MÉTHODE DE GOLORATIOX DES SPORES
4^' Coloration des microbes qui ne prennent pas le Gram. — NicoLLE (1892) recommande le procédé suivant : colorer au bleu de méthylène^ plonger dans une solution aqueuse de tanin à 1 /lO, qui insolubilise instanUinémenl la couleur au niveau des éléments: déshydrater; éclaircir; monter.
La solution de tanin s'altère vite, et, en plus, la coloration bleue est peu intense.
Gâhnier (1901) préconise une autre méthode, qyi n'a aucun de ces inconvénients. Fixer la lamelle. Laisser une minute dans la solution de Lugol forte (voy. p. 271). Laver rapidement; colorer au bleu de Kiihne (voy. 260). Faire agir pendant une ou deux minutes (à froid ou en chauffant légèrement) la solution :
Molybdate d'ainaioniaque cristallisé . . . 1 gramme. Eau distillée 10 —
Laver. Laisser refroidir. Déshydrater à l'alcool absolu. Eclaircir à l'essence de girofle. Passer au xylol. Monter au baume.
Ces solutions sont très stables. La coloration est en bleu foncé.
La méthode est applicable aux coupes. Il vaudra mieux employer une solution de Lugol plus faible. Bien laver la coupe dans l'eau distillée après le passage dans le molybdate.
B. Coloration des spores. — Dans les cultures examinées sans coloration, les spores se présentent comme de petites granulations réfringentes, sphériques ou ovoïdes. On les voit, par exemple, très bien dans les cultures de B, du tétanos.
En colorant une préparation avec les méthodes ordinaires, les spores restent incolores, formant des taches claires dans les bacilles colorés; elles sont très résistantes.
BrcHNER et HuEPpE ont simultanément découvert un moyen de les colorer. On sèche la lamelle, et on la chaufTe longtemps (15 minutes à 1 heure à + 180", ou dix fois sur la flamme) ; les spores se colorent vivement (violet phéniqué ; 15 à 30 minutes), l«»s bacilles ^'estent presque incolores. La membrane de la spore a été modifiée par le chauffage. Mais on ne peut ainsi colorer que les spores seules.
PRÉCIS DE BACTÉHIOLOOÎE. 5« édit. 18
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Pour tivoir une double coloration, on peut opérer ainsi. Faire passer dix fois la lamelle sur la flamme. laisser pendant une heure dans la solution chaude de fuchsine anilinée d'Elirlich (p. 266). Laver. Décolorer dans la solution :
Alcool 75
A. chlorhydrique 25
Recolorer dans une solution aqueuse saturée de bleu de méthylène. Laver, sécher, etc. Les spores sont rouges et les bacilles bleus.
La méthode de Frœnkel est une modification de la précédente. La décoloration et la recoloralion se font par un séjour de une à deux minutes dans une solution unique, dite solution de Frœnkel :
Acide nitrique pur 20 cent, cubes.
Eau distillée 30 —
Alcool à 90» 50 —
Bleu de méthylène saturé 66 —
Méthode de Neisser. — Séjour de dix minutes à + 100* dans la solution fuchsinée de Ziehl (p. 266). Lavage à l'eau. Lavage à l'alcool absolu jusqu'à ce que le liquide n'entraîne plus de fuchsine. Séjour de une minute dans une solution aqueuse de bleu de méthylène.
Méthode de Mœller (la meilleure pour beaucoup d'auteurs). — Séjour de deux minutes dans l'alcool absolu, puis de trois minutes dans l'acide chromique à 5 p. 100, puis de une minute dans le Ziehl à chaud. Laver. Séjour de dix secondes dans l'acide sulfurique à 5 p. 100, et de une minute dans la solution aqueuse do bleu .
On peut ensuite obtenir une triple coloration en colorant le fond de la préparation.
S.\L0M0NSEN fait justement observer que les différentes spores ont de grandes difTércnces d'aptitude à prendre les matières colorantes.
Nous conseillons, comme la meilleure des méthodes, celle de
