DECOUVERTE DES PRODUITS SOLUBLES

parisienne de la soustraction a duré jusqu'en janvier 1 887, époque à laquelle Pasteur, dans une lettre à Duclaux, se rangea à Topinion de Chauveau, ne pouvant expliquer autrement ses propres découvertes sur le traitement antirabique.

Cette même année 1887 vit surgir les preuves définitives du rôle des produits solubles en pathologie infectieuse. Les expériences de WoLRiDGE, de Salmon et Smith pouvaient être critiquées. Il n'en était pas de même de celles de Charrin, qui annonçait, eu mars 1887, la production de symptômes déterminés par injection des toxines sûrement aseptiques (cultures filtrées) du B. pyocyaniqiie et, en octobre 1887, la possibilité d'augmenter la résistance du lapin, vis-à-vis du B.pyocyanique^^ par injection préalable de ces mêmes substances solubles extraites des cultures. Deux mois plus tard (décembre 1887), Roux et Ghamberland vaccinaient contre le Vibrion seplique avec les produits solubles retirés des cultures. 1/année suivante (février 1888) Roux démontrait que le B. Chauv<ei fabrique aussi des substances immunisantes ; Ghantemesse et Wiuau faisaient des travaux analogues avec le B. typhique. La vaccination chimique était mise hors de toute contestation. Gette même année 1888 vit naître la découverte, par S. Arloing, de la nature diastasique de certains de ces produits solubles.

On sait le nombre immense de travaux parus depuis cette époque sur le rôle et la nature des produits solubles microbiens. La voie ouverte par Toussaint et Chauveau a conduit au chapitre le plus important de la pathologie infectieuse expérimentale, prélude indispensable de l'étude des lésions microbiennes, des symptômes infectieux, de la vaccination, du sérodiagnostic, de la sérothérapie, etc. Le microbe est, avant tout, un fabricant de toxines ; la maladie infectieuse est une intoxication; la vaccination, la prédisposition sont des actes chimiques : telles sont les idées dominantes de la science bactériologique actuelle.

2<^ Produits extra et intra-protoplasmiques. — Insistons d'abord sur un point capital. Une culture microbienne peut ne pas contenir de toxines dans sa partie liquide, bien que le

334 PRODUITS 80LUBLBS IfIGROBIBXS

microbe ait fabriqué des substances très toxiques. En d'autres termes, la culture filtrée peut paraître inofTensive, saos qu'on puisse refuser au microbe la propriété toxigène. C'est que certains microbes sécrètent des toxines qui diffusent hors de leur protoplasma et se répandent dans les liquides nutritifs {véritables toxines solubles, extraproloplasmiques), tandis que d'autres conservent ces toxines dans leur protoplasma ; t7 n'y a pas de diffîision; il faut extraire ces toxines intraprotoplaS' miques {poisons des corps des microbes) à Taide de procédés spéciaux.

La plupart des produits solubles que nous étudierons sont des taaôiies eTtnt|Nre4iq^lftsiiki<{iies ijioisons diphtérique, tétanique, etc.). On peut citer, parmi !es intraproioplasmiques : les tuberculineSy la malléine, différents vaccins extraits du corps du bacille de la peste (vaccins de Hafpkine, de Terni et Baxm)^ etc.

Les microbes morts sont toxiques à des doses qui varient^ suivant les espèces, de quelques milligrammes à des grammes. Ils peuvent occasionner un empoisonnement aigu par libération de leurs toxines ; ils peuvent engendrer des lésions. C'est ainsi que l'inoculation de Bacilles tuberculeux morts produit des tubercules (non réinoculables), comme Font vu Pruoden et HoHDENPYL, Straus et Gamaleia.

Pour extraire les poisons des corps microbiens, on s'est adressé à la macération, à l'expression. On trouvera ces procédés à propos de chacun des microbes (Deuxième partie). On se contente, le plus souvent, d'injecter la totalité de la culture tuée par la chaleur : liquides et cadavres microbiens. Parfois on utilisera les humeurs riches en germes, stérilisées.

Il n'y a pas toujours de limite bien tranchée entre les toxines solubles proprement dites et les poisons des corps microbiens. Telle toxine diffuse, mais diffuse imparfaitement et lentement.

3^ Propriétés des produits solubles microbiens. — Les

produits solubles microbiens, quelle que soit leur nature intime, peuvent se diviser en deux grandes classes suivant qu'ils engendrent la maladie ou qu'ils modifient simplement le terrain organique en vue d'une infection ultérieure.

A. Produits solubles toxiques. — La première classe comprend les produits toxiques^ les toxines dans la plus large acception de ce mot. Les toxines engendrent la fièvre, les hémorragies, les inflammations de toutes sortes, etc., les lésions et symptômes, en un mot, de toutes les maladies infectieuses. Les cultures filtrées des microbes pathogènes produisent chez Tanimal des effets identiques à ceux causés par Tinoculation de la culture complète (culture complète signifie Tensemble des produits solubles et du microbe vivant).

Citons quelques exemples. Gharrin a reproduit tous les symptômes et toutes les lésions de la maladie pyocyanique avec les toxines du B. pyocyaneus. Arloing a étudié les effets phlogogènes d*une diastase sécrétée par le Pneumobacillus liquefaciens bovis, les effets gangreneux des produits du Bacillus heminecrobiophilus. De Ghristmas a fait du pus avec une diastase provenant de Staphylocoque pyogène. Knud Faber a reproduit les contractures tétaniques avec la toxine du B. de Hicolaier, Roux et Yersin ont fait des paralysies avec la toxine diphtérique. J. CouRMONT et RoDET* ont fait, avec la culture filtrée du Staphylocoque pyogène : des contractures, de Fanesthésie, du Cheyne stokes, des troubles cardiaques, de l'hypothermie, des néphrites, etc. Les mêmes auteurs ont vu que la toxine du y. septique a une action inhibitrice sur le centre inspirateur et que celle du Streptocoque pyogène agit spécialement sur le cœur. Certaines toxines agissent sur les centres vaso-moteurs pour produire soit la vaso- dilatation (ectasines de Bouchard) (Arloing), soit la vaso-constriction (anectasines) (Charri;4 et Gley, Arloing, Morat et Doyon). On a même fait des tubercules avec des cadavres du B. tuberculeux (Prudden et Hordexpyl, Straus et Gamaleia). Il faut nous borner. Ajoutons que la mort est en général le terme de ces intoxications, si la toxine estasses active et injectée à une dose suffisante.

* J. GouRUONT et RoDET. Eludc expérimentale des substances solubles toxiques élaborées par le Staphylocoque pyogène. Soc. de Biologie, 33 janvier 1892. — Revue de médecine, février 1893. Leçons d'An- LOiNG sur la Tuberculoge et les Septicémies. Leçons 7 et 9 sur les Septicémies.

336 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

Il y a, dans un liquide fiilro, non pas une toxine, mais un mélange de toxines (notion depuis longtemps défendue par Bouchard), à effets parfois antagonistes {Slaphtjlocoque pyogène, J. Courmont et Bodet) et qu'il faut alors dissocier.

Les toxines peuvent se subdiviser en deux groupes.

a. Le premier comprend la majorité des produits solubles qui agissent sur l'organisme comme une substance soluble queleonque. Ces toxines à effets immédiats sont des produits volatils pour CuARRiN et Guillemoxat (1902).

6. A propos de leurs études sur le poison tétanique, J. Gourmont et DoYON^ ont attiré Tattention sur un second groupe cpii mérite d'être classé bien à part, en raison des propriétés particulières des toxines qui le composent et dont la toxine tétanique est le type. Ces propriétés sont les suivantes :

1° Période d'incubation constante entre Tinjection de toxine et l'apparition des premiers symptômes objectifs; cette période d'incubation peut être raccourcie, mais ne peut être supprimée ; il y a un temps minimum nécessaire à Téclosion des symptômes. On n'observe aucun accident morbide, pendant des heures, quelle que soit la dose injectée. Cette période d'incubation n'existe pas avec les toxiques connus en physiologie;

2^ Importance relativement faible de la dose injectée, A partir d'une dose donnée, on peut centupler la quantité de poison injectée, on ne raccourcit plus l'incubation. C'est un corollaire de la nécessité de l'incubation. Par contre, la période maladive peut être raccourcie par l'augmentation des doses; la mort est hâtée ;

3^ Importance considérable de la température ambiante. La grenouille n'est sensible à la toxine tétanique que si elle est chauffée ;

4** Existence fréquente y mais non constante, dans le corps des malades de substances immédiatement toxiques , produites par l'organisme, qui réagit contre les toxines à incubation ;

^^ Absence de lésions anatomiques, nécessaires à la production

* J. CocRMONT et DoYON, Société de Biologie, 1893 à 1898. Archives de Physiologie 1896, etc. Le tétanos, monographie, Baillière, 1899.

des symptômes, et qui expliqueraient la période d'incubation.

Ces toxines peuvent être seules (toxine tétanique; J. Courmont et Doyon) ou mélangées à des toxines à effet immédiat {toxine diphtériquCy J. Courmont et Doyon, Enriouez et Haluon). Elles ont d^ailleurs leurs analogues dans certains poisons végétaux qui n'agissent aussi qu'après incubation.

Quelle que soit l'explication théorique que l'on donne de ces propriétés si spéciales de quelques toxines, la classe de J. Courmont et Doyon doit être conservée, avec la nécessité de l'incubation comme principal caractère. On a mt}me tendance actuellement à les regarder comme les seules toxines spécifiques.

c. Pour l'étude des effets des produits solubles toxiques on mettra en œuvre toutes les ressources de la physiologie et de l'histologie. On injectera des doses variables à dilTérentes espèces animales, par des voies multiples, on observera l'animal comme un véritable malade (température, urines, alimentation, amaigrissement, symptômes nerveux, etc., etc.). Le moyen le plus précieux d'investigation sera la méthode graphique introduite en bactériologie par Chauvrau et Arloing, Charrin et Gley, J. Courmont et Rodet. On se servira, autant que possible, de grands animaux. Pour faire une étude suivie des [effets d'une toxine jusqu'à la mort de l'animal, il est indispensable d'opérer avec de grands appareils graphiques, comme ceux qui existent dans les Laboratoires de Lyon, depuis leur création par Chauveau (voir page 4). L'expérience peut ainsi avoir une durée indéfinie, pour ainsi dire sans interruption du tracé. D'Arsonval et Charrin ont recherché les troubles de la calorification produits par les toxines. Arloing et Laulaniê ont fait de même en y ajoutant l'étude des combustions organiques. A l'heure actuelle, un Laboratoire bien outillé de physiologie est indispensable au bactériologiste; celui-ci n'a pas fait le quart de sa tâche lorsqu'il a constaté les propriétés botaniques d'un microbe. Les lésions dues aux toxines seront soigneuse* ment coupées et examinées au microscope (p. 287); il faut donc être également histologiste.

CHARR!^ et Levaditi (1899) ont attiré l'attention sur l'influence du titre isotonique ou anisotonique des solutions minérales sur PRÉCIS DE DACTénioLOGiE, â« édit. ââ

338 t»RODUITS SOLUBLES MICROBIENS

Tactivilé des toxines dissoutes dans ces solutions. L'anisotonîe favorise Tintoxication; les produits microbiens pénètrent plus rapidement les cellules.

rf. A côté des toxines, Ehrlich a créé le groupe des toxoïdes et des toxones. Les toxoïdes sont des produits de transformation des toxines, ayant une composition analogue, et qui existent dans les cultures filtrées alors que les toxines ont disparu ou, tout au moins, se sont considérablement atténuées. Ces toxoïdes peuvent, comme les toxines, servir à l'immunisation ; ils peuvent neutraliser les antitoxines. Ils produisent des symptômes différents de ceux de la toxine. Ce sont des toxines masquées dans Je mélange par la toxine principale. Les toxones ne sont pas le produit d*une transformation des toxines; ce sont des corps créés concurremment par le microbe et pouvant occasionner des troubles sérieux (parai, diphtériques).

Ces expériences ont été faites sur la toxine diphtérique (voy. p. 625).

Il faut ranger parmi les produits solubles toxiques, ceux qui ont la propriété de détruire les globules blancs (leucocidiîies) ou les globules rouges (hémolysines).

e. Leucocidines, --Si on inocule du Staphylocoque pyogène dans la plèvre d'un lapin, l'exsudat pleural, d'ailleurs très riche en leucocytes dégénérés, altère les leucocytes normaux qu'on lui ajoute. Un chauffage de 10 minutes à + 58" ou + 60° détruit cette propriété. La leucocidine existerait, à petite dose, dans les cultures (Van de Velde, Krauss, Neisser, Bail).

L'exsudat péritonéal du cobaye, inoculé par cette voie, avec du B. pyocyanique, jouit des mêmes propriétés,

f. Hémolysines. — La culture filtrée du B. tétanique contient de la tétanolysine (Madsen), qui disparaît d'ailleurs vite. Les hématies du cheval et du lapin sont spécialement sensibles.

Il existe aussi une pyocyanolysine dans les cultures filtrées du B. pyocyanique (Bulloch et Hunter). Un chauffage de 15 minutes à -f- 100^* la détruit. Les globules rouges de beaucoup d'animaux sont sensibles.

Neisser (1901) a signalé une staphylolysine ; les cultures filtrées de neuf à treize jours dissolvent les hématies du lapin.

PfiUPRIÉTBS DES PRODUITS SOLUBLfiS 339

Pour lui, sa production est un caractère constant du staphylocoque typique.

Le Streptocoque de Mamiorek fabrique in vivo sur le lapin une hémolysine très active. Besrkdka Fa reproduite in vitro (p. 743).

B. Produits solubles vaccinants ou prédisposants. — Le second groupe des produits solubles microbiens comprenez ceux qui, toxiques ou non, modifient la réceptivité du terrain animal qu'ils imprègnent, vis-à-vis d'une infection ultérieure.

Les uns sont raccwanfs (Toussaint, Chauveau, Charrin, etc., etc,), et ce sont les plus nombreux. On vaccine ranimai contre le tétanos, la diphtérie, le choléra, et contre la plupart des infections en lui injectant des doses progressivement croissantes de cultures filtrées des microbes de ces maladies.

Mais il existe aussi des produits solubles qui ont un effet inverse, qui sont prédisposants. J'ai découvert cette classe de produits solubles en 1889^. Les cultures filtrées d'un bacille tuberculeux du bœuf que je venais d'isoler (sans rapports avec le bacille tuberculeux de Koch; voy. p. 517) introduites sous la peau d'un cobaye ou d'un lapin, à la dose de 1 centimère cube par kilogramme, rendaient pour longtemps ces animaux prédisposés à l'action du bacille dans la proportion de 1 à 16; ceux-ci mouraient 16 fois plus vite que les témoins. J'ai retrouvé, avec Rodet, ces mêmes produits solubles prédisposants dans les cultures du Staphylocoque pyogène. Bouchard les a constatés dans les cultures du B. pyocyanique^ et Roger dans celles du B. Chauvœi et du Streptocoque pyogène.

Ces produits prédisposants peuvent être mélangés à des produits vaccinants (J. Courmont et Rodet, Roger).

C. Nous résumerons les notions précédentes sur les propriétés des produits solubles dans le tableau suivant :

' J. GoUBMONT, Substances solubles prédisposant à l'action pathogène de leurs microbes producteurs, Ac. des sciences, 22 juillet 1889, Soc. de Biologie. 21 déc. 1889, Revue de médecine, oct. 1891, Soc. de Biologie, 21 mars 1891, et Ac. des sciences, octobre 1891.

340 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

Exemples :

I ' ToxiDcsàelTcUimniéd. Presque tous les microbes.

/ Toxiques . . ^ Toxines à incubation B. lélanique, etc.

I ( Toxoncs. ToxoVdes. B. diphtérique.

1 Uueocidinei ^ Staphylocoque pjogènc.

I ( B. pyoeyaniquc.

I ' B. tétanique.

I „. , . \ B. pvocvanique.

PRODUITS P"^'»"»" ) Sl.phyl<«o,u. pyogtae.

\ Streptocoque de MarmorcL.

SOLUBLES \ Vaccinantj Presque tous les microbes^.

I ^ .■ .ti . i ^- Chauvœî.

f . à action immédiate \ jj pvocvanique.

f \ »""« Pa^agère. ) stapi,ylico.,ue pyogène.

Prédisposants f - b. tuberculeux de J. Cour-

I I i action lente \ mont.

\ ' mais durable. à Staphylocoque pyogène.

\ \ . Streptocoque pyogène.

4^ Nature des produits solubles microbiens. — Au

moment de la découverte du rôle des produits solubles microbiens en pathologie infectieuse, on savait bien que les microbes pouvaient sécréter des ferments solubles, des diastases digestives ou autres ; mais on ne croyait pas que les produits solubles toxiques ou vaccinants puissent appartenir à cette classe de substance. On ne pensait qu'aux ptomaïnes.

a. Depuis les recherches de Panum (4856), de Bergmakn et ScHMiEDEBERG (1868), de A. Gautier (1872), de Selmi, de Nencki, etc., on avait Tattention attirée sur les alcaloides toxiques qu'on pouvait retirer des substances putréfiées, du pus, etc., et qu'on appelait ptomdines^, ou que sécrétaient les cellules des organes sains [leucomaines).

Le terme de « ptomaïnes » devrait, d'après Hugounenq, être réservé aux bases alcalines qui se produisent pendant la putréfaction cadavérique ; le terme général doit être : toxines alcaloïdiques.

Les toxines alcaloïdiques sont des corps basiques (GHAz ou CHAzO), qui se dissolvent bien dans l'alcool, l'éther et les dis-

* Les ptomaïnes sont « les déchets ultimes, provenant de la désagrégation, graduelle et par voie d'hydratation, des matières albuminoïdes attaquées par les microbes de la putréfaction». (IIogounekq.)

solvants des substances riches en charbon. Elles se combinent aux acides pour donner des sels solubles, bien cristallisés. Elles s'unissent au chlorure d'or et au chlorure de platine. L'oxygène, la lumière, les acides en excès les altèrent. Elles sont précipitées par l'iodure de potassium ioduré, le tanin, l'acide picrique, etc. Elles ont la réaction de Selmi.

Les alcaloïdes oxygénés (CHAzO) cristallisent à Tétat de liberté ou à l'état de sels. Ils se dissolvent médiocrement dans l'alcool (exemple : choline).

Les alcaloïdes résistent à de hautes températures.

Ne parlons que des toxines alcaloïdiques retirées des cultures pures. Brieger isola des ptomaïnes toxiques des cultures du B. typique, du Staphylocoque pyogène, du Bacille de Nicolatery (4 alcaloïdes basiques), du Vibrion cholérique, Lkber fit du pus avec une ptomaïne retirée des cultures du Staphylocoque pyogène. Bref, on recherchait systématiquement les produits solubles microbiens dans le groupe des alcaloïdes.

b. C'est alors qu'ARLOiNG^ découvrit la nature diastasique des produits solubles phlogogènes contenus dans les cultures du PneumO'bacillus liquefaciens bovis, et dans la sérosité du poumon de bœuf atteint de péripneumonie. La voie était ouverte; la classe des substances solubles albumosiques, ayant des propriétés pathogènes, des toxalbumines, était créée. Qr, à l'heure actuelle, presque toutes les toxines sont considérées comme des corps albumiooïdes; les ptomaïnes existent, mais ont une importance bien moindre en pathologie.

A la suite des travaux d'ARLOiNG, on découvre coup sur coup : la diastase pyogène du Staphylocoque pyogène (de Christmas), les propriétés diastasiques des substances vaccinantes du sang charbonneux (Roux et Chambkrland), des toxines diphtérique (Roux et Yersin) et tétanique (Knud Faber), des produits solubles du Bacillus heminecrobiophilus (Arloing), d'une partie lies toxines du Staphylocoque pyogène (J. Courmont et Rodet), etc. Hugounenq et Eraud font une étude soignée des toxines de

' Arloing, Ac. des sciences, 7 mai et 18 juin 1888.

342 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

ÏOrchiocoque (1891-1893) et en retirent une substance phlogogène voisine des peptones.

Ce sont donc les toxalbumines qui jouent le rôle capital en pathologie infectieuse. Ce sont des corps amorphes, solubles dans Talcool faible, insolubles dans l'alcool absolu, Téther, le chloroforme, la benzine, le sulfure de carbone, etc. Ils sont très solubles dans Teau. La plupart, à Tétat de solution dans Teau, s'altèrent à + 65*». Leur composition est très mal connue. Ils sont quaternaires avec soufre et phosphore. Beaucoup se comportent comme de véritables albumines; beaucoup ont des propriétés zymotiques. Ces différents corps ont, en somme, entre eux des analogies plus apparentes que réelles, et semblent s*éIoigner des véritables matières albuminoïdes par leur faible teneur en azote. Hugounknu estime que ces substances sont peut-être des intermédiaires entre les albumines vraies et les alcaloïdes. A. Gautier vient de soutenir la même idée^ Les toxalbumines agissent à des doses infinitésimales.

Les toxalbumines microbiennes ont leurs analogues dans les toxines végétales (abrine. ricine) et dans les toxines animaks (venins, sérums d'anguille).

c. Ajoutons que Charrin, Gley, Guillemonat, font jouer un rôle important aux produits solubles volatils.

b^ Origine des produits solubles miorobiens. — On est

encore bien peu fixé sur l'origine des toxalbumines microbiennes. Sont-elles sécrétées de toutes pièces par le microbe, ou ne sont-elles que des transformations des substances albuminoïdes existant normalement dans les bouillons de culture ? Pour résoudre la question il faudrait obtenir des toxalbumines en cultivant les microbes dans des milieux ne contenant pas de substances protéiques. C'est ce qu'ont fait certains auteurs (Arnaud et Charrin, Guinochet, Ouchinskv, etc.), cultivant le B, pyocyanique, le Vibrion cholérique et le Bacille diphtérique dans des milieux dépourvus de substances albuminoïdes (voy* leur composition, page 81). Ouchinsky a retiré de ses liquides

* A. G.\UTiBR, Les toxines microbiennes et animales^ B-J^eauté, 1896.

des toxalbumines ayant les mêmes propriétés que celles qui proviennent des cultures en bouillon. Les microbes pourraient donc fabriquer de toutes pièces, par synthèse, des substances, albuminoïdes en empruntant Tazote à des corps minéraux. Malheureusement les conclusions d'OucHiNSKY n'ont pu être confirmées (Hugounesq, Doyon) ; on ne doit pas encore se prononcer. Il se pourrait, d ailleurs, que les toxalbumines ne soient pas des corps albuminoïdes, mais adhèrent simplement à ces derniers, Briegbr et Baer, dans leur étude des toxines diphtérique et tétanique, concluent que la substance active n'a pas les réactions de Talbumine ou de la peptone et repré-^ sente « un groupement atomique inconnu en chimie ». Peut-v être même les soi-disant toxalbumines ont-elles des propriétés vitales qui les placent au-dessus des matières amorphes !

§ 2. — Préparation des produits solubles .

Pour préparer et isoler les produits solubles d'une culture, il faut opérer en plusieurs temps.

10 Virulence de la semence. — II faut d'abord posséder à l'état de pureté un échantillon, aussi virulent que possible, du microbe dont pn veut essayer les produits. Certains microbes se conservent longtemps avec leur virulence, d'autres (comme le B. tuberculeux) ont une virulence assez fixe; il suffira de les employer tels quels. Le plus souvent il faudra renforcer la virulence de la semence, et ce premier temps sera quelquefois très laborieux.

On renforce, en général, la virulence d'un microbe, en le faisant passer un grand nombre de fois par l'organisme d un animal très récepteur. On arrive ainsi à posséder des cultures d'une activité inouïe; or, les produits solubles en seront toxiques en proportion. C'est Pasteur qui a créé cette méthode, en renforçant le microbe du rouget du porc par le passage dans L'organisme du pigeon, et celui du charbon en le faisant passer par le jeune cobaye.

On a exalté la virulence du Staphylocoque pyogène en le

344 PRonriTs solubles higrohibns

faisant passer par le lapin (Rodkt) ; on injecte la culture dans le sang et, à la mort de Tanimal, on puise la semence dans le sang du cœur; on injecte un nouveau lapin avec la culture très jeune, ou directement avec le sang, et ainsi de suite ; les lapins meurent de plus en plus vite, et les microbes qui en proviennent sont de plus en plus virulents. C'est par cette méthode (d*abord sur des souris, puis sur des lapins) que Marmorek a pu obtenir un Streptocoque tuant le lapin à

100 000 000 "^^ "^^^^ quelquefois ^q^^^oooo **« centimètre cube.

On renforce le Bacille de la diphtérie en le faisant passer par le cobaye. Roux, Metchxikoff et Taurelu-Sammbeni ont e.xalté la virulence du Vibrion cholériquCy au point de posséder des cultures tuant le cobaye à 1/160° de centimètre cube. Pour cela, ils alternent un grand nombre de fois des cultures sur gélose, et des cultures en solution de peplone dans un sac de collodion placé dans le péritoine du cobaye (voy. p. i50].

On n'a pas toujours besoin de faire passer un microbe par l'animal pour lui restituer sa virulence. Arloing et Trughot ont pu renforcer la virulence du Streptocoque en changeant la composition du bouillon. Arloing conseille aussi de faire une sélection parmi les individus microbiens d'une culture. On fait végéter dans des conditions légèrement dysgénésiques, on réensemence dès le premier trouble, et ainsi de suite pendant plusieurs passages. Ce sont les individus les plus vivaces qui ont résisté.

La semence virulente obtenue, il faut la conserver à cet état, ce qui est souvent très difticile. Le Vibrion cholérique^ le Pneumocoqucy perdent très rapidement leur virulence. On cultivera les microbes dans des milieux appropriés. C'est ainsi que Marmorek conserve la virulence de son Streptocoque en le cultivant dans un mélange de sérum et de bouillon [voir p. 90). Il faut surtout réensemencer fréquemment les cultures, le vieillissement étant une des causes les plus sûres de Tatténuation. Il suffira de renouveler tous les quatre à cinq jours des cultures de Staphylocoque pyogène en bouillon ordinaire pour leur conserver leur virulence.

Lorsqu'un microbe est très atténué, on peut l'inoculer en

l'associant h un autre microbe et obtenir ainsi la mort de ranimai (exemple : Tassociation du Staphylocoque au Bacille atténué de la morve).

Il n'est pas prouvé, qu'il soit nécessaire pour avoir des produits solubles très vaccinants^ d'employer une semence aussi virulente. Cette habitude de Fexaltation préalable sera peutêtre à réformer,

2^ Culture définitive. — Lorsqu^on possède une semence bien virulente, il faut choisir les conditions dans lesquelles on fera la culture destinée à être expérimentée pour l'extraction des produits solubles.

Le milieu sera de préférence liquide ^ ; il sera approprié au microbe. On retrouvera, p. 90, et à la deuxième partie les bouillons les plus convenables pour obtenir les toxines les plus communément employées (Staphylocoque pyogène. Streptocoque pyogène, Bacille de Lof fier, B, de Nicolaïer), Le Vibrion cholérique sera cultivé dans sa solution peptonée et gélatinée déjà indiquée (p. 89), avec l'addition d'un peu de sérum. Nous nous sommes servis, avec Rodet, d'un bouillon très pauvre en peptone (simple infusion de viande) pour étudier les toxines du Staphylocoque pyogène.

Il sera bon d'avoir des bouillons assez riches en sels minéraux. On évitera, autant que possible, les sucres dont la fermentation engendre des acides.

La culture est faite en général à + 37®.

Elle végétera, naturellement, dans le vide pour les microbes anaérobies. Hueppe et Scholl croyaient même que le V. cholérique (facultatif) fabriquait plus de toxines dans le vide qu'à l'air ; J. Courmont et Doyon ont vu le contraire. On aura souvent avantage à faire passer un courant d'air à la surface du bouillon de culture étalé en couche mince, comme cela se pratiquait autrefois pour la préparation de la toxine diphtérique (p. 823).

* On a quelquefois extrait des produits solubles de cultures solides : par exemple la tuberculine. de cultures sur agar de Bacilles de Koch, mais ce sont alors des pt^oduils inlvaprotoplasmiques.

PRODUITS SOLTBLES HICROOIENS

L'âge auquel la culture doit être employée, est très variable suivant les microbes. On filtre une culture bien aérée de diphtérie en bouillon ordinaire vers le vingt et unième jour, en bouillon Martin le cinquième jour, une culture de Staphylocoque pyogène vers le vingtième jour (J. Courmont et Rodet), une culture de tétanos vers le dix-huitième ou vingtième jour, une

culture de Vibrion cholérique Y n vers [le quatrième jour (Ror\

et ses collaborateurs) . En principe on essaye, en tâtonnant, P des cultures filtrées à difTérents

^ âges, et on adopte l'âge qui

donne la toxine la plus active.

3<^ Séparation physique des substances solubles .

Stérilisation de la culture.

— La culture est prèle à être employée. 11 faut séparer Tensemble des substances solubles des individus microbiens ; il faut obtenir un liquide débarrassé de tout germe vivant.

Plusieurs moyens ont été employés.

a. Décantation. — Ce serait le procédé de choix s*il n'exposait à avoir une toxine renfermant encore des microbes vivants ; il éviterait l'action toujours nocive des filtres, de la chaleur, etc. Certains microbes, tels que le Streptocoque pyogènCy le B. tuberculeux, ne troublent pas le bouillon, végétant, le premier en flocons au fond du ballon, le second en croûtes à la surface ; on pourrait donc à la rigueur décanter avec soin le bouillon limpide. Pour les microbes qui troublent le bouil-

Fig 1%.

Dispositif d'ÂKLoiNG pour la séparation (décantation, filtration surcoton) des produits solubles du H. anlhracis. (Voy. p. 68).

PRÉPARATION DES PRODUITS SOLUfiLES

Ion, il faut laisser reposer de vieilles cultures dans de hautes éprouvettes. On voit que tous ces procédés sont défectueux, et surtout n'offrent aucune sécurité pour l'asepsie de la toxine. C'est cependant par décantation suivie d'une filtration sur coton (fig. 196) qu'ARLOiNG a pu isoler certaines substances solubles sécrétées par le Bacillus anthracis.

b. Filtration. — C'est le procédé le plus usuel. Nous avons donné tous les détails des procédés de filtration au chapitre H, page 52 et suivantes ; nous n'avons rien à ajouter. Nous rappelons simplement que les filtres en porcelaine retiennent une très grande quantité de produits solubles et peuvent même modifier ceux qui passent (Arloing, Hugounenq, J. Courmont et RoDET, Phisalix, p. 52).

Certaines cultures sont tellement épaisses ou glaireuses que le filtre est vite encrassé ; on fera bien de les filtrer au préalable sur papier. On éprouvera aussi de grandes ditiicultés à filtrer les bouillons glycérines. Pour les liquides peu toxiques, on pourra évaporer dans le vide afin de réduire le volume du substratum.

c. Dialyse. — Ce procédé a été employé par P. Carnot et L. Fournikr (1900) pour étudier les produits solubles ou Pneumocoque. Le principe consiste à cultiver le microbe en milieu liquide contenu dans un vase dont les parois dialysables laissent sortir les toxines et entrer de nouvelles substances nutritives. On peut ainsi maintenir longtemps la végétabilité de la culture et extraire journellement des toxines dont les modifications sont intéressantes à étudier.

Un ilacon (A) (fig. 197) est bouché par un bouchon en caoutchouc percé de deux orifices inégaux. L'un livre passage à un tube de verre (B), percé de trous et tapissé de collodion, absolument comme on fabrique les sacs de collodion (voyez p. 150). L'autre maintient

Fig. 197.

Dialyseur de Carnot et FOURNIER.

348 PRODUITS SOf.UBLBS MICROBIENS

un petit tube en verre (C). Tous deux sont bouchés à la ouate. Le liquide nutritif (D) remplit aux deux tiers le flacon (Â) et le tube (B). Le tout est stérilisé à l'autoclave.

On ensemence rintérieur du tube (B), on prélève les toxines et on ajoute les matériaux nutritifs par le tube (G).

Voyez page 354 et Hg. 199.

d. Chaïuffage. — Un autre procédé consiste à stériliser la culture par la chaleur. On ne peut mettre ce procédé en parallèle avec le précédent. Tandis qu'avec la flltration on n'obtient que les substances solubles sécrétées par le microbe de son vivant et ayant dilTusé dans le bouillon (et même une partie seulement de ces substances), on a, par le chauffage : la totalité des produits solubles soit difîusibles (substances extraprotopla8miques)y soit retenus dans le protoplasma pendant la vie du microbe et que ce dernier abandonne en mourant {substances intraprotoptasmiques). En outre, le chauffage peut modifier profondément les produits solubles, soit directement, soit en faisant sécréter des substances différentes par le microbe pendant sa période d'agonie. Le chauffage doit donc être employé dans certains cas, et la flltration dans d'autres. Certains microbes [B. anthraciSy B. tuberculeux) retiennent leurs sécrétions dans leur protoplasma ; la flltration ne livrerait pas la toxine. 11 est bon> après le chauffage, de filtrer sur papier pour se débarrasser des cadavres microbiens. La température et la durée du chauffage varieront naturellement suivant les microbes et seront toujours réduites au minimum nécessaire. J. GouRMONT et RoDET tueut le Staphylocoque pyogène par un chauffage de vingt-quatre heures à -j- 55". J. Gourmont et DoYON tuent le Vibrion cholérique en l'exposant pendant quarante-huit heures à -|- 53^ Il faut Tébullition prolongée pour les microbes à spores. On obtiendra en général un liquide beaucoup plus toxique par le chauffage que par la flltration (Staphylocoque pyogène) ; cependant, les cultures chaufTées de y. cholérique ne sont pas plus actives que les cultures flltrées (Roux, J. Gourmont et Doyon).

Gitons comme exemple la préparation de la tuberculine brute. On sait que le Bacille tuberculeux se cultive à la surface du

l>ouiIlon glycérine (p. 450). On fait bouillir la culture, au bainmarié, dans une capsule de porcelaine, en agitant fréquemment avec une baguette de verre. Lorsque le liquide est réduit au 1/10^ de son volume, on filtre sur papier. L'ébullition prolongée a tué tous les bacilles. C'est ainsi que la tuberculine est bien, comme Tavait dit Koch d'une façon assez obscure : un

Bain-marie avec régulateur métallique de Roujc.

extrait glycérine de cultures pures de bacilles de la tuberculose ; mais c'est un extrait des produits solubles intraprotoplasmiques des microbes.

Le chauffage d'une culture peut se faire à Tautoclave lorsqu'on a besoin d'une température supérieure à + iOO^*. Sinon, on exposera simplement la culture dans une étuve réglée à la température voulue, ou on chauffera au bain-marie. Nous recommandons le bain-marie, schématisé figure 198, construit par WiRsxEEG sur les indications de Nocard ; il est muni d'un régulateur métallique de Roux (voy. p. 140) qui est contenu dans un manchon métallique traversant l'eau. Ce bain-marie servira encore pour les évaporations, etc., etc.

e. Trituration mécanique des microbes. — La tuberculine préparée par le procédé indiqué par Kogh, en 189i, et que nous venons de résumer, n'ayant donné que des résultats

350 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

désastreux, plusieurs auteurs (Brtsgeh et Proskaiter, Klebs, HuNTER. KiiHNE, RoBMER)ont cherché à la purifier, à en extraire le principe curateur entre?u par Koch. En 1897, Koch * est revenu sur cette question en apportant les résultats de six ans de travail. La première tuberculine était un extrait des substances, solubles dans la glycérine, facilement livrées par le protoplasma microbien. Elle n'était pas bactéricide, provoquait des réactions fébriles, etc. Koch a voulu extraire les substances retenues par le protoplasma microbien, après les manipulations précédentes, et sa nouvelle tuberculine serait bactéricide, ne provoquerait pas de réactions fébriles, guérirait le cobaye tuberculeux, etc. (voy. p. 496).

Voici ses procédés d'extraction.

Les acides minéraux dilués, les alcalis concentrés, employés à Tébullition, détruisent les substances immunisantes et ne doivent pas être utilisés.

La tuberculine A (alcaline) s'obtient en laissant pendant trois jours les bacilles, à la température de la chambre, au contact d'une solution de soude caustique à 10 p. 100. On filtre sur papier et on neutralise. Les bacilles sont morts, mais il en reste un certain nombre dans le liquide. Cette tuberculine a les mêmes propriétés que la tuberculine brute ; elle a, en plus, Tinconvénient de produire des abcès dus aux cadavres bacillaires; il ne faut pas l'employer.

Les autres tuberculines sont obtenues en triturant les bacilles pour en extraire mécaniquement les substances intraprotoplasmiques. Cet écrasement des bacilles tuberculeux est très difficile, impossible si on ne se soumet pas aux règles suivantes. On fait dessécher des cultures dam le vide, et on les triture, sans rien y ajouter, dans un mortier d'agate, avec un pilon de même substance, longuement, jusqu'à ce que le microscope montre la destruction des corps bacillaires. Pendant cette opération, très dangereuse, on vit au milieu de poussières constituées par des bacilles tuberculeux à l'état de pureté. Avec le magma ainsi obtenu, on peut obtenir deux tuberculines.

* Koch, Deutsche medicinische Wochenschritfl, 1" avril 1897.

PnïSPARATION DES PRODUITS SOLUBLES 351

On émulsionnele résidu dans Teau distillée, et on centrifuge pendant trente ou quarante-cinq minutes (4 000 tours par minute). Le liquide obtenu est la iuberculine 0, qui contient les substances solubles dans la glycérine, et se rapproche beaucoup de la tuberculine brute ou de la tuberculineA; elle ne produit pas d'abcès, mais n'est pas immunisante ; elle ne sera pas employée pour le traitement de la tuberculose.

Le précipité boueux, qui est resté adhérent aux parois du vase, après la première centrifugation, est repris, séché à nouveau, retrituré, recentrifugé plusieurs fois de suite. On épuise ainsi presque tout le précipité; la masse entière de la culture des bacilles tuberculeux est successivement transformée en liquides, qui ont les mêmes propriétés (sauf le premier: tuberculine 0). Ces liquides, mélangés, constituent la tuberculine R (résiduelle) qui constitue, pour Koch, le liquide curateur de la tuberculose. Elle est bactéricide, ne produit ni abcès ni réaction fébrile à doses faibles, elle immunise le cobaye et le guérit s'il est déjà tuberculeux. Elle contient les substances insolubles dans la glycérine; elle n'a donc aucun rapport de nature avec les autres tuberculines (voy. p. 496).

Pour que la tuberculine R produise tous ses effets, il faut : i<> posséder une culture très virulente (il y a de grandes différences dans la virulence des cultures môme récentes) ; 2° une culture très jeune ; 3° une culture ayant végété à l'abri de la lumière ; 4*» dessécher dans le vide; 5® employer de suite la poussière obtenue; 6** triturer longuement dans un mortier d'agate; 7** centrifuger avec un appareil puissant.

f. Antiseptiques, — On a essayé de tuer les microbes au moyen d'antiseptiques, mais la présence de ceux-ci dans la toxine est une mauvaise condition d'expérimentation. On a aussi tué les microbes par l'action prolongée du chloroforme.

g. Précipitation. — Les toxines adhèrent à certains précipités. On peut ainsi les extraire du liquide ambiant.

On ajoute, par exemple, au liquide toxique quelques gouttes d'une solution concentrée de phosphate de soude, puis quelques gouttes d'une solution de chlorure de calcium ; le précipité de phosphate de chaux est rassemblé par centrifugation.

352 PRODUITS SOLUBLES MICBOBIEXS

Ce sont surtout les substances diaslasiques qui adhèrent ainsi aux précipités. Cette adhérence est tellement forte que plusieurs lavages successifs ne suffisent pas, le plus souvent, à priver le précipité des propriétés toxiques acquises.

49 Isolement chimique des substanoes solubles. — On

emploie, en général, les produits solubles àTétat de dilution et de mélange dans le bouillon de culture, simplement privé de germes vivants, comme il vient d'être dit. Pour Tétude chimique de ces produits, il faut aller au delà * .

A. Extraction ues toxines alcaloîdiqdbs (dont les ptomaïnes font partie — ptomaïne n'est pas synonyme d'alcaloïde).

a. Extraction pari alcool. — Nous avons l'habitude de séparer les alcaloïdes par la précipitation des substances albuminoïdes au moyen de ValcooL

Voici la marche suivie par Hugounenq et Eraud (1891) dans leur étude des toxines àeVOrchiocoquc. Le liquide filtré est légèrement acidulé à l'acide tartriquo et additionné immédiatement de 15 à 20 volumes, au moins, d'alcool à 95^. On laisse vingt-quatre heures à l'obscurité. On filtre; les substances albumosiques ont précipité et restent sur le filtre. On distille sous pression réduite à + 45<>. Tout lalcool étant évaporé, on acidulé franchement par l'acide tartrique, et on laisse digérer quelques heures à + 45°. On filtre et on lave le résidu à l'alcool fort. On évapore au bain-marie, à + 4S°i jusqu'à consistance sirupeuse. Le sirop est mélangé à 8 ou 10 fois son volume d alcool absolu, pour précipiter les sels minéraux. On laisse vingtquatre heures, on filtre et on chasse l'alcool en disposant la capsule sur l'eau tiède.

Le résidu acide est épuisé à deux ou trois reprises par de l'éther et du pétrole bouillant vers + *0<> qu'on décante à tra-

* Consulter à ce sujet le reuiarquable article de Hugounenq. în Traité de pathologie générale de Bouchard, t. II, p. 243, eh. x, de Tarticle Infection de Charrin. Nous lui empruntons beaucoup. Con^ sulter aussi le chapitre xviii du Précis de Chimie physiologique, de HuGouT^NQ. Doin, 1897. Même bibliothèque.

vers un filtre déjà imprégné de dissolvant. I/élher est abandonné à l'évaporation spontanée.

Le résidu, toujours acide, est repris d'abord par la benzine, puis par le chloroforme.

On alcalinise alors le résidu par un léger excès d'ammoniaque, et on répuise par l'éther de pétrole, la benzine, le chloroforme, Talcool amylique.

On évapore la liqueur mère et on traite le sirop par Talcool fort ; on filtre, et on dissout le résidu dans Teau. On peut encore extraire de nouvelles substances.

On purifie par redissolution et cristallisation.

En général, on se sert d'une méthode moins longue et moins coûteuse pour savoir si les alcaloïdes d'une culture ont des propriétés toxiques. On précipite par 5 ou 6 volumes d'alcool à 95^^, maintenus vingt-quatre heures en présence, on filtre pour retenir le précipité, on évapore ce qui a passé, et on reprend le résidu par Teau. C'est ce liquide qui est injecté. C'est ainsi que nous avons opéré, avec Rodet, pour les alcaloïdes du Staphylocoque pyogène,

b. Extraction par Véther. — On alcalinise par la potasse, et on épuise par l'éther. On décante et on évapore. L'alcaloïde est purifié en le transformant en sel qu'on fait cristalliser plusieurs fois. Le produit, dissout dans l'eau alcaline, cède à l'éther là base libre, pure.

Mais, tous les alcaloïdes ne sont pas solubles dans l'éther, et la purification est difiicile.

c. Extraction par le chlorure mercurique. — Le liquide est porté à l'ébullition, filtré et précipité par le chlorure mercurique. On filtre. Le précipité et la liqueur, traités séparément par l'hydrogène sulfuré, fournissent un précipité de sulfura mercurique qu'on sépare par le filtre, et deux liqueurs qu'on réduit par évaporation. On lave à l'alcool absolu. L'alcool de lavage est réuni aux eaux mères qu'on évapore. On précipité alors par le chlorure d'or et le chlorure de platine.

L'ébullition qui est à la base de ce procédé, dû à Brieger, est une condition très défectueuse.

d. Extraction des alcalo'ides volatils. — Gautier a donné un

PRÉCIS DE BACTÊRIOLOGIB, 2« édlt. 23

PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

procédé pour isoler les alcaloïdes volatils. Nous renvoyons au Bulletin de r Académie de médecine, janvier 1886.

Gautier et Étaru (Ac, des sciences^ XGVII, p. 263) ont imaginé une méthode pour isoler tous les corps basiques. Nous ne pouvons entrer dans les détails de ces procédés spéciaux *.

B. Extraction des toxines

ALBUM INOÏDBS. — Ou n'ob-

tiendra jamais que des produits impurs si on a cultivé le microbe en milieu contenant des matières albuminoïdes ou des peptones ; ce qui est d'ailleurs le cas ordinaire.

On traite le liquide filtré (toxine) par 20 volumes d'alcool à 95<». Au bout de vingt-quatre heures, on décante la majeure partie de l'alcool, on jette sur un filtre et on lave à Talcool. On reprend le précipité par Teau et on dyalise * pendant quinze heures. On ajoute au liquide aqueux un grand excès d'alcool absolu, on laisse déposer, on filtre, on lave. à

Fig. 199.

Dialyseur.

* Voir le Précis de Chimie physiologique de Hugounknq, Loco citato, p. 292 et 576 (méthode de Gautier).

* Les toxines albumosiques ne dialy sent pas.

Un dialyseur se compose de deux récipients et d'une membrane de papier parchemin. Le récipient le plus vaste est un cristallisoir coatenant de Teau distillée ; l'autre a une forme variable, mais est ouvert aux deux bouts; son extrémité inférieure est fermée par un tjBLitibour en papier parchemin fortement lié par un fil. Ce dernier reçoit la substance ù dialyser et est plongé dans le cristallisoir de façon que le papier affleure Teau distillée qui doit être changée de temps en temps. 11 faut s'assurer au préalable que le parchemin n'a pas de trcus ; pour cela on l'étend sur du papier filtré et on passe plusieurs fois une éponge mouillée; le papier filtré doit rester sec Nous recommandons le dispositif représenté figure 199. Deux tubulures latérales (6, b,) du cristallisoir (B) permettent d'établir un courafat d'eau. Le récipient central (A) repose sur des supports.

ralcool et on dessèche dans le vide. Opérer rapidement et à Tabri de la lumière. Si on distille Talcool, on retrouve une certaine quantité de substance non précipitée.

Brieger et Boer^ isolent la toxine diphtérique en traitant une culture en bouillon peptoné filtrée par une solution de chlorure de zinc ai p. 100; ilsdécomposent le précipité insoluble par Taction successive du bicarbonate, du phosphate et du sulfate d*ammoniaque . La substance amorphe obtenue est soluble ; elle tue le cobaye avec les symptômes classiques, et peut immuniser. Elle ne donne pas les réactions de Talbumine ou de la peptone.

Certains produits solubles diastasiques adhèrent aux précipités. C'est ainsi que Roux et Yersin ont vu la toxine diphtérique être entraînée par les précipités d'alumine et de phosphate de chaux.

§ 3. — Conservation des produits solubles

Les substances chimiquement pures, extraites des cultures filtrées, seront conservées d'après les préceptes ordinaires, en se souvenant de leur grande altérabilité, tout spécialement pour les substances alcaloïdes.

Nous voulons seulement parler de la conservation des cultures fiUrées, Elles doivent être recueillies dans des récipients permettant un puisage facile de petites doses sans crainte d'altérer toute la masse. Ces récipients doivent, en outre, répondre à des conditions spéciales à chaque toxine. Beaucoup de cultures filtrées, celle du bacille de la diphtérie par exemple, peuvent être conservées comme du bouillon ordinaire, sans perdre de longtemps leur activité. D'autres, telles que les toxines du tétanos, du choléra s'altèrent avec une rapidité incroyable au contact de l'air. En quatre jours la toxine cholérique a perdu la moitié de son activité si on la laisse à l'air libre. (J. Courront et Doyon). Il faut conserver dans le vide des liquides aussi altérables. D'une façon générale, on devrait tou-

* Brieobr et BoER, Deutsche medic. Wochensch., 3 décembre 1896.

PRODUITS SOLUBLES HICROBIENS

Fig. 200.

Ballon contenant les toxines

après iiltration.

jours maintenir ses provisions de toxines, quelles qu'elles

soient, à Tabri du contact de Tair.

Les cultures, que nous filtrons toujours par refoulementy sont reçues dans an des trois récipients figurés aux chapitres ii et ni. Nous reproduisons ici les deux plus commodes (fig. 200 et 201); nous préférons le flacon à trois tubulures avec montage sans caoutchouc (fig. 201), La fermeture du tube if^) se fait à la lampe, sans contamination possible. On règle la sortie de la toxine en soufflant dans le tube (/*). On referme l'extrémité efiilée du tube (f^) à la lampe après l'opération. Les bouchons de liège devront être recouverts d'un enduit de gutta-percha (dissoute dans le chloroforme) , ou de paraffine, ou de cire à cacheter. Il faut avoir soin de ne pas laisser rentrer de l'air par le tube (f^) à la fin de l'opération sans entourer l'orifice avec la flamme d'une lampe à alcool qui stérilisera l'air à son passage.

Lorqu'on veut conserver les cultures flltrées à Tabri de Tair, le meilleur système consiste à mettre dans le flacon destiné à les recevoir quelques centimètres cubes d'huile de vaseline avant la stérilisation. L'huile se stérilisera avec

Fig. 201.

Flacon contenant les toxines

après filtration.

/*, tube en U pour le puisage ^ f*, tube fermé ayant servi à la filtra — /», tube pour souffler.

filtration.

l'appareil. Les toxines (d), aussitôt dans le flacon, sont recouvertes d'une couche d'huile (c), qui surnage et les préserve du contact de Tair (fig. 202).

On pourra aussi employer notre appareil à conservation de toxines dans le vide (page 202; fîg. 134).

On transvase parfois ]a culture filtrée dans des tubes de

Fig. 202.

CoTiset've de toxine sous Thuile.

d, toxine. -— e, huile.

Tubes à essai pour la conserve

des toxines.

k, tube rempli. — B, tube scellé iU lampe.

verre qu'on remplit bien et qu'on scelle à la lampe. J'ai pendant longtemps conservé mes provisions de toxine tétanique dans des tubes de verre de 20 centimètres cubes, semblables à des tubes à essai, mais présentant un long étranglement (fig. 203, A). Je remplissais jusqu'au milieu de Tétranglement et je fermais à la lampe (fig. 203, B). Les toxines ainsi conservées étaient encore actives au bout de deux ans. 11 ne faut pas que l'étranglement soit trop étroit ; on aurait des difficultés pour introduire la toxine. Il faut attendre quelques minutes après le remplissage pour fermer à la

I 358 PRODUITS SOLUBLES MICROBIENS

lampe ; si le verre était encore humide, il casserait. L'inconvénient de ce procédé est la perte à peu près fatale de toute la toxine contenue dans un tube quand on ouvre celui-ci. Nous préférons aujourd'hui la couche d'huile.

Quel que soit le récipient employé, il devra toujours être conservé à la glacière ^ à l*abri de la lumière.

On pourra conserver les toxines desséchées^ à l'état pulvérulent. On opérera comme pour les séinims (page 846).