ISOLEMENT PAR CULTURES LIQUIDES

10 Isolement par la chaleur. — La plupart des anaérobies pathogènes {Vibrion septique, Bacille de Nicolaïery etc.) se reproduisent au moyen de spores très résistantes à la chaleur. On peut donc chauffer pendant 10 minutes à -f 100** le mélange microbien, et tuer ainsi tous les autres microbes. Pasteur a, le premier, indiqué ce procédé pour l'isolement du Vibrion septique, et Kitasato Ta appliqué à celui du Bacille du tétanos. Il va sans dire qu*on ne pourrait pas isoler Tun de l'autre ces deux anaérobies par cette méthode.

2» Isolement par inoculation. — On inocule à une espèce animale, très sensible au microbe anaérobie à isoler, le mélange qui le contient ; après la mort de Tanlmal, on ensemence aseptiquement les produits pathologiques de celui-ci. Exemple : on inocule sous la peau de la cuisse d'un cobaye une pincée de terre végétale, de terreau bien fumé, de vase. Le cobaye meurt, au bout de vingt-quatre ou trente-six heures, de septicémie gangreneuse. On ensemence la sérosité péritonéale, ou cultive dans le vide, et on obtient une culture pure de Vibrion septique. Pour le Bacille tétanique l'inoculation est moins utile, parce que le microbe reste cantonné dans la plaie avec les impuretés inoculées.

On fera bien de combiner la méthode de l'inoculation avec celle du chauffage, c'est-à-dire d'inoculer au cobaye des produits chauffés pendant dix minutes à + ^^0*, car certaines espèces facultatives, même non pathogènes, peuvent venir souiller les sérosités pathologiques et donner des cultures mixtes.

8*^ Isolement par des cultures liquides. — C'est la première mélhode de Pastecr, qui faisait le vide et lui substituait de l'acide carbonique dans des milieux liquides. Nous n'entrerons pas dans de grands détails, car elle est facile à concevoir. On opère exactement comme pour les cultures aérobies, (voir p. 167), c'est-à-dire qu'on fait un certain nombre de dilutions et on répartit le liquide dilué par petites quantités dans un très grand nombre de récipients. Ces derniers, au lieu d'être

2i2 ISOLEMENT DES ANAÉROBIES

de simples ballons ou tubes à essai, seront les tubes décrits plus haut pour la culture des anaérobies en milieux liquides (tube Pasteur, pipette, tube de SaIomonsen,etc., p. 195 et suivantes). On fait le vide, avec ou sans refoulement par l'hydrogène, et on met à l'étuve à + 38®. On examine alors les tubes qui se sont troublés. On contrôle la pureté de la culture obtenue par une culture en tube de gélatine enroulée dans le vide, par l'ensemencement à l'air qui doit rester stérile à moins que l'anaérobie soit facultatif, par l'inoculation, par l'examen microscopique, et, au besoin, par une nouvelle série de dilutions.

L'obligation de faire le vide dans un grand nombre de tubes rend Tisolement des anaérobies en milieux liquides très long, et, par conséquent, moins pratique que parles méthodes suivantes.

4P Isolement par des cultures sur milieux solides. —

On peut employer indifféremment la gélatine ou la gélose ; cette dernière peut être portée à l'étuve à + 38"^; la gélatine, plus maniable, bien que devant être maintenue à une température inférieure à+ 22", est plus fréquemment employée.

Comme principe général on commencera toujours par faire des dilutions comme pour les cultures aérobies; en général, on ensemence un tube de gélatine avec une goutte du mélange ; on prend une goutte de cette première gélatine pour ensemencer un second tube, et une goutte de ce second pour un troisième. La première goutte peut être diluée dans de l'eau stérilisée, si on suppose très riche la flore microbienne du produit.

a. Méthode de Koch. — La méthode primitive de Koch consistait à étaler la gélatine ensemencée sur une plaque (voy. p. 171) et à appliquer sur cette gélatine encore chaude et visqueuse une feuille de mica stérilisée; les bords de cette feuille étaient lûtes avec de la paraffine. On pouvait observer le développement à travers le mica. Gornil et Babes conseillaient une lame de verre très mince. Ces méthodes n'appartiennent plus qu'à l'histoire.

b. Méthode de Liboriua. — Liborius a isolé des anaérobies en

les cultivant simplement dans un tube de gélatine ou de gélose rempli aux trois quarts de la hauteur (p. 186). On mélange bien la goutte ensemencée à la gélatine ou la gélose en remuant celle-ci encore chaude avec une aiguille de platine, et on laisse refroidir. Les microbes anaérobies poussent dans la profondeur (fig. 145). Pour les recueillir, il faut couper le tube de verre à leur niveau avec un couteau à verre et un charbon de Berzélius, et recevoir le morceau de gélose dans une boite de Pétri stérilisée. On coupe celui-ci en tranches minces jusqu'à la colonie à étudier. On peut quelquefois ne pas sacrifier le tube et aller puiser la colonie avec une pipette. Cette méthode est peu pratique lorsque les microbes liquéfient la gélatine ou développent beaucoup le gaz.

c. Méthode de Klebs et Vignal. — Klkbs et ViGXAL ont conseillé, en 1887, la culture sur gélatine en tubes capillaires pleins. On fait des pipettes longues de 1 mètre, avec un tube de verre de 2 ou 3 millimètres de diamètre, et on les stérilise. On fait bouillir la gélatine dans un tube à essai ordinaire, et on la laisse refroidir dans' un courant d'hydrogène, amené par une

Fig. 145.

Tube de Libointis contenant des colonies anaè* robies dans la profondeur de la gélatine.

Fig. 146.

Fragments du long tube de Vignal plein de gélatine avec colonies

anaérobies.

pipette plongeant au fond du tube. Vers + 25° on l'ensemence dans Thydrogène, on Tagite pour répartir les germes, et on aspire la gélatine encore liquide.dans la longue et fine pipette. On ferme à la lampe les deux extrémités, et on possède un

ISOLEMENT DES ANAEROBIES

tube capillaire clos, complètement rempli de gélatine privée d'oxygène et parsemée do germes anaérobies qui donneront autant de colonies (fig. 146). On fera trois tubes pour diluer comme avec la méthode de Lirorius. Pour aller saisir une colonie, on lave le tube de verre au sublimé et à Talcool absolu, on le sèche avec du papier stérilisé, et on le coupe au niveau de la colonie.

d. Méthodes de Blûcheret de Botkine. — L'isolement peut se

faire par cultures sur plaques de gélatine d'après la méthode de Koch pour les aérobies (voy. p. 17! )•

Pour priver les plaques d'oxygène, Blûcher a recommandé un appareil consistant en une petite cloche de verre, en forme d'entonnoir, placée dans un cristallisoir rempli de glycérine diluée ; la cloche est chargée par un poids de plomb et l'hydrogène pénètre par en haut.

A peu près semblable est l'appareil de BoTKiNE représenté (fig. 147). L'hydrogène arrive par (1) et sort par (2). Un petit triangle en fer porté par trois pieds émerge de la glycérine et supporte soit un échafaudage de boîtes de Pétri, soit des plaques de Koch portées par un support en baguettes de verre. L'hydrogène passe pendant une demiheure et on ferme à la lampe (1) et (2).

e. Méthode de C. Frœnkel. — C. FROENKELisole les anaérobies sur gélatine roulée en tubes d'Esmarch (voy. p. 178) avec l'appareil dessiné (fig. 148).

C'est un simple tube à essai fermé avec un bouchon de caoutchouc qui laisse passer deux tubes de verre dont l'un (A)

Fig. 147.

Appareil de Botkine pour la culture des anaérobies sur plaques de gélatine.

A, cuvctle remplie de glycérine. — B, cloche plongeant dans la glyc<^rine. — C, échafaudage pour supporter les plaques. — 1 et i, tubes d'arrivée et de sortie de l'hydrogène.

plonge jusqu'au fond du tube. Le bouchon est recouvert de paraffine. On ensemence la gélatine liquide (on fait toujours plusieurs tubes pour diluer comme il a été dit plus haut), on fait barboter Thydrogt'ne pendant quatre minutes, on ferme

Fig. 148.

Tube de C. Fraenkel pour la culture des anaérobies sur gélatine enroulée par la méthode d*Esmarch.

Fig. 149.

Tube de Rottx pour cultures sur plaques de gélatine enroulée par la méthode d'Esmarch.

les deux tubes à la lampe et on enroule la gélatine, comme il a été dit page 178.

Ce procédé est très simple ; il a tous les avantages de celui d*Esmarch ; on peut aller puiser les colonies sans sacrifier le tube et sans le contaminer.

f. Méthode de Roux. — Le procédé de Roux isole aussi les anaérobies sur gélatine enroulée dans un tube. On prend trois tubes de verre ayant la forme figurée page 177, on les charge

ISOLEMENT DES ANAEROBIES

d'une petite quantité de gélatine stérilisée ; on les ensemence successivement (système des dilutions) avec le liquide à étudier. On étrangle le tube en (6) on pousse le tampon et on allonge en (a) au-dessus du coton (fig. 149). On met le tube en communication avec une machine pneumatique pendant que la gélatine est encore liquide et on ferme en (a). On roule le tube d'après la méthode d'Esmarch. On peut aussi coucher simplement le .tube sur le côté et avoir une culture sur

Fig. 150.

Tube de Roux pour la culture des anaérobies sur plaques

de gélatine, dans un gaz inerte.

plaque. On puisera avec une aiguille de platine les microbes des colonies par l'ouverture (a) du tube dont on aura cassé la pointe ; on pourra, si cela est nécessaire, couper longitudinalement le tube et détacher la gouttière supérieure lorsque la gélatine aura été simplement refroidie en plaque et non roulée en Esmarch ; la gouttière inférieure sera alors traitée comme une plaque ordinaire.

Pour éviter l'emploi d'une machine pneumatique, Roux a conseillé le tube représenté figure 150. On remplit de gélatine liquide et ensemencée avec un petit entonuoir capillaire. On étrangle alors en (a) et (a'), on pousse les tampons de ouate (A) et (A'), on effile en (b) et 6') et on met(6) en rapportavec une source d'hydrogène. On ferme dans le gaz en {b') puis en (6). Le tube peut alors être simplement couché horizontalement pour avoir une petite plaque ou roulé par le procédé d'Esmarch.

Quels sont les caractères, utiles à la différenciation de l'espèce, fournis par Texamen macroscopique des cultures? Nous allons passer en revue les points principaux sur lesquels doit se porter Tattention du bactériologiste.

1* Aérobiose. — On s'assurera .'d'abord, par les méthodes décrites dans les deux chapitres précédents, si le microbe est aérobie, anaérobie ou facultatif,

2» Rapidité de la végétation. —Tous les microbes ne donnent pas, sur le même milieu, une culture appréciable à l'œil au bout du même nombre d'heures ; les uns poussent très rapidement, d'autres avec une lenteur désespérante. 11 faudra noter avec soin ces différences. Chaque microbe sera, bien entçndu, cultivé sur son milieu favori, et à une température eugénésique. Citons quelques exemples. Koch a recommandé la culture du Vibrion cholérique en solution de peptone (voy. p. 69i) pour faire le diagnostic bactériologique du choléra; en six à dix heures, le vibrion a donné un voile très appréciable avant que les autres microbes des selles se soient développés. On fait, depuis Roux et Yersin, le diagnostic bactériologique de la diphtérie en ensemençant par stries la fausse membrane sur des tubes de sérum gélifié (voy. p. 633). Au bout de seize heures, seul le Bacille de Lôffler doit avoir donné des colonies visibles. D'autres microbes, au contraire, ne commencent à végéter qu^après une longue période d'incubation , le Bacille de la

tuberculose humaine ne donne, soit en bouillon, soit sur sérum ou gélose, des colonies qu'au bout de quinze jours ou un mois (à moins d'acclimatement ou d'artifices spéciaux); toute culture poussant plus rapidement devra être considérée comme due à un autre microbe. C'est surtout en examinant les cultures d'isolement sur plaques de gélatine qu'on se rend compte de ces difTérences dans la rapidité de développement des microbes ; on constate un grand nombre de colonies au bout de deux ou trois jours d'étuve, mais on en découvre de nouvelles encore pendant huit à quinze jours. Il en est de même pour les ballons de bouillon ensemencés avec des liquides dilués ; certains ballons ne se troublent qu'au bout de cinq et huit jours.

8^ Limite des températures eugénésiques. — Chaque microbe a une échelle propre de températures auxquelles sa végétation est possible ; il y a donc une limite inférieure et une limite supérieure de température eugénésique. D'une fanon générale, les microbes poussent entre + 15^ et + 40<*.

La limite inférieure de température eugénésique sert assez souvent à la détermination de l'espèce. C'est ainsi que les microbes qui ont besoin d'une température supérieure à +22®» ne peuvent donner des colonies sur gélatine ; exemple : le Pneumocoque, On a cité des microbes poussant à des températures extraordinairement basses et ne végétant pas aux températures eugénésiques ordinaires (microbes frigoriphiles). Le PneumO'bacillus liquefaciens bovis d'ARLoiNG pousse déjà à + 50.

La limite supérieure a aussi son importance et devra être déterminée en plarant les cultures dans des étuves réglées audessus de+40o*. Nousavons déjàvu (p. 465) que Rodkt avait utilisé la faculté du B. (VEberth et du B. coli, de végétera +44«»5,

* Pour les microbes frigoriphiles, la limite supérieure est bien inférieure à + 40». G. Roux a trouvé, dans l'estomac de l'escargot, des microbes végétant bien à + 15» ou -f 18», mais ne poussant pas aux températures avoisinant + 30«.