MÉTHODR GÉNÉRALE DE COLORATION

On prend deux lamelles bien sèches, et on dépose sur le centre de l'une d'elles la goutte de culture ou d'exsudat, ou la parcelle de tissu, de pus, de crachat, de dépôt, etc., destinée à être écrasée. Les cultures solides sont au préalable délayées, dans une goutte d'eau distillée et stérilisée, à l'aide d'un verre de montre ; les liquides pathologiques peuvent être centrifugés. On recherchera de préférence les parties solides des crachais, des exsudats. On recouvre la première lamelle avecune seconde, et on fait glisser alternativement l'une contre l'autre les deux lamelles en les serrant entre le pouce et l'index. Lorsque la goutte liquide parait uniformément étalée, lorsque le frottis est suffisamment écrasé, on sépare brusquement les deux lamelles par glissement, et on saisit chacune d'elles avec une pince Cornet (fig. 173)'.

' 11 est quelquefois intéressant de constater le groupement naturel des microbes d'une culture solide. Koch a employé la préparation par tmpresaion (Klatschpreparale) pour étudier les colonies du B. tuberculeux. On applique légèrement une lamelle sur la face supérieure d'une colonie qui s'accole au verre (voy. p. 454).

B. Dessiccation. — Pour opérer la dessiccation il suflit de laisser la pince et sa lamelle à Tair libre, sous une cloche pour éviter les poussières; mais la dessiccation est longue. On peut l'activer avec un soulUet (poire en caoutchouc) ou en mettant la lamelle à l'étuve (+ 37").

On utilisera aussi la platine chauffante (fig. 174).

C. Fixation. — On doit fixer solidement la préparation à la lamelle, pour que les manipulations ultérieures ne l'entraînent pas. On obtient cette fixation en coagulant les matières albnminouUs par la chaleur; il .se produit une véritable rétraction qui fait adhérer au verre. C'est le temps le plus délicat des préparatifs de la coloration; si on chauffe trop, le protoplasma ne Vwa plus les couleurs. On obtient une fixation excellente en mettant la lamelle dans une étuve à + il5"; on préfère, pour aller plus vite, la passer simplement au-dessus de la llamme

fl>i EXAMEN lllCROSCiiPlUl'K DK> MICRuBES

d'une lamp** à alo^il ou «l'un bec BuD^en. en la tenani entre ileuxdoiuts «»u mieux au huul de la pinre (^rnel. On promène lenlenient la lamelle en la faisant pa^>er Irois fois sur la

FiK. 174.

liât me ihaiiffanle.

Ilamme. le oôt».' «I»* la pn-paratiou en lair. - comme si on coupai l du pain •• K«k:h . Os liuis pa><ii::e< ^uHisent à porter la lamelUîà -u I2»r". La Itxalion osl lr^> diflicile si le bouillon de • ullure couleiiait de la 2lyc»''rine 'cultures de Bacille;^ de jKocA>. On peut au-'M tixer à V'i^c "'l élher parties égales' ou au

fhl'nttfnnnr.

D. G»LMisATi»i\. — Deux proc»»d»'"i >«»nl employés. Le premier rMii-^i-l».' îi faiir titmbt'F avec un compte-coulles i|uelques L'oulte^ «le la sululiou colorante >ui- la lamelle maintenue, au moyen d** la pince Cornet, la f.o>» util»^ vi\ haut. Dans le second procéii»'-. 1.1 laiin-lle »^>l pl^niiée. la face utile en l>as, dans un verre de montie conl»Miaiit la solution colorante.

a. Les hfiin:i ré>lntfinls >ihij>ic< <e compo>enl d'une solution d'une couleur d'aniline riu»l« onijut' :

Solution ;iItu«'lii|iJO Eau . .

MÉTHODE GÉNÉRALE DE COLOnATlON 205

dans laquelle on laisse la lamelle pendant deux à dix minutes.

Pour obtenir une coloration plus intense on laisse la lamelle pendant vingt-quatre heures dana le bain à froid *, ou pendant dix minutes dans le bain chauffe jusqu'à production de vapeurs. Ce chauffage (Koch, Lôffler) se fait dans une étuve à + 50^, ou en mettant le verre i\o montre au-dessus d'une flamme. On se sert alors de verres de montre rodés (ju on recouvre lierméli(iuement, ou mieux encore de capsules en porcelaine ou en platine.

b. Vn autre procédé consiste à employer un mordant (i»rocédé imité de la teinture) qui, se combinant à la fois avec la matière colorante et Télément cellulaire, les unit plus intimement. (Citons parmi les principaux mordants :

... s acétique.

A cul es ] ,. '

/ oxaucpie.

A. pliènique i\ 5 p. ll)0 (Ziehl). Créohole.

Tanin k 2o p. 100.

Iode en solution iodo-iodurée.

Itichlorure de mercure.

Totassc à 0,01 p. 100 (Koch, LôKKLEni.

., ,. \ Ammoniaque.

Aniline (Eiirijch. 188i).

Etc.

L'huile d'aniline e.st blanche lorsiju'elle est bien pure, mais brunit très facilement. On fait un mélange de une partie d'huile pour vin^'t deau, on agite fortement, un laisse reposer cinq minutes, et on liltre sur papier mouillé jusqu'à clarilication. On appelle eau d aniline le produit de la liltration; il peut .se conserver assez longtemps. L'eau d'aniline est de moins en moins utilisée.

On emploie couramment [et presque uni(|uement) lesli(iuides à mordants pour toutes les colorations. On devra préparer les suivants :

' On se sert alors de godets en porcelaine s'euiboîtant les uns dans les autres pour éviter l'évaporation.

200 EXAMEN MICROSCOPrOt'E DES MICROHES

!'• Liquide phéniquc de 2iV?/</ (!S82' :

Fuchsine ou rubine 1 grauime.

Acide phénique neigeux 5 —

Alcool tt %• 10 —

TriUirer d'abord la fiichisuo et raloool; ajouter l'acide phénique: agiter jusqu'à dissolution. Ajouter :

Eau 90 cent, cubes.

Attendre vingt-quatre heures. Filtrer. Mettre en flacon compte-gouttes.

Ce liquide colore tous les microbes à froid en quelques secondes, sauf le Bacille tuberculeux qui exige une plus longue exposition (voy. p. 293). Il ne doit être employé que pour la coloration des cultures, car le phénol détermine des grumeaux dans les préparations de sang, de pus. d'exsudats. Il colore cependant bien le Pneumocoque avec sa capsule dans le sang du lapin ou de la souris.

2^ Bleu phénique de Kithnc :

Bleu de méthylène 1 gramme.

Acide phonique neiiroiix 1 —

Alcool abs(Wii 40 cent, cubes.

Eau iOO —

Liquide à placer à coté de celui de Zikiil. :V' Bleu alcalin de Lof fier (1884) :

Sol, alciMtlique de bleu de méthylène. . 30 cent, cubes.

Potasse 0 ce. 01

Eau iOO cent, cubes.

4'* Xiolcl aniliui- ti'Khilich, Wci'jcr: :

Solution ah'OiOique saturée de violet de

gentiane ou de violet de methxle. . . o cent, cubes. Kau d'aniline 100 —

à mélanger au moment île Teniployer.

MÉTHODE OÉNÉHALE DE COLOnATION 207

5'^ Thionij^e phéniquée (Nicolle) (voir p. 291) :

Solution saturée de thionine dans alcool

à 50° 10 cent, cubes.

Eau phéniquée à 1 p. 100 100 —

C'est, peiit-^tre, le plus usité des colorants ordinaires. 6"^ lUeu de Baux. — Préparer séparément chacune des deux solutions :

Violet dahlia 1 gr.

Alcool absolu 10 —

Eau distillée . Q. S. p. 100 —

Vert de méthyle .... 2 gr.

Alcool absolu 20 —

Eau distillée . Q. S. p. 200 —

Au bout de vingt-quatre heures, les mélanger. Filtrer. Conserver en flacon bien bouché.

Toutes ces solutions doivent être filtrées au moment de s'en servir. On verse sur un petit entonnoir garni d'un filtre, et on fait tomber directement sur la lamelle.

c. Dans les vieilles cultures, surtout en bouillon, existent des matières précipitées qui se colorent comme les microbes et nuisent à la netteté de la préparation. On peut remédier à cet inconvénient.

Thoinot et Massklin, colorent à la fuchsine phéniquée de Ziehl pendant cinq à quinze minutes, rincent et sèchent. Ils plongent ensuite la préparation dans de Vhuile d^aniline jusqu'à décoloration en apparence totale, puis font passer dans Vesscnce de bergamote ou de girofle et enfin dans le xyloL

GuiRAUD et Gautié (1901) recomTent la lamelle d'une solution aqueuse saturée de bleu d'aniline et chaulTent jusqu'à dégagement de vapeurs, à deux ou trois reprises. On lave à grande eau. La lamelle paraît complètement incolore. L'opération ne dure pas cinq minutes. Seuls les microbes sont colorés.

E. Dkcoloratiox, doubles COLORATIONS. — a. Le plus souvent la coloration est terminée, et on passe de suite au lavage. Mais lorsqu'on veut auparavant décolorer la préparation en totalité

OU en partie (voir Colorations apéciaies), on se sert des substances suivantes :

Kau i

Alcool . lorsqu'on redoute les acides.

Glycérine '

Essence de girofle.

Muile d'aniline.

Acidi; acétique, 0.5 à \ p. 100.

— chlorhydrique, 10 gimttes par 500 cent, cubes d'eau.

— nitrique, i.*) p. 75 (Khrlich).

— suirurique. i5 p. 75 ou 100.

Carbonate de potasse (Kocii).

Alcool-acétone (2 1) (Nioolle).

Ki'iiiNK se sert dVau de litliinc pour neutraliser un liquide de lava^'e acide.

h. Les doubles colorations ne sont naturelleineiit employées (|ue dans les cas où les microbes sont noyés dans des produits pathologie jues, et jamais lorsqu'on examine une culture (sauf pour les cultures sporulêes. On lave et on recolore avec une couleur qui tranche sur la première. Le rouj;e ressort bien sur le vert et le bleu, le violet sur la vésuvine, Téosine, la chryso'uline (.jaune). A côté de ces colorations successives se placent les colorations substitutives: Dans ce cas, le second bain est à la fois décolorant et recolorant pour certains éléments (voy. plus loin). Les colorations électives n'employent qu'une seule matière eolorante cpii colore dilTéremment les éléments. Le violet de uiéthyle colore en violet les noyaux et les microbes, et en rouge la subslanre amyloïde; le vert de méthyle colore en vert noyaux et microbes, et en violet la substance amyloïde. En rolorant avec du bleu de mélhyle un lambeau de mésentère iluni' >ouris morte île péritonite suppurée à Staphylocoques^ on voit les microbes en bleu, et certaines cellules conjonctives (.W(ï>7:c//e'MirKHHi.icH^ présentant un noyau incolore et des granulations J»aso[diilt»s^ \ioleltes. Le bleu de méthylène colore en violet les cellules adipeuses. B.vbks a vu certains microbes colorés en bleu avec des points rouges par le bleu de méthylène.

On peut, enlln, mais surtout avec les coupes, obtenir des triples et quadruples colorations.

METHODE DE ÛRAli 269

Ce 5«» temps variera seul dans les méthodes de colorations spéciales.

F. Lavage. — On lave à Peau, soit en agitant la lamelle dans un verre à pied rempli d'eau, soit en faisant couler sur la face colorée Feau de la pissette (fig. 172). Si la coloration reste trop intense, on peut laver rapidement à l'alcool.

G. Montage. — Pour monter la préparation, il faut d'abord reconnaître le côté de la lamelle qui est recouvert par la préparation ; on gratte dans un angle avec une One aiguille à dissociation. Si la préparation ne doit pas être conservée, on se contente de déposer une goutte d'eau sur une lame, et d'appliquer la lamelle encore humide, après avoir essuyé la face qui regardera l'objectif. Si on veut conserver la préparation, il faut encore une série de manipulations. On éclaircit avec une goutte de térébenthine, d'essence de bergamote ou d'huile de cèdre. Il ne faut pas employer les huiles éthérées, et spécialement l'essence de girofle, qui décolorent les microbes. On desséchera la lamelle, comme en B, avant de l'éclaircir. On monte ensuite au baume du Canada dissout dans le xylol; (les baumes au benzol ou au chloroforme font disparaître les couleurs d'aniline.) Il est commode de se servir du baume contenu dans des tubes métalliques compressibles; on débouche, on presse, une goutte tombe sur la lame. On aura soin de ne pas emprisonner de bulles d'air. Il est inutile de luter les préparations. Elles se conservent ainsi pendant six mois environ. A la longue, le xylol dissout les matières colorantes.

On ne montera jamais à la glycérine qui dissout rapidement les couleurs d'aniline, sauf le brun de Bismarck.

2" Colorations spéciales. — Certains microbes jouissent d'affinités spéciales pour certaines solutions colorantes.

A. Méthode de Gram*. — 1° Méthode primitive . —Cette méthode * Gram, Forlsch. der Medicin, i884 p. 185.

imaginée par Gram, en 1884, est basée sur la propriété qu'a Fiode de former avec le violet un nouveau composé qui a une atlinité parliculière pour certains microbes, et colore beaucoup moins les tissus que le violet aniline. Elle sert de caractère très important pour la diagnose des espèces.

Microbes Microbes uui ne prennent pas ls

QUI prennent lb Gram. Gram (restent incolores).

Gonocoque.

Vibrion cholérique.

B. typhique.

B. coll.

B. pyocyanique.

B. de la morve.

Ba«*ille du chancre mou.

Bacille de la pseudo-tuberculose.

B. de la peste, etc.

Staphylocoque pyogène.

Streptocoque pyo*?ène.

Pneumocoque.

Bacille de Lôfllcr.

Bacillus anthracis.

Bacille de Nicolaïer.

Bacille tuberculeux, etc.

On colore pendant cinq minutes avec la solution d'Ehrlich (violet aniline, p. 266), puis on plonge dans la solution de Lugol : •

lodure de potassium â grammes.

Iode 1 —

Eau 30) —

jusqu'à coloration noire (une ou deux minutes). On lave ensuite à plusieurs reprises dans Talcool absolu jusqu'à décoloration : ce troisième temps est quelquefois^très long. Les tissus et les microbes qui ne « prennent pas le Gram » sont décolorés. On peut recolorer le fond. On éclaicit par le xylol, etc.

2^' }féthode de Gram modifiée par yicoUe ^ISOo-. — 11 vaut mieux employer la méthode de Gram avec les modilications suivantes. Le violet phcniquc inaltérable est substitué au liquide d'Ehrlich; la solution de Lwjol est plus forte ; Valcool-acètone inaltérable, et décolorant très rapidement, est substitué à l'alcool. L'opération est plus rapide, plus sùio ; les préparations ne brunissent pas à la loniîuo. ot la IrîpK' ooloralioii est possible ^voy. coupeji, p, i02\

Fixer la lamollo à Valcoolt-thcr ^parties égales).

METHODE DK GRAH 271

Plonger, quatre à six secondes, dans le bain :

Soi. saturée de violet de gentiane dans

alcool à 9o** .• . iOcent. cubes.

Eau phéniquée à 1 p. iOO . iOO —

Plonger, sans laver, quatre à six secondes, dans le liquide de Lugol fort :

lodure de potassium 2 grammes.

Iode ^ —

Eau dislillée 200 —

qu'on renouvelle une ou deux fois.

On décolore par Talcool absolu additionné d'un tiers d acétone [alcool-acétone).

Si on veut une double coloration (exsudats, frottis), ou fait agir rapidement la solution :

Sol. saturée d'éosine dans alcool à 9>. 50 cent.' cubes. Alcool à 95». • ! ... 100 —

Laver, déshydrater, monter.

Si on a un mélange de deux organismes dont l'un prend le Gram, et l'autre non {Gonocoques et Staphylocoques par exemple), on recolore avec :

Sol. saturée de fuchsine dans alcool

à 95» 5 cent, cubes.

Eau dislillée 100 —

à la place de l'éosine qui ne donnerait qu'un fonds diffus.

La figure 175 montre une préparation colorée parla méthode Gram-Nicolle. Les cellules, les Gonocoques (qui ne prennent pas le Gram) sont rouges, les Staphylocoques (qui prennent le Gram) sont re.stos violets.

3*^ Méthode de Claudius. — On doit la rapprocher de celle do Gram. Elie n*a sur elle aucun avantage. Les microbes qui prennent le Claudius sont les mômes que ceux qui prennent le Gram et inversement. Peut-être la met hode de Claudius sera

elle plus sûre pour le V. seplique elle B. du charbon symptomatiquc qui prennent ditiicilement le firam. On colore, pendant une minute, avec le violet de gentiane

Fig. 175.

Préparation d un pus blennorragique coloré par la méthode

de Gram-Nicolle.

Los fiioioco'fiif'n >on\ rousTfs cl iiilraccllulaircs; \e«> Staphylocoques pyogènes sont violols el cviraccllulairos. Gr. = 1 Vih» D.

plicnitmr. On lave, on êgouUe. On fait agir, pendant une minute, la solution :

Solution satiiri'c diioide picriqiie ...... 4 vol.

Kau ilislilleo 1 —

On enlève Fexcrs avec du papier tiltre. On décolore avec du chloroforme ou de \\\<scuce de <; in )/îf jusqu'à ce que le réactif ne se teinte [dus en bleu. On monte au baume.