l'eau maintenue pendant plusieurs heures entre -(- 30> et + 40o,

ISOLEMENT DES AÉROBIES 165

On obtient une infusion rouge ; on la dilue jusqu'à coloration jaune d'or, on la filtre sur mousseline, on la neutralise avec du carbonate de soude. On répartit le liquide dans plusieurs ballons qu'on fait bouillir pendant dix minutes et qu'on reporte à l'étuve à + 38**. Au bout de quarante-huit heures plusieurs ballons seront recouverts d'une pellicule résistante composée de Bacillus subtilis à l'état de pureté.

Il va sans dire que ce procédé d'isolement ne peut être utilisé lorsqu'il existe un mélange de plusieurs microbes à spores résistantes. Il est peu employé pour l'isolement des aérobies ; il est très recommandé au contraire pour isoler les anaérobies.

b. Températures dysgénésiques pour les autres germes, — On se sert bien plus souvent de la chaleur, pour isoler les aérobies, en cultivant le mélange microbien à une température dysgénésique pour la plupart deB espèces. Tous les microbes, en effet, ne poussent pas dans les mêmes limites de température. La végétation cesse en général vers -|- 40<^, mais certains d'entre eux se cultivent encore bien au-dessus de cette température : B. de la tuberculose aviaire, B. coli,B,d^Ebertk; eic. Il suffira alors d'ensemencer un ballon de bouillon avec le mélange contenant un de ces microbes, et de le placer dans une étuve à + ^^^> -^S», 44<> ; le bouillon se troublera et fournira seulement les espèces poussant à cette température .

RoDET ' s'est servi de cette méthode pour isoler des eaux le B, coli ou le B. d'Ehertk. Ces deux microbes poussent à + 44*»,5. On ensemence du bouillon, et on le dépose dans une étuve réglée spécialement à cette température. S'il ne se produit aucun trouble au bout de quarante-huit heures, on peut affirmer que l'eau ne contenait ni B. coli ni B. d*Eberth; si les ballons se sont troublés, on a presque sûrement affaire à l'un de ces deux microbes. L'analyse, terminée dans le premier cas en quarante-huit heures, est bien simplifiée dans le second.

* HooET, Importance de la température pour la détermination du Bacille typhique. Soc. Biologie, 29 juin 1889.

i(>6 CL'LTL'RB ET ISOLEMENT DBS AÉBOBIBS

B. Isolement par des tempkrattres basses. — Lorsqu'un microbe pousse à de basses températures, on peut Tisoler en faisant plusieurs passages de culture à une température où il végète seul. Arloing a isolé ainsi le Pneumo-baciUus Uquefadens bovis qui pousse à + 5'*.

^ 2"* Isolement par inoculation. — Lorsqu'on veut isoler une espèce pathogène d'un produit souillé par d'autres microbes, et qu'on connaît une espèce animale sensible à ce microbe, il suffit d'inoculer le tout à l'animal et de recueillir les produits pathologiques loin du point d'introduction. Il faut, bien entendu, pour que ce procédé réussisse, rechercher un microbe tiui ne reste pas cantonné dans la plaie d'inoculation. C'est ainsi que nous verrons au chapitre des Anaérobies (chap. vi) que l'inoculation au cobaye permet de recueillir du Vibrion septique pur dans la sérosité péritonéale. tandis que le B. de Nicolaîer (tétanos) reste localisé au point inoculé.

Le procédé d'isolement par inoculation est le meilleur de tous, lorsqu'il peut être employé. D a vaine, Pasteur s'en sont servis pour obtenir le microbe d'une septicémie du lapin; KocH a de même découvert une septicémie de la souris. Mais l'exemple le plus fameux est relui de la culture du Bacille

^ tuberculeux. On sait, depuis Koch ;1882). qu'il suffit d'inoculer un cobaye avec des produits tuberculeux quelconques pour avoir dans les ganglions et la rate de cet animal une semence absolument pure de bacille tuberculeux. L'inoculation au cobaye est toujours le premier temps de là préparation d'une culture pure du Bacille de Koch. On peut ainsi isoler le Staphylocoque pyogènCs le Streptocoque pyogêfie, \e BacillusanthraciSy etc., en inoculant le lapin et en cultivant son sang. On injecte des crachats de pneumonique à une souris ou à un lapin ; le Pneumocoque se trouve dans la moelle osseuse à l'état de pureté, etc. J. Ciukmoxt a isolé un Bacille de la tuberculose bovine^ en inoculant au cobaye et au lapin des produits lubercu-

* J. CouRMoNT. Sur une nouvelle tuberculose bacillaire du bœuf, études sur la tuberculose, 1890.

ISOLEMENT DES AÉROBIES 167

leux du bœuf; le bacille était à l'état de pureté dans le sang des animaux. Il en a été de même pour un autre Streptobacille tuberculeuXy également d'origine bovine, découvert par J. CouRMONT et Nicolas (1897). On pourrait multiplier ces exemples.

S^ Isolement par cultures liquides. — L'isolement des microbes par les cultures liquides est incontestablement entouré de difficultés. Il ne doit pas cependant être abandonné. 11 faut se souvenir que nombre de microbes poussent bien mieux en bouillon que sur milieux solides, et que la gélatine, qui est le milieu solide le plus maniable, doit être maintenue à -|-~ 22^ seulement. L'isolement de beaucoup d'espèces et la numération exacte des microbes contenus dans un produit pathologique, une eau, etc., n'est donc pas possible avec la gélatine; or la gélose est peu maniable. Les cultures liquides conservent en somme leur importance.

Nous venons de voir que les cultures liquides chauffées (cultures du B. subtilis) ou mises à des températures dysgénésiques pour la plupart des microbes (cultures de B. coli ou de B. (VEberth) pouvaient être pures en raison de l'action de la chaleur. Nous ne voulons parler maintenant que de l'isolement des aérobies par le simple fractionnement de la semence en cultures liquides. Ce fractionnement peut se faire par dilution ou par division du liquide en gouttes extrêmement petites.

Nous citerons, en outre, pour mémoire, la méthode, des plus primitives, employée par Klebs, en 1876. Les espèces qui végètent côte à côte dans un bouillon ensemencé avec un mélange microbien ne sont pas fatalement disséminées en proportions égales dans tous les points du liquide. Les bactéries immobiles tombent au fond du ballon, les mobiles se retrouvent dans toutes les couches, les aérobies francs poussent en pellicule à la surface, les autres préfèrent les couches inférieures moins riches en oxygène : enfln, certains microbes végéteront avec une telle rapidité qu'ils étoufferont pour ainsi dire toutes les autres espèces. Parti de ces données classiques, Klrbs était

arrivé à avoir des cultures pures en prélevant de très petites quantités de semence impure pour la reporter dans un nouveau ballon, et ainsi de suite. On n'est jamais sûr d'arriver au but par cette méthode, en tout cas très longue.

A. Méthode de dilution. — Elle consiste à diluer une goutte de semence dans une telle quantité de liquide stérilisé qu'une goutte du mélange ne puisse contenir qu'un seul microbe. Cette goutte ensemencée en bouillon donne une culture pure.

Cette méthode, déjà employée, en 1873, par Van Tieghsm et Le Monnier pour l'isolement des champignons (Mucorinées), a été introduite en bactériologie par Ncegbli *, en 4878, et perfectionnée depuis par Brefeld', Miquel', etc.

Nous n'insisterons pas actuellement sur la technique de l'isolement par les cultures liquides ; elle sera développée tout au long au chapitre de VAnalyœ de feau (ch. xiv).

La méthode de la dilution est encore employée pour l'ensemencement des cultures solides (voy. Cultures sur plaques, p. 171).

B. Méthode ou fractionnement en gouttelettes. — Elle est due à Chauveau et Arloing et sera décrite avec détails au chapitre de V Analyse de Veau (p. 392). Le principe de la méthode réside dans l'emploi d'une pipette suffisamment fine pour fractionner le centimètre cube en 130 à 180 gouttes. Chaque goutte ensemence un ballon. Une dilution préalable peut être le premier temps de l'opération.

C. Méthode des cultures filtrantes. — Nous avons déjà dit (p. 12) que les microbes ne sont pas toujours retenus par les bougies de porcelaine, Chamberland ou autres. Camrier (1901)

NcEGELi, Vntersuehungen Uber niederen Pilze, 1878.

' Brefeld, Vntersuehungen Uber die Spaltpilze {B€u:illus subtilisa

' MiorEL. Organismes rivants de Vatmosptière, Paris, 1882; et Annales de l'Obscrv. de Montsouris. passim.

ISOLEMENT DES AEROBIES

a cherché à utiliser ce passage de certains microbes à travers les filtres pour isoler le B. d'Eberth des .

autres microbes des eaux ou des selles. ^

Une culture impure contenant du B. d*Eherth placée dans une bougie, plongeant elle-même dans du bouillon nutritif, ensemencerait ce dernier, autour de la bougie, uniquement de B. d*Eberth, ce dernier passant à travers les pores de la bougie» grâce à sa grande mobilité. On verra (p. 417) que cette propriété n'est pas spéciale au B. d^Eberih,

Lesieur a repris cette question, dans notre Laboratoire. Le dispositif employé (fig. 107) se compose d'un tube d'Esmarch (A) contenant du bouillon (/) dans lequel plonge une bougie Ghamberland (B), petit modèle, marque F. On ensemence dans la bougie et on surveille le bouillon extérieur ; dès qu'il se trouble^ on fait les examens nécessaires pour constater la pureté de la culture.

Voici un tableau montrant la rapidité avec laquelle plusieurs microbes traversent ces bougies.

Fig. 107.

Méthode de Cambier. Dispositif de LesiBun.

En bouillon ordinaire. En milieu de Cambier.

Bacille d'Eberth. . .

en

leures

en