CULTURES DANS UN GAZ INERTE

anaérobie (le Vibrion septique) à l'air libre, dans du bouillon étalé en couche mince mais contenant en même temps un microbe aérobie (un diplocoque) qui absorbai troxygène (le bouillon en était dépourvu malgré sa grande surface d'exposition à Tair) . Toutes les cultures mixtes d'un aérobie et d'un anaérobie ne donnent pas ce résultat : ainsi le mélange du Vibrion septique et du Staphylocoque pyogène ne laisse pas pousser l'anaérobie parce que le staphylocoque sécrète des substances solubles qui entravent la pullulation du Vibrion septique. Ces expériences expliquent bien la végétation possible des anaérobies dans la nature.

Toutes les méthodes précédentes ne sont pas essentiellement pratiques ; la plupart constituent simplement des expériences curieuses*. Celles que nous allons décrire sont au contraire journellement employées dans les laboratoires; elles sont toutes basées sur l'extraction mécanique de l'oxygène des récipients destinés aux cultures d'anaérobies.

1^ Cultures dans une atmosphère confinée dont Tair a été refoulé et remplacé par un gaz inerte. — Un appareil à faire le vide n'est pas indispensable pour chasser l'air d'un récipient à culture. 11 peut être remplacé par le refoulement de Vair à l'aide d'un gaz inerte. Wurtz a proposé, en 1889, l'artifice suivant : on charge de gélose un tube à essai et on le bouche par un bouchon de caoutchouc muni de deux tubes de verre (A) et (B) (fig. 125). Le tube (A) effleure la gélose et est embranché sur un tube de caoutchouc qui amène du gaz d'éclairage. On fait passer le courant de gaz pendant cinq minutes en môme temps qu'on fait bouillir la gélose à l'aide d'un bec Bunsen pour empêcher qu'elle ne s'imprègne de gaz. Au bout de cinq minutes on verse par le petit entonnoir (B) 1 ou 2 centimètres cubes de pétrole stérilisé. On enlève le bou-

bies sur la conservation et la végétation des anaérohies, Arch. de physiologie, juillet 1894.

* Voy. p. 606 rutilisation de ce procédé pour obtenir en graod la culture du B. de Nicolaïer à l'air libre.

CCLTCRE DKS A^'AKR0B1E^

chon de caoutchooc et on Je remplace par un tampon de ouate. Pour ensemencer, on incline le tube de faron à mettre à nu la moitié de ia surface de la gélose, et on fait la piqûre au moyen d'nn Gl de plaline monté sur la paroi d'un tube en Terre C en rapport lui-même par un tuyau J)) arec une con-

Fijr. Ii5.

Appareil de \\ urtz pour la culture des anaérobies dans un gaz inerte de gaz d éclairage).

Fig. 126.

Appareil de Roux pour la culture des anaérobies dans un gaz inerte.

duite de çaz qui reste ouverte pendant tout le temps de lopération.

Pasteur avait déjà employé Tacuir carbonique dans le même but. Ce gaz, ainsi que le gai d'éclairage, peuvent être nuisibles à la culture de plusieure microbes iFr.cnkel, Kladakis, 1890) et doivent donc être rejetés de la technique générale.

Rurx a indiqué un procédé beaucoup plus simple de refoulement de laîr par un caz inerte. La gélatine nutritive est contenue dans un tube à essai, élire à sa partie supérieure en un tube assez mince pour qu'il soit facilement fermé au chalumeau, <»l fermé i^r un tampon de coton f\2. 126). On liquéfie

CULTURES DANS LE VIDE 198

la gélatine dans un bain d'eau chaude, on fait pénétrer Â^ravers la ouate jusqu'au fond de la gélatine un tube de petit calibre, une pipette courbée qui amène un courant de gaz prive d'air. Ce petit tube a été stérilisé ; il porte un tampon de coton pour filtrer le gaz à son arrivée. Lorsque le gaz a suffisamment barboté dans la gélatine, on soulève le tube à la surface de la gélatine qu'on laisse refroidir. Le gaz continue à passer. On ensemence par piqûre. On soulève le petit tube au-dessus de l'étranglement qu'on ferme à la lampe. Il n'y a pas d'air dans un tube ainsi préparé.

8^ Cultures dans le vide obtenu par aspiration. — La

méthode la plus employée et la plus commode consiste à faire le vide dans les j-écipients destinés à cultiver les anaérobies. C'est d'ailleurs la seule qui permette d'analyser les gaz produits par les anaérobies.

A. Machines pneumatiques. — Toutes les machines pneumatiques peuvent servir à faire le vide dans les récipients à cultures. 11 sera utile d'intercaler sur le tube en caoutchouc qui relie le récipient à culture (A) à la chambre de l'appareil (B) un tube de verre en T (C), dont la branche inférieure sera munie d'un tube de caoutchouc (D) à parois suffisamment épaisses pour tenir le vide, et lui-même fixé à un autre tube de verre (E) long de 90 centimètres environ et plongeant dans un vase rempli de mercure (F) (fig. 127). Le tube (E) constitue un tube barométrique qui permettra d'apprécier la perfection du vide obtenu ; il servira aussi à introduire un gaz inerte dans le récipient à culture (A) (voir 9^). 11 est.facile de modifier ainsi soi-même une machine pneumatique quelconque.

La trompe à eau donne un vide moins parfait que la machine pneumatique, mais toijyours suffisant pour cultiver les microbes les plus anaérobies. Nous nous servons d'une trompe, à enveloppe métallique, placée dans le sous-sol, et actionnée par l'eau d'un réservoir situé 19 mètres plus haut. La conduite d'eau p^sse par le laboratoire où elle est munie d'un robinet qui permet de mettre l'appareil en marche. Le .tube tenai\tie

PRÉCIS DE BACTÉRIOLOGIE, 2* édit. 43

CULTURE DES ANAÉROBIES

vide se branche en T sur un tube horizontal où s'insèrent plusieurs robinets munis de forts tubes de caoutchouc ; il est surmonté d*un manomètre. On peut ainsi faire le vide en môme

Fig. 127.

Adaptation de la machine pneumatique à la culture des anaérobies

dans le vide ou dans un gaz inerte.

temps dans un grand nombre de récipients. Les deux extrémités sont reliées à des générateurs d'hydrogène ; les deux robinets extrêmes sont à voie en T pour pouvoir faire pénétrer rbydrogène après le vide obtenu.

CULTURES DANS LE VIDE

Nous avons aussi des trompes métalliques adaptées directement aux robinets des laboratoires. Pour augmenter leur puissance (faible en raison du voisinage du réservoir du toit), nous avons ajusté, à la partie inférieure de la trompe, un tube en plomb de vue, de 0"*,01 de diamètre qui descend jusque dans le sous-sol.

Certaines installations (fig. 128) ont un récipient de sûreté (R)

Fig. 128. — Trompe avec récipient de sûreté R, G.

interposé entre la trompe et le tube à vide (R), pour éviter les refoulements d'eau dans ce dernier. On peut y suppléer en plaçant de suite après la trompe un flacon à deux tubulures.

B. Récipients. — On peut se dispenser d'avoir des récipients spéciaux pour les cultures dans le vide. Il suffirait de placer ceux qui ont été décrits pour les cultures aérobies sous des cloches à vide ordinaires. On compléterait le vide pneumatique obtenu, par l'addition d'un vase contenant un milieu avide d'oxygène, l'acide pyrogallique par exemple.

Le grand inconvénient de ce dispositif tient dans la difficulté de transporter la cloche dans l'étuve et de trouver une sub-

196 CULTURE DES ANAERODIES

stance d*ajutage qui maintienne la fermeture hermétique des joints à + ZT,

On peut aussi utiliser Tétuve à vide de Wiesnceg, |n représentée page 845, figure 371. ■ Aussi préfère-t-on faire directement le vide dans

les récipients eux-mêmes. Les récipients destinés aux cultures qui pousseront dans le vide, doivent remplir une condition essentielle : ils auront des R H parois suffisamment épaisses et des ajutages assez

parfaits pour pouvoir tenir le vide sans se briser, a. Récipients à cultures anaérobies liquides. — On se servait autrefois du tube Pasteur simple ou double (fig. 9). Nous employons continuellement la pipette à boule * (fig. 129) munie de plusieurs rétrécissements séparant deux ou trois bouchons de ouate. Ce petit appareil peut servir autant de fois qu'il possède de rétrécissements et de tampohs ; il est très commode. I^ forme courbée de sa pointe effilée a cependant Tinconvénient de le rendre encombrant dans une étuve et par conséquent fragile. 11 est bon d'avoir dans la chambre étuve une petite caisse dans laquelle sont placées (la pointe effilée en bas, pour que la culture ne touche pas le coton) toutes les pipettes à boule. Nous avons fait construire une planche à supports, spéciale pour cet usage.

Pour charger un tube Pasteur ou une pipette à

boule {préalablement stéri-

___^^^^^,„^«___ lises au four

Pasteur ou à

Fig. Ii9. Tautoclave), il

Pipette à boule pour la culture des anaérobies faut d'abord

en bouillon. ensemencer le

* Il faut nécessairement introduire les tampons de ouate successivement avant de faire les rétrécissements suivants. C'est donc le fabricant de pipettes qui doit placer le coton.

CULTURES DANS LE VIDE 197

liquide nutritif dans un petit ballon ordinaire comme s'il s'agissait d'une culture aérobie. On casse alors avec une pince l'extrémité du tube effilé *, on flambe avec soin la surface extérieure de ce dernier sur une hauteur de plusieurs centimètres, on attend quelques secondes le refroidissement, et on plonge le tube ouvert dans le petit ballon de bouillon ensemencé. On aspire avec la bouche jusqu'à ce que le liquide ait rempli les deux tiers de la boule ou la moitié du tube Pasteur ; on applique alors le doigt sur l'orifice supérieur, on retire l'appareil, on l'incline, la pointe dirigée vers le haut, de façon à ce que l'extrémité du tube soit privée de liquide, et on ferme de nouveau à la lampe la pointe du tube effilé. On adapte alors le tube supérieur au tube de caoutchouc de la machine pneumatique ou de la trompe, et on applique sur cet ajutage une ligature bien serrée au moyen d'une petite lanière coupée dans une bande plate de caoutchouc. Un peu de vaseline facilitera l'entrée du tube de verre dans le tube de caoutchouc lorsque les parois de ce dernier seront trop rigides. 11 va sans dire que l'orifice supérieur des tubes Pasteur ou de la pipette à boule doit avoir des bords plutôt rentrants qu'évasés; un léger rétrécissement facilite la ligature.

L'appareil ainsi mis en place, on fait le vide. Bientôt (s'il n'y a pas de fissures dans l'ajutage), de nombreuses bulles d air se détachent des parois du tube et viennent éclater à la surface du bouillon. Le liquide nutritif se purge donc d'air, par cette méthode, sans qu'on ait besoin d'avoir recours à l'ébullition à + iOO". On peut activer l'opération en chauffant très légèrement le liquide ; il suffit pour cela de serrer la boule dans la main ; les bulles d'air se précipitent avec rapidité ; ce petit artifice est souvent indispensable pour dilater et chasser la bulle d'air qui .se trouve presque toujours à l'extrémité effilée de la pipette à boule ; le liquide prend sa place et choque le fond du tube avec un bruit perceptible qui indique le vide. Lorsque celui-ci

* Il est bon, lorsqu'on se sert de tubes Pasteur, d'écarter la branche eflilée du corps du tube, qui Tempêcherait de plonger dans un ballon. Cela est très simple en ramollissant la soudure à la lampe d'émailleur.

198 CULTURE DES ANARROBIES

est aussi parfait que peut le fournir l'appareil employé, on scelle à la lampe le rétrécissement le plus rapproché de la machine pneumatique et la culture est prête à être mise à Tétuve. Il faut avoir soin de fermer le robinet qui commande le récipient, avant de sceller ce dernier. Le rétrécissement sera étiré avec une rapidité suffisante pour empêcher Tair atmosphérique de crever le verre et d'envahir le tube ; il se produit presque toujours une petite dépression en ombilic qui témoigne de la réalité du vide.

11 doit toujours rester un tampon de coton dans le tube Pasteur ou dans la pipette pour permettre de réensemencer plus tard avec pureté la culture obtenue. Supposons que Télève veuille propager une culture anaérobie ayant végété en pipette à boule : i^ Il faut d'abord briser avec une pince l'extrémité scellée qui avoisine le tampon de coton ; Tair se précipite dans le tube; mais, liltré à travers le coton, retenu par Tétranglement, il ne peut contaminer le bouillon. Ce premier temps est indispensable ; si on ouvrait d'abord Textrémité chargée de liquide, Tair pénétrerait directement dans celui-ci et le souillerait de tous les germes qu'il contient, en même temps qu'il le projetterait contre le coton ; 2° Le second temps consiste à déboucher un petit ballon stérilisé qu'on place dans un cristallisoir; 3<> Le troisième temps est le plus délicat : il faut stériliser le tube effilé jusqu'au coude, en le passant plusieurs fois dans la flamme d'un bec Bunsen, tout en ayant soin de ne pas trop chaufîer le liquide de culture dont les microbes ne doivent être ni lues, ni atténués. On casse alors la pointe avec une pince flambée, et on l'introduit immédiatement dans le petit ballon qui roroit toute la culture ; ki"-' L'ensemencement se fait alors comme pour les cultures aérobies, et ainsi de suite. Le cristallisoir est destiné à recevoir les quelques gouttes de culture qui peuvent tomber de la pipette avant son introduction dans le ballon et qui souilleraient le laboratoire ; la stérilisation du tube jusqu'au coude est utile dans les cas où, la pipette étant tenue la pointe en l'air, une goutte de culture viendrait couler sur la surface extérieure jusqu'au coude qui est la partie la plus déclive, et retomberait ensuite dans le petit

CULTURES DANS LE VIDE

ballon ; de cette façon, la goutté rie peut être contaminée.

Une simple pipette est plus commode que la pipette à boule, si on n'a pas besoin d'une quantité notable de culture, par exemple lorsqu'on veut simplement propager un anaérobie sans l'inoculer. 11 faut alors faire des pipettes avec des tubes de 10 millimètres de diamètre en verre un peu

fort. |ji manoeuvre est

la même. La figure 130

nous dispense de toute

description. La pipette

simple peut aisément se

faire au laboratoire ; elle

est en outre moins friable à l'étuve, si on a

soin de la fermer aussi

près que possible du

corps.

On peut faire des cultures liquides dans le

vide avec un tube à essai

quelconque (fig. 131,

!^ A), pourvu que ses pa-

W rois soient suffisamment

Il épaisses. Il est stérilisé

avec un tampon de ouate, chargé de bouillon et ensemencé.

On remplace alors le tampon de ouate par Un bouchon de caoutchouc (C) percé d'un orifice central, lequel donne passage à un tube de verre (B) muni d'un tampon de ouate situé entre deux rétrécissements. Le bouchon de caoutchouc a été stérilisé dans la solution de sublimé à 1 p. 100; le tube de verre a été

Dispositif pour les cultures anaérobies en bouillon dans des tubes à essai.

Le tttboBMt scellé, le vide ayant été fait.

Fig. 180.

Pipette pour cultiver les anaérobies dans le vide.

A, pipette prèle i servir. — B, pipette contenant la culture dans le vide.

too

CULTURE DE!$ ANABROBIES

Stérilisé' psu" la chaleur. La fermeture est rendue hermétique par un vernissage à la gutta-percha (dissoute dans le chloroforme) ou' au moyen de cire à cacheter. On opère alors exactement comme avec un tube Pasteur ou une pipette à boule, et on ferme le tube de verre à la lampe. .

Les dispositifs précédents ne permettent pas d*obtenir des cultures liquides en grandes quantités, comme cela est nécessaire dans certains cas (exemple:

la préparation des toxines du Bacille de Sicolaier en vue de Timmuniftation des grands animaux pour la récolte du sérum an ti toxique). On se servira alors de grands flacons de un ou deux litres (fig. 132). \Lïi bouchon en caoutchouc (h) livre passage à un tube de verre (c) présentant deux étranglements entre lesquels est, pour plus de sûreté d*asepsie lors de l'ouverture, un tampon d'ouate.

Un second tampon d'ouate (a) volumineux ferme le goulot au-dessous du bouchon et suffirait à filtrer Tair de rentrée, lors de Touverture. Les joints du bouchon sont enduits de cire d'Espagne. Les temps de l'opération sont exactement les mêmes que pour le tube à essai fermé avec un bouchon de caoutchouc. Le tube (c) sert à faire le vide et est fermé à la lampe.

J'ai fait construire, chez Alvergniat, trois récipients en verre destinés à obtenir de grandes cultures liquides, ou à contenir plusieurs récipients ordinaires, ou à conserver des toxines dans le vide. Je voulais pouvoir constater journellement l'existence du vide, au moyen du manomètre, et pouvoir compléter ce vide, sans démonter l'appareil ; je voulais pouvoir prélever des toxines et refaire immédiatemont le vide. 11 fallait, pour cela, des récipients tout en verre,

Fig. 432.

Grand flacon disposé pour là culture en bouillon d'un anaérobie.

CULTURES DANS LB VIDE

munis de manomètres et de robinets à vide en verre rodé.

Je ne décrirai ces récipients qtie très rapidement. Ils sont fragiles, délicats à ^^c^

manier, et ne peuvent être mis entre les mains des élèves.

Le premier ( fig .

133) est un llacon de G

2 litres (A), surmonté d'un bouchon en verre rodé (B). Le goulot du flacon dépasse le bouchon, formant un petit entonnoir (C). Le bouchon est creux et donne accès à un tube recourbé (D) muni d'un manomètre (M) et d'un robinet à vide (E), lequel est surmonté d'un petit entonnoir et est fermé en bas par un petit réservoir (G).

Le récipient sert aux cultures liquides en grand. On stérilise le flacon à part, avec le liquide nutritif, en recouvrant Torifice avec un capuchon de papier à filtrer. On ensemence. On adapte le bouchon (B), préalablement flambé et enduit d'un des corps gras isolants, employés en physique à cet usage (cire et manne par exemple). La cavité du bouchon est remplie par un tampon de coton de verre (6) retenu par une saillie (c) du bouchon. On remplit de mercure les entonnoirs (G) et (E). On adapte l'extrémité de (D) à un appareil pneumatique. On ferme le robinet (E) et on met à l'étuve. Si le manomètre indique l'affaiblissement du vide, on recommencera la manœuvre.

Le second (fig. 134) est destiné à conserver les toxines dans

Fig. 133.

Récipient pour les cultures

anaerobies, avec manomètre.

CULTURE DES ANAEROBIES

le vide. Le séjour dans la glacière rend le vide beaucoup plus facile à conserver. La figure dispense d'une longue description. C'est lappareil précédent avec en plus, un tube (T) plon-

Fig. 134.

Récipient pour conserver les toxiîies dans le vide, avec manomètre.

géant jusqu'au fond dans le liquide, et une seconde branche (S), munie d'un robinet (E'), et à laquelle on peut adapter un tube de caoutchouc (S) muni d'une pipette en verre (P). On stérilise l'appareil, en entier, y compris le bouchon, on graisse les robinets, on remplit les entonnoirs de mercure. On ouvre les deux robinets et on adapte l'extrémité du tube (S) îiu

CULTURES DANS LE VIDE

caoutchouc qui part de la tétine de la bougie à filtration (p. 63 fig. 48). L'opération terminée on enlève ce caoutchouc

et on le remplace par Tajutage (N). On fait le vide par (D), on ferme les deux robinets. On met à la glacière. Quand on veut prélever de la toxine, on ouvre successivement les deux robi-

Cloche pour maintenir dans le vide des

récipients ordinaires (T, F). L=: liège.

L'ajulagc du couvercle A' sur le corps du bas A esl mal représenté. 11 est, en réalité, constitué par 2 anneauK rodés, comme dans les cloches ordinaires à ride.

Fig. 136.

Dispositif pour les cultures an aérobies sur gélatine dans des tubes à essai.

nets (E) et (E'). L'air est filtré par le tampon de ouate (0, on casse la pipette (P) ; on souffle par (D); on recueille la quantité voulue de toxine; on referme la pipette; on refait le vide.

Le troisième (fig. 135) est une espèce de cloche destinée à contenir plusieurs cultures.

CULTURE DES ANAEROBIES

b. Récipients à cultures anaérobies solides, — Ils sont identiques pour la gélatine, la gélose ou le sérum. Nous nous servons habituellement d'un simple tube à essai (fig. 136, A) muni d*un bouchon de caoutchouc (C) auquel est adapté un

Tube de Roux pour la culture des anaérobies sur milieu solide.

Fig. 138.

Le tube de Roux de la Ggure 137, au moment de faire le vide.

tube de verre à deux rétrécissements (B) bouché, à la ouate, comme il vient d'être dit (p. 199), pour les cultures liquides. On enduit le bouchon de cire à cacheter ou de gutta-percha dissoute dans le chloroforme ; on fait le vide et ou ferme à la lampe (fig. 136). Ce procédé est simple et économique.

Le tube de Roux (fig. 137) est un tube à essai surmonté d'un tube plus étroit (B) muni d'une branche latérale (A) ; deux tampons de ouate ferment les orifices.

CULTURES DANS LE VIDE

Après stérilisation au four, ce tube est chargé de gélatine jusqu'au quart inférieur avec un entonnoir capillaire ; on replace le tampon supérieur et on stérilise à la chaleur humide comme toute gélatine. On ensemence par piqûre à

Fig. 139.

Tube de Roux pour culture des anaérobies sur pomme de terre.

Tube de Roux contenant une culture sur pomme de terre dans le vide.

travers le tube (B) et on le ferme à la lampe (fig. 138). On fait alors deux étranglements autour du tampon du tube (A) qu'on adapte à la machine à faire le vide. Celui-ci fait, on ferme à la lampe. Nous préférons le simple tube à essai fermé par un bouchon de caoutchouc, lorsqu'on ne veut pas faire circuler le gaz inerte.

Pour faire des cultures anaérobies sur pomme de terre, on peut encore se servir d'un gros tube à essai disposé comme dans les cas précédents. Roux soude à son tube à pomme de terre, au-dessous de l'étranglement, une branche latérale (a) avec un tampon de ouate entre deux rétrécissements (fig. 139).

CrLTUBB

AAAUIOBIBS

On ensemence la pomme de terre, on hmmtt à la lampe la partie supérieure, on fait le vide par la branche lÉtfnlt qu'on ferme aussi (lig. 140).

9^ Cultures dans le vide comblé par un gas inerte. —

Les méthodes de culture où le vide est obtenu par une

Fig. 141.

Gazomètre à hydrogène.

machine pneumatique, sont très largement suffisantes dans rimmense majorité des cas. Cependant les milieux solides conservent une assez grande provision d'air qui peut nuire au développement de certains microbes ; il est recommandé de chasser cet air, avant solidification, et par conséquent avant Tensemencement, au moyen du barbotage d*un gax

CULTURES DANS LK VIDE COMBLÉ PAR UN GAZ INftKlB 207

inerte ; c'est le refoulement combiné avec Faspiration mécanique. On peut ainsi arriver à faire le vide avec des appareils assez imparfaits. On se servira toujours d'hydrogène comme gaz inerte ; Tacide carbonique, le gaz d'éclairage pouvant nuire au développement microbien.

Le gazomètre à hydrogène le plus simple est le suivant: deux grands flacons de Mariotte (fig. 141) sont unis (f) parleur tubulure inférieure de façon à constituer un récipient en U étranglé à sa partie inférieure. Le flacon (A) n'est pas bouché ; le flacon (B) est muni à sa partie supérieure d'un bouchon de caoutchouc percé d'un orifice livrant passage à uu robinet (a). Au fond du flacon (B) sont rangés verticalement, et se touchant tous, des fragments de tube de verre plein (agitateurs) de 10 centimètres de hauteur environ {b] ; sur eux reposent les fragments de limaifle de zinc (c). Le robinet (a) étant fermé, on remplit le flacon (A) avec de Teau acidulée, avec de l'acide sulfurique ou chlorhydrique (une partie d'acide sulfurique à verser doucement dans huit parties d'eau en remuant pendant quon verse). On ouvre le robinet {a) : le liquide se répartit dans les deux flacons qui sont à moitié pleins, d'après le principe de la répartition des liquides dans les vases communicants. On ferme le robinet (a). Le zinc trempant dans l'eau acidulée, l'hydrogène prend naissance et refoule l'eau au-dessous du zinc ; on ouvre alors le robinet pour purger d'air le flacon (B) ; le liquide remonte, engendre de l'hydrogène, et ainsi de suite à deux ou trois reprises. Lorsque le flacon (B) contient de l'hydrogène pur, l'appareil est prêt à fonctionner ; il suffira de mettre en rapport le tube qui part du robinet {a) avec le récipient à

Générateur d'hydrogène

de Jorfjensen.

208 CULTURE DBS ANAÉROBIES

culture où le vide a été fait pour que le gaz envahisse ce dernier. L'hydrogène se formera au fur et à mesure des besoins.

JoRGRNSEN a montré qu'on pouvait fabriquer très économiquement un générateur d'hydrogène (fig. 142). Un verre de lampe ordinaire est Oxé à l'aide d'un bouchon perforé (a) dans une éprouvette à pied contenant la solution d'acide sulfurique f j-) avec deux gouttes d'une solution de chlorure de platine. En (6) est une lame de plomb perforée et couverte de mousseline pour supporter les petits morceaux de zinc. Le bouchon (c) en caoutchouc doit fermer très exactement. L'hydrogène passe dans un flacon laveur (e) contenant une solution alcaline d'acide pyrogallique (1 partie d'une solution aqueuse d'acide pyrogallique à 25 p. 100, mélangée à 10 parties d'une solution de potasse à 60 p. 100), pour enlever toute trace d'oxygène (Salomonsen).

Si on tient à avoir un hydrogène absolument pur, on le fera passer dans une série de flacons laveurs contenant eau, potasse, azotate d'argent, acide sulfurique, avant de l'envoyer dans le récipient à culture.

Le tube en T que nous avons adapté à la machine pneumatique ordinaire (p. 194) ou les deux robinets extrêmes de notre pompe (p. 195) serviront à amener le gaz, les robinets en cuivre de la trompe étant percés en T à trois voies. La manœuvre est la suivante : on fait le vide, puis on remplit le tube à culture avec un courant d'hydrogène ; on refait le vide et ainsi de suite quatre ou cinq fois. On peut laisser la culture dans l'hydrogène en fermant le tube pendant qu'il est plein de ce gaz.

Pour les cultures en milieu solide, il faut faire pénétrer (le faire barboter serait mieux) l'hydrogène sur la gélatine ou la gélose avant la solidification, et ensemencer, après celle-ci, dans le courant de gaz inerte. Supposons qu'on utilise le tube de Roux (fig. 137) : on le ferme en (B) après stérilisation de la gélatine. On fond la gélatine dans un bain-marie à une température aussi basse que possible, et on adapte (A) à la machine pneumatique. On fait pénétrer l'hydrogène à deux ou trois reprises en laissant entrer davantage de gaz toutes les