CRÉATION ARTIFICIELLE DB L^IMUCNITÉ

J. CouRMONT et Rodet; Streptocoque pyogène, Roger) ; on cherchera à les dissocier. J. Courmont et Rodet ont vu que la culture filtrée de Staphylocoque pyogène, qui est habituellement prédisposante, exceptionnellement vaccinante, doit ces propriétés à des substances prédisposantes, solubles dans lalcool, mélangées à des produits vaccinants, précipitables par Talcool. Vn simple chaufTage à + 55"^ suffit à faire apparaître le pouvoir vaccinant des cultures filtrées prédisposantes du Staphylocoque pyogène (Rodet et J. Colrmoxt) ; il faut chauffer à + 110* les cultures filtrées du Streptocoque pyogène pour les rendre vaccinantes (Roger).

§ 4. — Création artificielle dë l'immunité

PAR l'injection DU SÉRUM d'uN ANIMAL IMMUNISÉ

Sous rinfiuence des produits solubles vaccinants microbiens l'organisme fabrique, pour s'immuniser, des substances nouvelles (Bouchard), bactéricides et antitoxiques, qui se retrouvent en abondance dans le sérum sanguin. Ce sérum d'immunisé injecté à un animal neuf est préventifs et parfois curateur pour ranimai déjà infecté (Behring et Kitasato) . C'est le principe de la sérothérapie. Cette vaccination par les injections de sérum d'immunisés est passagère (quelques jours) et paraît tenir à la présence dans le sang des substances injectées, avant leur élimination. La brièveté de cette immunisation restreint son utilisation. Les injections préventives de sérum antidiphtérique dans une famille infectée (voy. p. 848), celles de sérum antitétanique chez les blessés souillés de terre (roy. p. 849) sont utiles par cette production temporaire de l'immunité.

Voy. p, 812,* les théories d'EHRLicH.

L'analyse bactériologique deTeau constitue un chapitre des plus importants et qui soulève de nombreux problèmes encore mal résolus *.

§ 1 . — Généralités

10 utilité de l'analyse bactériologique de l'eau. Valeur comparée de Fanalyse quantitative et de l'analyse qualitative. — De tous temps, Veau potable a exigé certaines qualités sur lesquelles le chimiste seul était chargé de renseigner l'hygiéniste. Aujourd'hui, nous savons que l'eau est fréquemment contaminée par des microbes pathogènes, propageant les épidémies au sein des populations qui en font usage. Ce rôle de l'eau dans la diffusion des maladies infectieuses a été mis hors de doute, au moins pour deux affections épidémiques redoutables : la /terre thyphoïde et le choléra. Nous considérons ici ces faits comme certains sans avoir à les démontrer. D'autres maladies (dysenterie, entérites diverses, etc.) sont aussi, très probablement, contractées à la suite de l'absorption d'une eau polluée. L'hygiéniste demande donc aujourd'hui au bactério-

' Consulter, pour les renseignements complémentaires, le Manuel pratique d'analyse bactériologique des eaux de Miquel (1891), les Annuaires de l'Observatoire de Montsowris (1885), le Précis d'analyse microbiologique des eaux, de G. Roux (1892) auquel nous avons fait de larges emprunts, et le Traité de Bacténolorjie de MiyuEL et Caubier (1902).

légiste de lui indiquer par nne analyse spéciale quelles sont les eaux qui doivent être déclarées non potables, en raison de la présence dans leur sein de germes pathogènes. Cette analyse bactériologique de Teau est complètement entrée dans nos mœurs; sa technique doit être étudiée avec soin.

Les microbes pathogènes étant une minorité parmi les nombreux microbes saprophytes qui peuplent la nature, il semble .que ïanalyse quantitative de Teau doit être sans importance et qaesenleVanalyse qualitative a son intérêt. Peu importe, enefTet, que nous buvions une eau contenant des milliards de microbes si ces derniers sont inofîensifs ; il importe au contraire beaucoup de ne pas ingérer une eau contenant un petit nombre de microbes, mais très pathogènes^. La qualité doit ici fatalement primer la quantité. Tout cela est très juste en théorie, mais impossible à réaliser en pratique. L*analyse qualitative de Teau est un but vers lequel nous devons tendre, mais qui apparaît encore bien éloigné. Pour les maladies à microbes connus comme le choléra, la fièvre typhoïde, nous verrons bientôt quelles difficultés, presque insurmontables, entourent leur iso* lement des eaux; or, il existe, en outre, une foule de maladies graves, épidémiques, dont nous connaissons mal ou dont nous ne connaissons pas du toutfagent microbien ; Tanalyse qualitative est ici non pas difficile, mais impossible. Il faut donc se rabattre sur l'analyse quantitative et raisonner par analogie en disant: telle eau est polluée d'un nombre considérable de microbes, elle a donc plus de chances que telle autre, qui en est presque privée, de contenir actuellement ou dans Tavenir des germes pathogènes. Nous devons provisoirement nous contenter de ces données approximatives, sauf dans certains cas où l'analyse qualitative est possible et que nous traiterons à part.

En raison du vague inévitable des conclusions de Tanalyse

* La question se complique encore plus actuellement. Il faudra à l'avenir rechercher dans feau non seulement les microbes pathogènes, mais les saprophytes adjuvants des pathogènes. Mbtchnikoff a montré que le Vibrion cholérique a besoin d'autres microbes adjuvants pour produire le choléra. Il en est peut-être de même de la fièvre typhoïde, etc.

UTILITÉ DE l'analyse DE l'eAU 373

quantitative, certains esprits ont voulu la rejeter complètement du domaine de Thygiène, comme inutile et encombrante. C'était aller d'un extrême à Tautre.. de Tenthousiasme exagéré des premiers ans de la bactériologie au septicisme stérilisant qui suit toutes les réactions. Il ne paraît pas douteux qu'une eau très riche en microbes ait toutes les chances d'être une eau polluée par des excréments animaux, ayant coulé pendant longtemps à la surface de la terre, chargée de matières organiques, en un mot une eau non potable. Si les nombreux microbes qu'elle renferme ne sont pas tous dangereux par euxmêmes, ils indiquent tout au moins que cette eau doit être tenue pour suspecte. En outre, nous dirons avec G. Roux: « les analyses quantitatives apportent souvent des éclaircissements précieux et inattendus, qu'elles seules peuvent fournir, sur des causes de pollution entre tel point et tel autre dans le parcours d'nne canalisation, ou nous mettent sur la voie d'une source d'infection qu'il était impossible sans elles de soupçonner; elles nous renseignent encore sur les qualités ou les défectuosités d'une masse filtrante naturelle ou artificielle et présentent ainsi un intérêt de premier ordre. » Faisons donc des analyses quantitatives, tout en portant nos cfTorts vers l'amélioration des procédés d'analyses qualitatives.

L'analyse quantitative, telle qu'on la pratique actuellement, a encore un autre défaut qu'il faut signaler en toute sincérité. Elle ne nous dit pas combien d'espèces microbiennes contient un millimètre cube d'eau, elle nous apprend le nombre des individus; or, il est bien évident qu'une eau contenant des milliers d'individus d'une seule espèce aquatile inofTensive, est moins polluée qu'une eau contenant moins d'individus mais appartenant à un grand nombre d'espèces diverses. Nous sommes encore trop peu avancés en botanique bactérienne pour pouvoir faire ce triage des espèces ; ce serait, d'ailleurs, arriver a faire une analyse qualitative complète ^ Disons-le

* MiGULA (1890) a tenté plusieurs analyses d'eau en comptant le nombre des espèces et non celui des individus. 21.75 p. iOO des eaux analysées ne contenaient que une à quatre espèces microbiennes;

aussi, les procédés couramment employés ne permettent pas de cultiver tous les microbes existant dans Teau; c'est ainsi que les méthodes d'isolement sur gélatine ne peuvent déceler une foule de microbes pathogènes ne poussant pas sur ce milieu, conservé solide au-dessous de -(- 24° seulement {Pneumocoque, B. tuberculeux, etc.)- H est rare qu'on fasse des cultures dans le vide ; or, nombre de microbes pathogènes très dangereux (B. du tétanos, V"i6non»cpfiguc, etc.) sont anaérobies. Cela revient à dire que pour faire une analyse bien complète il faudrait faire des cultures sur différents milieux, à différentes températures, à Tair et dans le vide, etc., en d'autres termes, passer un temps considérable à analyser un seul échantillon. Une bonne installation, de l'argent et beaucoup de temps (car il faut faire une série d'analyses pour une même eau — voy. plus loin) sont les éléments indispensables d'une analyse d'eau bien complète.

2<^ Eau bactériologiquement potable. Richesse microbienne des eaux. Origine de ces microbes. — Quel est le nombre de microbes contenu dans une quantité d'eau donnée qui fera déclarer par Thygiéniste celte eau comme dangereuse? On comprend que des chiffres ne peuvent rien avoir d'absolu, aussi les avis sont-ils très partagés. D'ailleurs, une eau ne doit être déclarée potable que lorsque l'ensemble de ses propriétés chimiques, de sa flore macroscopique et microscopique cadre avec les lois de l'hygiène. L'analyse bactériologique ne doit jamais prononcer seule.

Il est bon, avant de citer des chiffres, de jeter un coup d'œil sur le cycle des mouvements de l'eau à la surface du globe, et de nous demander où elle se purifie et comment elle se pollue.

L'eau est constamment puisée à la surface de la terre et se rend dans l'atmosphère à l'état de vapeur d'eau ; cette vapeur

64 p. 100 contenaient quatre à dix espèces, et 14,75 p. 100 plus de dix espèces. On voit la différence de ces chiffres avec ceux que nous citerons plus loin. Migula considère comme potable une eau qui a moins de dix espèces microbiennes.

EAU HACTÉRIOLOGIQUBHENT POTABLE 37t»

d'eau retombe en pluie, qui coule à la surface ou filtré à travers les couches superficielles, pour aller former la nappe souterraine d*oii partent les sources des rivières et des fleuves, allant aux lacs, à la mer, d*où partent les nuages, et ainsi de suite. Or, la richesse microbienne de Teau varie considérablement suivant les points de ce circuit où on Texamine.

A un certain moment, Teau est complètement privée de germes vivants; c^est Teau de la nappe souterraine et des sources, lorsque des fissures parties du sol ne permettent pas la pénétration des souillures de la surface. Pasteur et Joubert ^ Font prouvé il y a déjà longtemps. A mesure que Teau court à la surface de la terre, elle enrichit sa flore microbienne, et, finalement, Feau de la mer contient un très grand nombre de bactéries. Gomment cette eau se purifie-t-elle? Et d'abord, Tévaporation de Teau de la mer entraîne-t-elle des germes? Moreau et MiuuEL^ ont fait, en pleine mer, une grande quantité d'analyses d'air marin, et n'ont trouvé en moyenne qu'un microbe par mètre cube, à plus de 100 kilomètres des côtes. Miquel formule ainsi sa conclusion : en temps normal, lesocéansne cèdent pas d l'air les bactéries quils renferment ; cependant, quand la mer est grosse et houleuse, l*air marin se charge de bactéries, mais dans une très faible proportion. Miqubl avait, d'ailleurs, démontré que la vapeur d'eau qui s'échappe d'une infusion putride est complètement privée de germes. En somme, l'eau est une première fois aseptique en s'élevant dans l'atmosphère ; chemin faisant elle se charge de quelques germes, mais les nuages sont encore très pauvres en microbes (de Freldenreich). Dès que les nuages se transforment en pluie, Tcau se charge, en tombant, d'une grande quantité des germes de l'atmosphère. L'eau de pluie arrive à la surface du sol avec plus de 4000 microbes par litre, d'après MiguEL. 11 va sans dire que ces chifi'res varient beaucoup suivant les mois de l'année, suivant que l'eau a été analysée au début ou à la fin d'un orage, etc. ; mais la pluie

* Pasteur et Joubert, Ac. des sciences. 1878.

* MiQUEL et Moreau, Annuaire de l'Observatoire de Montsouris pour 1886.

est une source certaine de contamination des eaux potables.

L*eau tombe donc contaminée sur le sol dont la surface est elle-même très riche en microbes. (Maggiora a trouvé jusqu'à 78 000000 de germes par gramme de boue des rues de Turin). Une partie ne quittera pas cette surface et coulera en se contaminant de plus en plus jusqu'à la mer ; toutes les souiHures animales sont finalement entraînées par les eaux. Une autre partie filtrera à'travers le sol pour aller former la nappe souterraine. Cette eau abandonne successivement tous les germes qu'elle contient, et les ensemencements faits avec de la terre puisée à 5 mètres de la surface restent complètement stériles. C'est brusquement, à la profondeur de 1%25 environ, que se fait cette purification, d'après C. Frcenkel. Il va sans dire que toute fissure peut entraîner des germes asseï profondément. C'est ce que Thoinot a vu pour les sources du Havre qui n'étaient pas pures après une filtration de 48 mètres dans un terrain calcaire. C'est ce qui a été constaté pour les soi-disant eaux de source amenées, à grands frais, à Paris. La disparition des germes tient à deux causes : i^ la fitration à travers les pores des couches superficielles; 2^ le manque d'oxygène. C. Frobnkel a vu que le B. anthracis ne peut plus végéter à 3 mètres de profondeur, tandis que le V. cholérique pousse À ce môme niveau pendant les mois d'août, septembre, octobre. Pour Granchrr et Desghamps, le B. typhique peut pénétrer à 40 ou 50 centimètres dans l'intérieur du sol, et y vivre pendant cinq mois et demi. H va sans dire que les anaérobies sont au contraire favorisés par le manque d'oxygène, mais nous manquons de données positives sur la profondeur à laquelle on les retrouve. Quoi qu'il en soit, la nappe souterraine peut être absolument pure ; pour la seconde fois, l'eau du circuit est aseptique. C'est pour cela qu'il existe des sources microbiologiquement pures.

Quant au nombre de microbes contenus dans les eaux courantes, il varie dans de grandes proportions. Citons quelques chiffres. Ch au veau, Arloing, J. Courmont, G. Roux ont vu que le Rhône en amont de Lyon contient 75 000 microbes par litre environ ; la Saône en contient 586 000 en amont de Lyon et

EAU BACTBRIOLOGIQUEUENT POTABLE 377

4 280 000 a son embouchure dans le Rhône (G. Roux). La Seine contient de 31 060000 à 200000000 de microbes par litre, suivant les points où on la puise (Miquel). Le Rhône est un des fleuves les plus pauvres en microbes. Les chiffres seraient plus élevés si on analysait certains lacs, la mer près des ports, etc.

L'eau se contamine donc deux fois et se purifle deux fois pendant son courant circulaire; elle se contamine par Tair et surtout par le sol ; elle se purifie par Févaporation et la filtration à travers le sol. Ces deux moyens de puriOcation sont employés artificiellement -.distillation, établissementde couches filtrantes pour Tapprovisionnement des villes en eau potable.

Il est temps de revenir à nos premières questions et de nous demander quelle est la limite de la richesse en germes de Teau pour être déclarée potable puisqu'on ne peut pas faire usage uniquement d'eau de source à la surface du globe.

MiQCEL adressé l'échelle approximative suivante:

Microbes par cent. cube.

Eau excessivement pure ... 0 à 10.

— très pure 10 à 100.

— pure 100 à 1 000.

— médiocre 1 000 à 10 000.

— impure 10 000 à 100 000.

-— très impure 100 000 et au delà.

D'une façon générale, on déclare potable (sauf contre-indications données par l'analyse qualitative) une eau qui ne contient pas plus de 500 germes par centimètre cube, soit 500 000 par litre. y^ Or, voici les chiffres des analyses de l'eau du Rhône consommée à Lyon (G. Roux) :

Microbes par cent. cube.

Rhône en amont 75

Bassin filtrant n» 1 7

Réservoir du bas service 18

Réservoir du service supérieur 26

Eau du robinet d'alimentation 60

L'eau est très bien filtrée par une couche de terre, mais se contamine successivement dans les conduites ; elle est, en tout

cas, parmi les eaux très pures de Miqukl, et combien diflf«^rente, après sa fîltration artificielle des eaux de source parisiennes !

Lorsqu'on veut tirer des conclusions d'une analyse d^'eaa. il faut tenir compte de plusieurs facteurs. La teneur d'une rivière en germes peut varier considérablement suivant que les eaux sont grosses ou basses. L'eau de la Marne varie de 50 à 14 000 germes par centimètre cube, suivant les mois de Tannée (Miuuel). Ces différences ne sont pas en relation avec ]a température puisque c'est en hiver et en automne que les rivières sont les plus microbiennes. Pour se faire une conviction sur une eau, il faudra donc faire une série d'analyses dans différentes conditions, et ne se prononcer qu'après.

3^ Puisage et transport des eaux à analyser. — Pour

faire l'analyse quantitative d'une eau dont les chiffres expriment le nombre réel des germes existant dans cette eau, il importe de faire l'analyse sur place immédiatement après le puisage, toutes les fois que cela est possible, ou de transporter l'échantillon d'eau avec certaines précautions. Il est surabondamment démontré aujourd'hui que le nombre des microbes d'une eau augmente considérablement entre le moment de puisage et celui de l'analyse, si elle n'est pas maintenue aune température suffisamment basse pour empêcher le développement microbien. Il faut donc impitoyablement refuser de faire l'analyse d'une bouteille d'eau qui a voyagé à la température ordinaire ; non seulement le nombre obtenu serait lui-même exagéré*, mais telle espèce se développerait d'une façon exagérée et étoufferait les autres. 11 va sans dire aussi que l'eau doit être recueillie aseptiquement.

Toutes ces considérations théoriques amènent à formuler les principes suivants :

* MiQUEL a fait des numérations probantes. En trois heures. Teati de la Dhuis conservée dans un récipient à la température ambiante de -f 13® contenait 456 microbes par centimètre cube au lieu de 57, chiffre initial. En trois jours, à -j- iO». l'eau de la Vaane passait de 48 à 590 000 microbes par centimètre cube.

i^ Recueillir Teau dans des récipients clos, préalablement lavés et stérilisés à la chaleur sèche (voy. ch. ii) ;

2^ Flamber le bouchon avant de fermer le récipient, ou sceller ce dernier (pipettes) à la lampe ;

3<> Puiser Teau loin des bords ou du fond, pour ne pas la rendre boueuse (sauf indications spéciales) ;

4« Mettre le récipient dans un appareil-glacière à 0<» et l'envoyer le plus rapidement possible au laboratoire ; ou de préférence, faire l'analyse sur place .

5<* Recueillir une assez grande quantité d'eau (plusieurs litres) quand on veut faire l'analyse qualitative (voy. la recherche du B. d'Eberth, p. 407).

Appliquons ces principes aux différents cas qui pourront se présenter :

A. Puisage. — Les méthodes de puisage différeront suivant la situation de Teau à analyser.

a. Eau stagnante ou courante. — 1*^ Puisage superficiel. — Il s'agit de prendre un échantillon d'eau à la surface d'une rivière, d'un lac, etc. ; c'est le cas le plus ordinaire .

Tous les récipients sont bons. Miquri.

conseille des flacons de verre de 2OO centimètres cubes, stérilisés avec un tampon de ouate, et bouchés ensuite avec un bouchon de liège légèrement carbonisé à la flamme. Hueppe se sert de flacons bouchés à l'émeri. Fol et DuNANT, Chauveau et Arloing puisent

Fig. 204.

Pipette TpouT le puisage

de l'eau à analyser.

A, pipcUe après la stérilisation. — B, pipette tenant I© vide.

ANALYSE BACTERIOLOGIQUE DE L EAC

directement avec la pipette que nous décrirons plus tard. LusTiG se sert de flacons d'ERLENMEYBR . Miqusl avait précoDÎsé, au début de ses recherches, des ballons effilés en pointe et scellés à la lampe pendant qu'on les chauffe à + 200** ou 4- 300^* ; le vide était ainsi fait dans ces récipients. Il a abandonné ce système comme trop fragile. La plupart des bactériologistes (Flugge, Ribtscm, Pfuhl, g. Roux, etc.) sont revenus à ce procédé en remplaçant le ballon par une simple pipette, comme Chauveau et Aruhng l'avaient fait depuis longtemps. Il faut conseiller Tappareil le plus simple. On fait une pipette avec un tube de verre comme il a été dit page 20, en ayant soin de pratiquer un étranglement (a) (fig. 204, A) au-dessus du tampon de ouate, et on fait stériliser au four Pasteur. Prenant alors la pipette dans une pince en bois, on la porte successivement dans toute sa longueur dans la flamme d'un bec Bunsen ; lorsque Tair contenu dans la pipette est très raréfié par réchauffement, on scelle rapidement en (a) pour avoir la figure, 204 B. Le vide est suffisant. Tous ces appareils doivent être enveloppés d'une feuille de papier à filtrer ou d*une couche de ouate stérilisée, jusqu'au moment de s'en servir.

Pour puiser l'eau avec un ballon bouché au liège, on enlève le bouchon qu'on tient de la main gauche, pendant qu'on plonge le ballon dans l'eau pour le remplir, sans frôler les bords de la berge. On rebouche, après avoir flambé le liège et le goulot. Si le ballon est bouché à l'émeri, on peut déboucher et reboucher sous l'eau. Avec le ballon à pointe effilée de MiQUEL (fig. 205) ou une pipette quelconque où le vide est effectué, on introduit la pointe effilée à une certaine profondeur dans l'eau, et on va en casser l'extrémité avec une pince flambée. L'eau se précipite dans le ballon ou la pipette sans toutefois les remplir, le vide étant toujours imparfait. Lorsque

Fig. 205.

Ballon de Miquel pour le puisage des eaux.

PUISAGE BT TRANSPORT DBS BAUX A ANALYSBR 381

Feau cesse de monter, on retire la pointe et on la scelle de suite dans la flamme d'une lampe à alcool. Une pince est donc nécessaire pour ce système. Si on voulait puiser de Teau dans des pipettes ordinaires, il suffirait de briser la pointe, de la flamber et de la plonger dans Teau, pendant qu'on aspirerait par Tautre bout avec un tube de caoutchouc.

En résumé, tous les procédés sont bons pourvu qu'ils soient aseptiques. Nous recommandons la pipette avec le vide partiel.

2** Puisage profond, — On peut vouloir analyser les dilTérentes couches d'une masse d'eau ou puiser l'eau d'un puits privé de pompe.

Un simple flacon bouché à Témeri stérilisé, auquel sera attaché une grosse pierre, peut sufflre. Une licelle est attachée au goulot, une autre au bouchon. On fait descendre le flacon bouché à la profondeur voulue, on tire alors le bouchon et on retire lorsque le flacon est plein. On fera bien de flamber les couches externes du flacon et la pierre pour ne pas contaminer Teau profonde à analyser. On ne se servira pas, pour l'analyse, de l'eau contenue dans le goulot du flacon, laquelle a été intimement en contact avec l'eau des couches superflcielles pendant qu'on a retiré le flacon.

MiQUEL a imaginé un ingénieux appareil (flg. 206) pour le puisage profond. Un matras d'essayeur de 50 centimètres cubes environ (B) se termine par une pointe effllée, recourbée en U (E) ; il est maintenu dans une armature métallique (A). Un poids (G), de 2 ou 3 kilogrammes, leste l'appareil qui est suspendu à une corde résistante (I) graduée

Flg. 206.

Appareil de Miquel pour puisage des eaux k diverses profondeurs.

au moyen d*anueaux (F) et de nœuds. Le long de la corde glisse, dans les anneaux, un fil de cuivre (H) terminé par une bague (D) qui embrasse le col en U du matras. Un vide préalable partiel a été fait dans ce dernier après la stérilisation. Lorsqu'il est descendu à la profondeur voulue, on tire brusquement sur le fil de cuivre qui brise le col en verre, et Teau se précipite dans le matras.

G. Roux a fait construire un appareil plus commode, qui peut puiser un litre d'eau à de grandes profondeurs. Il se compose (fig. 207) d'une bouteille ordinaire d'un litre (A), qui est enfermée dans une enveloppe en cuivre (B).

Celle-ci se compose d'un fond (c), contenant 3 kilogrammes de plomb, d'une partie grillagée (d), d'un couvercle (e), qu'on place une fois la bouteille introduite. Une corde solide (h) supporte l'appareil par la manette. Une cordelette (^), munie d'un petit crochet qui pince le bouchon en liège et la bouteille, sert à déboucher la bouteille à la profondeur voulue qui est comptée sur les nœuds (de 10 en 40 mètres) de la grosse corde.

b. Eau des fontaines ^ des robinets. — On fait couler directement l'eau dans un récipient quelconque stérilisé. Si l'écoulement est intermittent (robinets), il est de toute nécessité de faire couler l'eau pendant cinq à dix minutes avant de recueillir l'échantillon, pour ne pas analyser une eau stagnante très riche en dépôts et en microbes.

c. Eaux météoriques : pluie, grêle, neige, — Miqukl a construit un udomèire pour recueillir l'eau de pluie ou la neige

Fig. 207.

Appareil de G. lioux^ pour le puisage profond.

(fig. 208). Un poteau de bois (P), planté verticalement en terre supporte une tige de fer horizontale (T), laquelle maintient un entonnoir métallique (cuivre nickelé ou argenté) flambé au moment de Tinstallation (E). Au-dessous de cet entonnoir est un creuset en platine (P') porté préalablement au rouge . On peut retirer et remettre le creuset sans toucher le reste de Tappareil, et analyser ainsi la pluie à différents moments de l'averse.

Fig. 208.

Udomètre de Miquel.

Un petit couvercle en platine (G), stérilisé par le chauffage, sert à préserver le creuset des poussières pendant le transport. L'appareil doit être situé au moins à 2 mètres du sol pour éviter l'eau boueuse qui rejaillirait de terre.

Si des éclaircies séparent les ondées, il faut stériliser à nouveau l'entonnoir qui pourrait s'être contaminé de poussières. Si la température ambiante est trop chaude, on peut imaginer un appareil avec manchon réfrigérant ou refroidir avec le chlorure de raéthyle ou l'acide carbonique liquide.

G. Roux recommande de se servir simplement d'un large tube à essai, stérilisé, bouché à la ouate. A travers le tampon passe l'extrémité effilée d'un petit entonnoir flambé destiné à recevoir la pluie ou la neige.

Il faut toujours noter la température de l'eau au moment de la prise, son état de limpidité ou de trouble, la hauteur de i'étiage, etc., etc. Tout récipient sera muni d'une étiquette explicative.

384 ANALYSE BACTBRIOLOGIOrK DE L EAU

jB. Transport. — Lorsque rensemencement ne peut être pratiqué sur place, le transport des récipients contenant Feau à analyser doit se faire à 0**. Une température de quelques degrés au-dessus suffît à la pullulation des microbes. Malgré le maintien à 0^, le transport doit se faire aussi rapidement que possible, car Miquel a montré que certains individus périssaient en grand nombre à cette température, tandis que d'autres espèces {Bacille rouge^ par exemple) pouvaient se multiplier. Nous savons bien aujourd'hui que le B. (TEberth ne vit pas longtemps dans Teau bien pure. Karunski' a montré que de Teau stérilisée ou de citerne, ensemencée avec du B. d'Eberth, du Vibrion cholérique et du B. anthraciSf ne contient plus aucun de ces microbes au bout de trois à cinq jours. Par contre, j'ai vu le Stapylocoque pyogène vivre plusieurs mois dans de Feau stérilisée. Mais ce sont surtout les microbes aquatiles ordinaires qui prennent le dessus et se multiplient avec une grande rapidité. Karlinski verse, dans une citerne propre, 3 hectolitres d*eau de puits relativement pauvre ea microbes. Tous les quatre jours on verse dans la citerne 150 centimètres cubes de selles typhiques. Au bout de douze jours, les B, d'Eberth ont disparu, et les bactéries banales ont pullulé. Si Teau avait été privée de matières organiques, la disparition se serait faite plus rapidement. En somme, à côté de la pullulation, il faut tenir compte de la disparition de certaines espèces même à 0^, et se hâter de faire les ensemencements.

Le transport à de courtes distances se fait en maintenant le récipient dans un seau à glace quelconque. On peut imaginer une foule de dispositifs.

Le transport à de grandes distances nécessite des appareils spéciaux.

Voici la glacière préconisée par Miquel (fig. 209). Le flacon (A) contenant Teau est cacheté à la cire d'Espagne, enveloppé de papier et introduit à frottement dans une boite métallique cylindrique (B) où il ne doit pas ballotter. Cette première boite est placée dans une seconde (C) plus large de quelques centimètres

* Karlinski, Arch. fur Hygiène, 1889 et 1890.

et garnie de sciure de bois. Une troisième boîte ipélalliquep) beaucoup plus vaste est remplie de glace concassée en gros morceaux. Le tout est placé dans une caisse de bois (E) à charnières et à poignée, remplie de sciure de bois, qu'oa peut mettre au chemin de fer.

On peut simplifier cet appareil en ne se servant que d'une seule enveloppe métallique et d*une caisse en bois.

Fi«. 209.

Glacière de Miquel pour le transport des eaux à analyser.

RiETscH a fait construire une boîte pouvant contenir de longs tubes effilés. Elle est en zinc, de forme rectangulaire et divisée en deux compartiments par une lame de zinc horizontale percée de petits trous. Le compartiment inférieur très bas est destiné à recevoir l'eau de fusion de la glace qui s'échappe par un orifice latéral. Le compartiment supérieur est divisé en trois par deux cloisons verticales en zinc; les deux parties latérales sont remplies de glace tandis que le rectangle médian reçoit à frottements une boîte de zinc contenant les tubes de verre. Cette boîte est percée inférieurement de trous pouvant laisser passer les tubes de verre et donnant insertion à des petits cylindres creux en zinc destinés à recevoir les tubes. Il y a un pnécis ne n.\CTÉRiOLoniE, 2« édit. 25

couvercle en zinc. Le tout est recouvert de quatre couches alternatives de papier et de drap. Une courroie sert à porter Tensemble.

On peut imaginer une foule d'appareils réfrigérants. Citons sans les décrire ceux de Pfuhl, de G. Roux, etc., etc.

Fig. ilO.

Étuve glacière de MiqueU

Il est bon, ainsi que le dit justement Miquel, d'avertir le directeur de l'octroi de la gare où arrivera la caisse pour éviter son ouverture par les préposés de Tadministration.

Au laboratoire^ on peut vouloir conserver à 0<» une partie de l'eau recueillie pour faire plusieurs analyses successives. On se servira d'une glacière quelconque. Miql^l a fait construire une étuve glacière représentée figure 210. La botte intérieure (EO est destinée à recevoir les échantillons d'eau ; elle communique avec l'extérieur par un couloir muni de deux portes (P' et P). La boîte réfrigérante (E) repose sur un fond (G) percé de

trous pour laisser échapper l'eau de fusion par le lube (T) ; elle sera remplie de glace. Le couvercle (C) est à double paroi remplie de sciure de bois. L'extérieur est garni de feutre. Un thermomètre {t) pénètre dans (E'). La pomme d'arrosoir (S) sert à régler Tétuve au-dessus de 0^, à + 20<* par exemple. On ne met pas de glace; on fait simplement tomber un courant d'eau plus ou moins froide par RS.

On se reportera au chapitre iv (p. 131) pour l'étude des étuves et régulateurs destinés aux températures basses.

Fig. 211.

Nécessaire de Miquel pour rensemeDcement sur place des eaux

à analyser.

C. Nécessaires d'analyse bactériologiqlt: de l'eau. — Disons un mot ici des nécessaires pour aller ensemencer sur place. Ce sont des appareils destinés à faciliter le transport des instruments, tubes, etc., avant l'ensemencement, et leur retour au laboniloire après la mise en cultures de l'eau. Ils varie-

388 ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DE L EAC

ront naturellement beaucoup suivant la méthode employée.

Le nécessaire de Miquel ifig. 211) est une boîte (A) de 38 centimètres de hauteur, sur 35 centimètres de largeur et 22 centimètres de profondeur. Un liroir inférieur (B) comprend quinze compartiments destinés à recevoir autant de ballons coniques, à base large de 5 centimètres de diamètre, pour culture sur gélatine étalée. Au-dessus du tiroir, est une plaque métallique en laiton (Ç) qui se tire et sur lesquels seront placés les ballons de gélatine à liquéfier au moyen d'une lampe à alcool (D) installée au-dessous. L'étage supérieur est divisé en compartiments renfermant : deux vases à dilution de 500 centimètres cubes, deux de 50 centimètres cubes, deux de 10 centimètres cubes contenant de Teau stérilisée ; une lampe à alcool. Un râtelier situé contre la paroi postérieure maintient des tubes à essai renfermant les pipettes graduées et stérilisées. Quelques flacons, quelques plaques, une pipette à boule, pour emporter un échantillon d'eau, en complètent Toutillage.

Le nécessaire de G. Roux (fig. 212) est « une boite en zinc, à peu près cubique, de 35 centimètres environ dans les trois dimensions, à double parois, circonscrivant un espace vide de 10 centimètres de largeur, tout à fait analogue à celui des étuves à incubation et destiné à recevoir des fragments de glace concassée (B) ; un robinet (1) placé à la partie inférieure d'une des faces de la boîte permet de vider l'eau de fusion; Textérieur est recouvert de feutre. Dans ce grand espace vide central s'engage un panier en 111 de laiton (G) pouvant être complètement enlevé, comme celui de l'autoclave, et divisé, par des cloisons transversales, également en laiton, en six étages superposés. Les quatre étages inférieurs (E) sont agencés, grâce à une série d'encoches en forme de croissants qui limitent les deux bords libres, de façon à recevoir, couchés sur un plan horizontal, des tubes à essai contenant 2 ou 3 centimètres cubes seulement de gélatine stérilisée, lesquels sont maintenus bien en place et sans ballottement possible par des bandes de caoutchouc adaptées aux deux extrémités de chacun des bords de la cloison horizontale. >'

« Quant aux deux étages supérieurs, ils sont constitués par

des cylindres métalliques placés de champ, dans lesquels seront introduits et solidement fixés les tubes pipettes à extrémité eflilée. Une place est réservée au thermomètre (H). Des annexes latérales (A, A') renferment des tubes à essai, contenant

Pig. 212.

Sécessaire de G. Roux pour rensemencement sur place des eaux à analyser.

AA*, annexes ; B, glace ; C, compartimrnl du couvercle ; D, anse ; E, (Plages ; G, pauier eu 01 de lailou ; I, robinel.

des quantités strictement déterminées d*eau stérilisée et des pipettes jaugées et stérilisées. »

« Le couvercle est fortement bombé et creux; dans sa cavité (C) se trouvent: une lampe à alcool munie d'un chalumeau et d'un petit insufflateur en caoutchouc, une petite capsule en métal, un trépied pliant, des pinces, des ciseaux, des étiquettes et quelques feuilles de papier à filtrer. Les annexes ont des couvercles spéciaux. Une anse (D) permet de porter la caisse sans difficulté. »

Nous parlerons plus loin du nécessaire employé dans le labo* ratoire d'ARLOiNG.

§ 2. — Analyse quantitative

Nous supposons qu'on Yeuille savoir le nombre des éléments microbiens contenus dans une eau, analysée surplace ou transportée rapidement etàO<> au laboratoire, comme il vient d'être dit.

A) Examen microscopique

1^ Examen direct. — Nous ne signalerons que pour mémoire l'examen direct de l*eau au microscope. Depuis Tinvention du microscope on a regardé à laide de ce dernier la flore et la faune d'une goutte d'eau; nous n'avons pas besoin d'ajouter qu'on ne voit ainsi que la grande minorité des microbes et qu'il est impossible.de les compter, surtout par rapport au volume d'eau employée. 11 en est de même si on examine le dépôt formé. Harral en 1850, Cohn en 1866, Hirt en 1879, Macdonald en 1883, et même Tiemann et GâRTNER, en 1889, ont préconisé de semblables procédés.

2» Examen après évaporation. — Kogh avait légèrement perfectionné la méthode en examinant les microbes après évaporation de l'eau et coloration du résidu. La goutte d'eau était évaporée sur la lamelle chauffée à la flamme d'une lampe à alcool. KocH colorait au bleu de méthylène. '

3° Examen après fixation. — Certes, en 1880, et 1882, a /Iré les microbes d'une goutte d'eau au moyen de Vacide osmique. Dix ou douze gouttes d'une solution d'acide osmique à 1 p. 100 sont introduites dans une petite éprouvette stérilisée; on verse ensuite lentement 30 à 40 centimètres cubes de l'eau à analyser en agitant de temps en temps. Au bout de quelques minutes, on ajoute de l'eau distillée pour atténuer l'action de l'acide osmique, et on laisse déposer. On décante au bout de vingt-

quatre heures, et on examine le dépôt après coloration avec une couleur d*aniline. Nous dirons, avec G. Roux, que cette méthode est excellente pourTexamen des infusoires, et enfantine pour l'analyse bactériologique de Teau.

En somme, Texamen microscopique ne peut rendre aucun service pour le but que nous nous proposons.

B) Analyses par cultures en milieux liquides

La méthode d'analyse par cultures liquides date des mémorables expériences de Pasteur et Joubert, en 1878. Miquel, Chauveau et Arloing ont perfectionné les détails.

Les différents procédés se partagent en deux groupes. Dans un premier groupe, l'eau est puisée directement dans la pipette qui servira à la répartir dans les ballons de bouillon; il faut alors que la pipette soit très effilée pour donner des gouttes très fines, ttt à r— de centimètre cube, c'est le procédé de Chauveau et Arloing, employé à Lyon depuis bientôt vingt ans. Il est le procédé de choix, à condition toutefois que l'eau ne soit pas trop impure, car on ne peut obtenir des gouttes inférieures à un certain volume. Le second groupe comprend tous les procédés où on fait une dilution préalable de Teau à analyser dans de l'eau stérilisée pour qu'une goutte moyenne ne contienne que très peu d'eau microbienne. Ce sont les procédés de Miquel, de Fol et Dunant. En principe, il faut arriver à ce que chaque ballon ne soit ensemencé qu'avec un seul microbe; si donc l'eau est peu riche, il suffit de la fractionner en gouttes très fines; si l'eau est très impure, il faut la diluer. Lorsqu'on peut éviter la dilution, le procédé de Chauveau et Arloing est incontestablement le meilleur.

Pour choisir un des procédés précédents et pour savoir (au cas où on s'adresserait au second groupe) quelle dilution il faut employer, il est indispensable de procéder à une analyse préalable sommaire, indiquant la richesse microbienne approximative de l'eau. Cette analyse préalable sera aussi utile pour les méthodes sur milieux solides.

Miquel pratique cette analyse préalable de la façon suivante.

392 ANALYSE BACTÊniOLOGIQUK DE l'eAD

On ensemence des ballons de bouillon, les uns avec une goutte de Teau suspecte, d'autres avec une goutte de Teau diluée au 100®, d'autres avec une goutte de l'eau au iOOO®, d'autres enfin avec une goutte de l'eau diluée au 1000000^' ou même plus. On met les ballons à Tétuve et on les examine au bout de vingtquatre heures. On choisira la dilution correspondant à celle dont les ballons sont restés clairs en majorité. Si, par exemple, tous les ballons ensemencés avec une goutte de la dilution à i/100« sont troubles, et que 8 sur 10 des ballons ensemencés avec une goutte delà dilution à 1/1000® soient restés clairs, on choisira la dilution à 1/iOOO*. Si un dixième seulement des ballons ensemencés avec l'eau pure est trouble, on se passe de dilution et on choisira le procédé de Chauveau et Arlolng. Il va sans dire que le procédé de Chauveau et Arloixg s'applique surtout aux analyses où on peut aller faire soi-même le puisage, en raison de la délicatesse des pipettes; on peut néanmoins l'employer en puisant dans l'échantillon envoyé au laboratoire.

G. Roux fait des dilutions variant de 1/10« à 4/1000«, et ensemence 1 centimètre cube des dilutions dans deux ou trois tubes de gélatine liquéfiée et étalée sur une portion de la paroi du tube maintenu horizontal. Au bout de trois ou quatre jours» on compte les colonies. Le gros inconvénient est de nécessiter une attente de quatre jours lorsque le même échantillon (maintenu naturellement à la glacière) doit servir à l'analyse définitive.

Il faudra toujours, autant que possible, faire un nouveau puisage pour l'analyse ultérieure.

10 Procédé de Chauveau et Arloing. — Son grand avantage est d'éviter toute cause de contamination; l'eau est directement puisée dans une pipette stérilisée, et n'en sort que pour tomber dans les ballons de bouillon, fractionnée en gouttes très fines. La pipette, fabriquée ainsi que nous allons l'expliquer, est stérilisée et privée de la plus grande partie de son air au moyen du chaufi'age ou de l'aspiration par une trompe et scellée à la lampe. Elle est transportée au lieu de la prise ; Textrémité

effilée est plongée dans Teau et brisée à ce moment avec une pince ou des ciseaux stérilisés. L'eau se précipite jusqu'à une certaine tiauteur sans jamais atteindre le coton; si le vide n'avait pas été fait on pourrait aspirer avec un tube en caoutchouc. Lorsque la pipette est suffisamment chargée, on la retire et on scelle à la lampe son extrémité effilée. Il faut avoir soin.

Fig. 213.

Pipette de Chauveau et Arloing en place pour rensemencement en ballons de bouillon de l'eau à analyser.

avant de retirer la pipette de Teau, lorsqu'elle est assez remplie, de briser la grosse extrémité de la pipette pour permettre la rentrée de Fair à travers le coton et empêcher ainsi qu'il ne pénètre par l'effilure avant que celle-ci soit scellée hors de l'eau.

Il s'agit, alors, de répartir cette eau dans des ballons ou tubes de bouillon; on le fera de préférence sur place, aussitôt après le puisage, sinon on transportera la pipette dans un manchon de glace. Pour faire l'ensemencement sur place, des tubes de bouillon sont plus faciles à transporter que des ballons. La répartition exige un support métallique (A) destiné à mainte-

nir la pipette (B) légèrement inclinée dans une position qui restera la même pendant toute l'expérience (fig. 213). Une pince, une lampe à alcool, un tube de caoutchouc du diamètre de la pipette compléteront Toutillage. La pipette a été jaugée, comme il sera dit plus loin, et des traits à la lime indiquent les i/4 de centimètre cube. On se tient prêt, ayant à portée de la main gauche un panier métallique contenant les tubes de bouillon, à portée de la main droite un panier vide pour recevoir les tubes ensemencés ; on prend le caoutchouc (G) entre les lèvres et on brise la pointe effilée qui est ensuite soigneusement flambée. On souffle par le tube de caoutchouc et on laisse tomber des gouttes (sans les compter) jusqu'à ce que Teau affleure un des traits de lime. A ce moment, prenant un à un de la main gauche les tubes de bouillon dont on flcumbe Torifice après que la main droite a enlevé et conservé en Tair le tampon de coton, on fait tomber dans chacun d'eux une seule goutte de Teau de la pipette. On reflambe, on rebouche et on place dans le panier de droite. II faut en général souffler pour faire tomber la goutte, en raison de Textrême capillarité de la pointe de la pipette ; c'est-à-dire qu'on aura tout le temps de passer d'un tube à l'autre avant la chute de la goutte suivante. Si toutefois une ou plusieurs gouttes se perdaient, on les noterait mentalement, ou sur un papier mis à portée de la main droite. Lorsqu'on a ainsi ensemencé 150 à 200 tubes de bouillon, on continue à faire tomber des gouttes, en les comptant, jusqu'à un trait de lime. Additionnant alors le nombre de tubes employés et celui des gouttes perdues ou tombées à la fln, on a le chifl're des gouttes correspondant au nombre de divisions des graduations de la pipette. Supposons un cas moyen. On a ensemencé 150 tubes, et il a fallu faire tomber encore 25 gouttes pour arriver à une ligne de la pipette ; on a utilisé 5 divisions de la pipette, soit 1^^1/4 (chaque division valant 1/4 de centimètre cube). 175 gouttes pour l^c, 25 donnent exactement 140 gouttes au centimètre cube. Chaque tube a donc été ensemencé avec 1/140» de centimètre cube. Une étiquette note ce chifi're, la nature de l'eau» la date de l'ensemencement. On rentre au laboratoire, on place les tubes à

+ 38®, et on attend huit jours avant de faire la numération des tubes fertile^. Les raisons pour lesquelles il faut attendre huit jours seront développées à propos du procédé de Miquel. Supposons que 50 tubes sur 150 soient troubles, on a le nombre de microbes par centimètre cube (x) au moyen d'une simple proportion :

L'eau en question contient 46 à 47 microbes par centimètre cube, soit 46 666 microbes par litre.

Nous répétons que ce procédé est parfait lorsque Teau n'est pas trop riche en microbes. On verra plus loin (procédé de Miqcel) quelle proportion de tubes doit rester claire pour que l'analyse soit exacte, c'est-à-dire pour que chaque tube n'ait réellement reçu qu'un seul microbe. La pipette doit donner des gouttes équivalant à i/i20« de centimètre cube au maximum ; on peut arriver à obtenir des fractions encore plus petites que 1/150« de centimètre cube.

La fabrication de la pipette est le point le plus délicat du procédé. On choisit un tube de verre d'un demi-centimètre de diamètre, de calibre aussi égal que possible dans toute son étendue. On le gradue avec du mercure en quarts ou moitiés de centimètre cube, et chaque division est marquée d'un trait de lime, qu'on noircit à l'encre. On étire alors ce tube en pipettes comme il l'a dit page 20, en ayant soin que l'efrilure soit bien dans l'axe central du corps de la pipette, et non plus ou moins latéralement. On fait un léger rétrécissement à 6 ou 7 divisions de l'origine de la partie effilée, on introduit un tampon de ouate peu serré ; on fait un second rétrécissement plus marqué que le premier, et on fait stériliser au four Pasteur. Au moment de partir pour faire une analyse on modifle la partie efiilée, qui devient, à dater de ce moment, extrêmement fragile. Délaissant le chalumeau, on se sert d'une lampe à alcool. On chaufTe au rouge la partie conique, origine de reifilure, et

396 ANALYSE BACTÈRIOLOGIOrB DB L*EAr

on IVtire lentement après Tavoir sortie de la flamme. Cette seconde efljlure aune capillarité bien supérieure à la première, elle est très flexible, et parait même souvent ne pas avoir de canal central. On saura à l'usage la valeur de la goutte, .^vec un peu d^habitude on juge à la grosseur de la pointe les pipettes qui ne donneraient pas des gouttes inférieures à llOO^'de centimètre cube. La seconde eflilure doit, comme la première, être autant que possible dans Taxe du canal de la pipette et non latérale. Les gouttes qui tomberont d'une telle pipette auront un poids sensiblement égal. On scelle la pointe à 8 ou 10 centimètres de son origine, on chaufl'e la pipette ou on la met en rapport avec une machine pneumatique, et on scelle le rétrécissement qui laisse le tampon dans la pipette. Celle-ci est prête à être utilisée.

L*inconvénient du procédé de Chauveac et ArlOing réside dans la fragilité de la pipette et dans la difficulté de son trans> port dans la glace après son remplissage. Aussi vaut-il mieux faire toujours les ensemencements sur place. Abloixg a fait construire pour cela un nécessaire composé de trois bottes en bois munies de manettes. L'une est une simple caisse munie d'un couvercle à charnière et surmonté d'une poignée. La hauteur égale 25 centimètres, les dimensions latérales 30 centimètres. Elle est divisée en quatre compartiments par deux cloisons en croix, trois de ces compartiments contiennent trois paniers métalliques renfermant chacun cinquante tubes chargés de 3 ou 4 centimètres cubes de bouillon ; le quatrième contient la pince, la lampe à alcool, le caoutchouc, les étiquettes, etc. Des blocs de ouate empêchent tout ballottement. La seconde boîte (hauteur 17 centimètres; dimensions latérales, 35 centimètres) est également divisée en quatre compartiments pour loger quatre ballons à fond plat (voy. fig. 23) chargés de gélatine. La troisième boite est uniquement destinée au transport des pipettes dont on emportera toujours une provision pour parer à tout accident. C'est une espèce d'étui plat, long de 55 centimètres, large de 15 centimètres, haut de 6 centimètres, formé de deux valves en bois dans lequel pénètre à frottements une planchette percée de petits trous sur laquelle

les pipettes sont fixées parallèlement au moyen de caoutchoucs. Deux taquets de la valve qui se referme sur la première rendent la planchette ahsolument immobile ; on peut encore garnir avec du coton. Une manette permet de porter cette boîte.

2^ Procédé de Miquel. — Dès 1879, Miquel a préconisé la a méthode du fractionnement dans le bouillon » basée sur la dilution de l'eau à analyser dans un volume connu d'eau stérilisée, pour arriver à n'ensemencer qu'un seul microbe en faisant tomber une grosse goutte du mélange dans chaque ballon de bouillon.

C'est surtout pour cette méthode que les modes de puisage, de transport, etc., décrits plus haut sont utiles.

Miquel voudrait que les analyses d'eau soient faites par tous les bactériologistes dans un bouillon invariable et il propose le suivant :

Peptone Cbapoteaut 20 grammes.

Sel marin 5 —

Cendres de bois 0 gr. 10.

Eau ordinaire 1000 grammes.

La dilution de Teau se fait dans des matras Pasteur à fond plat d'une capacité variant de 30 centimètres cubes à 2 litres, qui sont à moitié remplis dun volume connu d'eau distillée. On ajoute le volume nécessaire de l'eau à analyser et on agite vivement. On prélève le mélange avec des pipettes jaugées et stérilisées (fig. 214) donnant à peu près 25 gouttes au gramme.

La distribution se fait dans 36 ballons de bouillon, à la dose de 1 goutte dans 18 ballons et 2 gouttes dans les 18 autres. On ensemence de même 36 ballons avec les mêmes doses d'une dilution deux fois plus forte. Les 72 ballons sont mis à Tétuve à-f- 3o^ pendant quinze jours. On compte alors les ballons troubles et on fait la numération. Pour que l'analyse soit bonne, c'està-dire pour que, selon toutes les probabilités, la goutte ensemencée n'ait contenu qu'un seul microbe, il ne faut pas.

d'après Miquel, plus de 30 ballons troubles pour 100, soit 2t sur 72 ; s'il y en a davantage, la dilution n*était pas assez forte.

Une analyse d'eau peut, d'après Miquel, être mise en train en 20 minutes par ce procédé.

Supposons que 108 gouttes d'eau aient été ensemencées dans 72 ballons (36 ayant reçu 1 goutte, et 36 2 gouttes ; la goutte valant --^ de centimètre cube). La dilution était à 1/1000. Supposons que IG ballons se soient troublés en quinze jours : 108 gouttes d'eau à -—j- renfermaient 16 microbes ; 108 gouttes représentent 4^,3 environ ; 4*«,3 de la dilution renferment donc 16 microbes ; l'eau à analyser en contenait 1000 fois plus, soit 16 000. Un centimètre cube en contenait 4,3 moins, c'est-à-dire 3 651,162 environ. L'eau à analyser possédait 3 651,162 microbes par litre.

Appelons G le nombre de gouttes ensemencées, N le nombre des ballons troubles, T le litre de la solution, en supposant 25 gouttes au centimètre cube. Appelons Q le

Fig. 214.

Pipettes jaugées et slénlisées dans des tubes à essai.

quotient -rr-> on a la formule générale :

-—• xT = X microbes par centimètre cube, x x i 000 = le nombre des microbes par litre.

3^ Procédé de H. FoL — 11 est plus compliqué que celui de MiuuEL, sans avoir sur lui d'avantages marqués.

La dilution, au lieu d'être faite dans de l'eau stérilisée, s'opère d'emblée dans le bouillon nutritif qui est à son tour reparti en ballons.

Nous renvoyons ceux qui désireraient connaître les appareils de H. Fol à son travail des Archives des sciences physiques et

naturelles de Genève (1884). Nous déconseillons cet outillage compliqué .

C) Analyse par cultures sur milieux solides

Le grand avantage de la méthode des cultures sur milieux solides est de bien isoler chaque élément microbien qui donne une colonie séparée ; la numération est ainsi plus exacte. Cette exactitude n'est cependant qu'apparente, car nombre de microbes qui auraient pullulé en bouillon ne végètent pas sur gélatine : aussi l'analyse d'une eau sur milieux solides donnet-elle des chiffres toujours inférieurs à ceux de l'analyse de cette même eau en milieux liquides, malgré la possibilité d'introduire deux microbes dans le même ballon de bouillon. La méthode des milieux solides permet une analyse qualitative sommaire par l'examen de la forme des colonies. Nous savons déjà que Kogh en fut l'inventeur.

1^ Cultures sur plaques de gélatine ensemenoée liquide.

— C'est le procédé primitif de Koch plus ou moins modifié. Il n'a rien de spécial. Nous renvoyons pour le manuel opératoire au chapitre v où nous avons déjà décrit la façon de faire une culture sur plaque de gélatine (page 171). Il suflira de mettre dans chaque tube de gélatine une quantité connue de l'eau à analyser plus ou moins diluée suivant les cas. Le nombre de colonies développées donnera le nombre des microbes contenus dans la quantité d'eau ensemencée.

La plaque de Koch peut naturellement être remplacée par le tube d'Esmarchy la boite de Pétri ^ et tous les autres appareils perfectionnés décrits au chapitre v. Lorsque nous employons la gélatine, nous nous servons de ballons en entonnoir renversé, à large fond plat, à petit orifice (fig. 23) dans lesquels la gélatine est stérilisée.' On verse une quantité d'eau connue dans la

* RiBTâCH (1890) fait ses analyses sur gélatine en répartissant cellesci dans des godets de verre très analogues aux boites de Pétri et qui sont antérieurs à la découverte de Pbtri, puisque Nicati et Rietsch les ont décrits en 1885.

400 ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE DE l'EAU

gélatine liquide, on agite et oq laisse prendre le milieu qui s'étale en couche mince sur le fond. On peut noter, par des points à Tencre, sur la face inférieure du fond les colonies qui apparaissent. On peut aussi décalquer le fond sur des ronds de papier où on dessine jour par jour les colonies à mesure qu'elles apparaissent. On fera aisément la numération en plaçant sous la plaque une feuille quadrillée, ou en traçant à Fencre des lignes perpendiculaires qui formeront un quadrillé utile même très irrégulier. On comptera carré par carré. Ces quadrillés feront aussi des points de repère précieux.

Un inconvénient sérieux des cultures sur gélatine des microbes des eaux réside dans le grand nombre de colonies liquéfiantes qui en quelques jours envahissent toute la plaque et mélangent toutes les colonies. Pour y remédier on peut employer de la gélatine-gélose (page 111) ou la formule de Girard ; ces milieux liquéfient moins facilement. Voici la formule de Girard :

Eau iOOO grammes.

Gélatine blanche 40 —

Phosphate de soude 0 gr. 02.

On clarifie avec un blanc d'œuf, on fait bouillir, on filtre et on stérilise à+ US**.

G. Roux arrête le développement des colonies liquéfiantes à mesure qu'elles se forment en les vernissant avec du stérésol (de Berlioz) qui arrête le développement de la colonie sans diffuser sur toute la plaque de gélatine.

La boîte de Pétri ou le tube d'Esmarch sont plus commodes que le ballon conique pour aller puiser les colonies et les réen* semencer.

En mettant une très petite goutte d'eau dans chaque récipient de gélatine on peut éviter les dilutions. 11 suffît, en tout cas, d'opérer avec trois tubes de gélatine comme il a été dit page 174.

2^ Cultures sur plaques de gélatine ou de gélose, ensemencées symétriquement après solidification. — C'est le

ANALYSE QUANTITATIVB DE l'EAU

procédé (rArloing.M a surtout pour but d'éviter la contamina*) tion de la plaque par des germes étrangers à ceux de Teau à analyser. On laisse tomber en des points symétriques une série de gouttes d'eau sur la surface d'une plaque de gélatine ou de gélose solidifiée ; touie colonie développée en dehors des points ensemencés ne sera pas comptée dans la numération.

Fig. 213, Analyseur bactériologique (TArloing,

Ce procédé repose tout entier sur l'emploi d'un analyseur bactériologique spécial'. Cet appareil (flg. 215] consiste en une boîte rectangulaire en cuivre nickelé longue de 25 centhnètres sur 8<»%5 de largeur et 3*^", 5 de profondeur. Le couvercle est formé de deux lames de verre (5 et 6) mobiles autour de charnières fixées aux deux bords externes les plus étroits. Un intervalle de quelques millimètres sépare les deux lames et est occupé par un couvre-joints en métal (3) glissant sans frottement et présentant à son milieu un orifice étroit (T) entré

' Arloing, Appareil pour llaf^alyne baetérjûlogique des eai4Xj R^Yufi d'hygiène. 1M8. p. 475. . . . . 1

PRâCIS DE BACTÊRIOLOGIB. 2* édit. 26

402 ANALYSK UACTÉRIOLUtilQUE DE L KAl*

deux languettes métalliques souples (a,a). Une plaque tie cuivre, de la dimension des plaques de verre quadrillées, est au fond de la boite, munie d une crémaillère qui est actionnée par le bouton (7). Quatre montants prismatiques (ce) servent à maintenir la plaque de verre. L'index (8) sert à mesurer Tavancement de la plaque; deux crans du bouton (7) font avancer la crémaillère de 1 centimètre. A une des extrémités de la boîte est une forte plaque de cuivre munie d'une coulisse; elle porte la tige (2), destinée à tenir la pipette, et une crémaillère actionnée par le bouton (9). Cette seconde crémaillère se meut perpendiculairement à la première et sert à déplacer latéralement la pipette. La plaque de verre a i2 centimètres de long sur o centimètres de large ; elle est divisée en soixante carrés par un quadrillage. On stérilise la boite et on introduit la plaque chargée de gélatine solide par une petite porte opposée au bouton (9). La pipette (4) qui contient l'eau à analyser est fixée à la tige (2) et son extrémité effilée pénètre à frottement entre les tiges (a) dans le trou (Tj. Dès qu'une gputte est tombée au milieu d'un carré on tourne de deux crans le boulon (7) et on fait ainsi tomber une goutte au centre de cl^/mue carré. La première ligne ensemencée, on déplace latérAJ^ment la pipette, qui entraîne le couvre-joint (3), au moyen du bouton (9). On a ainsi une plaque quadrillée de gélatine ayant rerxi une goutte d'eau au centre de chaque carré.

G. Uoux a simplifié le procédé d'ARLOixG en se servant d'un petit appareil dans lequel la pipette est immobile, tandis que la plaque de gélatine se déplace circulairemenL

d'' Procédés approximatifs de MiqueL — Miquel décrit souS'Ce nom deux séries d'opérations approximatives qui peuwnt rendre des services.

Le principe est le suivant : faire végéter les colonies sur un papier nutritif imprégné de gelée de lichen qui, traité ensuite au bleu d'indigo, ne se colorera qu'au niveau des colonies. On trouvera tous les détails de la préparation de ce papier dans V Annuaire de Montsouris pour 1886, p. 519 et suivantes.

ANALYSB QUANTITATIVE DE L'eAC 403

Nous ne parlerons que du procédé le plus simple décrit en 1890. Le papier nutritif, taillé en reclangle et muni d'un fil suspenseur en platine, enveloppé de papier Joseph, est mis à Tautoclave pendant une heure â + 110<*. Au moment de l'analyse, on le suspend par le fil de platine dans une éprouvette bouchée à l'émeri. On le tare très exactement et on le plonge dans l'eau à analyser. En cinq minutes la gelée est gonflée, imhibée d'eau. On le remet dans l'éprouvette et on fait une seconde pesée qui donnera le poids de l'eau absorbée. Le tout est alors mis à l'étuve. Au bout de quinze jours, on retire le papier, on le dessèche bien + 45S et on le plongQ pendant quelques minutes dans une solution aqueuse d'alun cristallisé, pm& dans de l'eau pure. La gelée est alors plus mordante. On a préparé ou second bain colorant de la fa(;on suivante : 2 grammes d'indigotine cristallisée ont digéré pendant vingt> quatre heures dans 50 grammes d'acide sulfurique fumant ; on ajoute un litre d'eau; on neutralise. On trempe le papier dans ce second "bain ; il se colore tout entier, les colonies en plus foncé. On lave à l'eau et on met dans une solution de permanganate de potasse à y^ôU" pendant une demi-heure. La gelée de bleu est devenue violette, puis rose. On lave. On trempe dans une solution faible d'acide oxalique à 3 ou 5 p. 100. On lave. Les colonies tranchent en bleu sur le papier redevenu blanc. MiQUEL a reproduit ces feuilles dans V Annuaire de Montsouris pour 1886. L'indigo est une couleur très fixé : aussi, loin de se décolorer, ces feuilles se foncent-elles à. la lumière.

On compte les colonies bleues et on les rapporte à la quantité d'eau employée.

4» Numération des colonies par la photographie. — G. Roux a proposé d'enregistrer les colonies de la plaque de gélatine en appliquant celle-ci sur un papier sensible. La gélatine est répartie à la dose de 2 centimètres cubes dans de larges tubes à essai comme pour la méthode d'Esmarch. Après l'ensemencement, on couche les tubes horizontalement sur une planchette munie à ses deux extrémités d'encoches demicirculaires. La gélatine est donc en plaque plane et non enrou-

404 ANALYSE BACTéniOLOGIQUE DE l'bAU

lée. Lorsque les colonies ont apparu, on glisse sous Tenseinble des tubes un papier sensible au ferrocyanure de potassium et on met le tout à la lumière (pas trop vive pour éviter la fusion de la gélatine). Lorsque le papier est gris bleu, on le retire brusquement, on le lave à grande eau et on laisse sécher. Les plus petites colonies se détachent en blanc sur fond bleu. On répète cette opération tous les deux ou trois jours et on conserve tous ces documents datés.

. § 3. — Analyse qualitative

L'analyse qualitative, avons-nous dit, est le but vers lequel doit tendre le bactériologiste chargé d'examiner une eau au point de vue microbien. Il est plus important de savoir le nombre et le nom des espèces microbiennes contenues dans une eau que de calculer le nombre des individus non déterminés qui la souillent. Malheureusement, la classification des microbes, la détermination de Tespèce, se heurtent, comme nous l'avons développé dans Vlntroduction (p. 0), à des difAcultes presque insurmontables. Si on réfléchit, en outre, que nombre de microbes [B. tuberculeux. Gonocoque, etc.] ne poussent pas sur les milieux ordinairement employés pour les analyses d*eau, que beaucoup de microbes pathogènes nous sont totalement inconnus, on se rend compte de la prudence avec laquelle doivent être rédigées les conclusions d'une Analyse qualitative. Enfin l'analyse qualitative, n'ayant pas de technique fixe, mais exigeant de celui qui l'entreprend une foule de coa^ naissances non seulement en bactériologie pure, mais en physiologie, en chimie, en pathologie, etc., aura la valeur de celui qui Ta dirigée, bien différente en cela de l'analyse quantitative qui, suivant l'expression de Miquel, peut ôlre faite par un bon garçon de laboratoire.

L'idéal de l'analyse qualitative serait l'énumération de toutes les espèces contenues dans un échantillon d'eau; cette analyse qualitative générale suivrait donc forcément l'analyse quantitative qui aurait isolé les germes. On se contente an général

de Vanalffêe qualitative fpéciale^ o'est'-à-dire de rechercher si une eau contient tel microbe pathogène donné.

A) Analyse qualitative oéneralb

Une fois en possession des cultures pures des microbes d^une eau, on se servira, pour différencier les espèces, de tous les moyens qui sont à notre disposition et que nous avons étudiés au chapitre v : cultures successives, sur difîérents milieux, à différentes températures ; on fera Texamen macroscopique et microscopiquç, examen chimique des bouillons de culture, on inoculera aux animaux, etc. Nous n^avons pas à revenir sur ces méthodes. Toutes ces constatations épuisées, comment pourrat-on appliquer un nom à chaque espèce? Existe-t-il des tables dichotomiques qui puissent guider le microbiologiste et le conduire au nom de Fespèce par éliminations successives? Existet-il en un mot des ouvrages sur les flores microbiennes comparables à ceux qui traitent des flores végétales générales? Peuton déterminer les microbes d'une eau, comme les plantes d^une montagne ? Plusieurs auteurs ont tenté la description des microbes des eaux et la création de tables dichotomiques; ces publications rendront des services, à la condition expresse de se souvenir qu'elles n*ont rien d'absolu, que tous les caractères sur lesquels se basent leurs classifications sont trop variables pour que la détermination d'un microbe soit comparable à celle d'une plante plus élevée ; le microbe est situé trop bas dans l'échelle des êtres pour être aussi facilement individualisé (voy. Introduction). Nous renvoyons plus spécialement le lecteur aux ouvrages de Lustig*, Eisbnbbrg*, G. Roux ' pour la description des microbes habituels des eaux.

B) Analyse qualitative spéciale

Le problème devient plus abordable lorsqu'on demande au bactériologiste si un échantillon d*eau contient telle espèce

* LusTiG, ÙiagnosHca dei Ballet^ délie acque. Torino. 1890.

* EtSENBKiin,l?aA/mo/o.7t>cA« Dintfnontik (Hamburgund Leipiig,1691) •

* G. Roux, Loc. cit., ch. IX.

406 ANALYSE BAGTÉniOLOGîQUE DE L'&AC

microbienne connue. La plupart des microbes pathogènes ont été rencontrés dans Teau. Citons le Staphylococctis pyogenes aureus * (Ulmann), le Micrococcus cereus albm (Tils), le Micrococcus du clou de Biskra (Heydbnrbich) , le Coccus B. de Fontin^ le Bacillus anthracis^ (Poincarb), le Bacille du choléra des poules (Koch), le Bacillus muriseplicus (Koch), le Bacillus pyocyaneus (Tils), le Bacille delà tuberculose (Guinard), etc.

Les vases et par conséquent les eaux boueuses contiennent presque toujours des microbes anaero6t>« extrêmement dangereux, tels que le Vibrion septique (gangrène gazeuse), le Bacille de Nicolaïer (tétanos). G. Houx, Arloing, Lortkt, etc. les ont constamment trouvés dans la vase des galeries de filtration de la Compagnie des eaux de Lyon. Miqi'el les a rencontrés dans Teau de la Seine et de la Marne, Lortet dans Teau de la mer Morte. Nous avons déjà indiqué la façon de rechercher ces microbes (chapitre vi, page 210) : on emploie l'inoculation de la boue sous la peau du cobaye (O^MO par 100 grammes de poids vif environ). On laissera déposer ou on centrifugera l'eau pour avoir une concentration de ces microbes. On pourra aussi, mais avec plus de dillicultés, employer les méthodes d'isolement des anaérobies que nous avons décrites au chapitre vi.

Nous avons laissé pour la fin la recherche des microbes pathogènes qui se trouvent le plus fréquemment dans Teau, engendrant des épidémies dues incontestablement à Tingestion d'eaux contaminées : fièvre typhoïde, choléra. Ces deux questions sont d'une importance capitule et sont loin d'être complètement résolues à l'heure actuelle.

* J. COL'RMONT a vu que le Staphylocoque pyoyène pouvait vivre pendant plusieurs mois dans l'eau distillée [Slaphylococcie. Traité de médecine Brouardel, 181)5). C'est d'ailleurs dans l'eau de la Seine que Pasteur avait découvert, en 1880, un coccus pyogène.

* Les filaments ou spores du B. anthracis peuvent vivre dans l'eau jusqu'à 431 jours (Dubahry. Th. Pans. 1889). Karlinski les a vus au contraire disparaître dans l'eau en trois à cinq jours. {Loc. cit., 1889- 90.) Consulter le travail de Stk.vus et DruAnav : la vie des microbes pathogènes dans Veau (A. de méd. exp., 1889). où est indiquée la durée du pouvoir végétatif de (|uelques microbes (charbon, choléra, bacille typhique, pus vert, érysipèlei dans des eaux différentes.

UEGHERGHB DU BACILLB TYPIIIQUE DANS L*EAU 407

!"> Fièvre typhoïde. Recherche du B. d'Eherth et d« Colihacille dans les eaux. — Le rôle de Teau dans la propagation de la fièvre typhoïde est trop solidement établi pour que nous fassions autre chose ici que rappeler ce principe. La fièvre typhoïde étant causée par un microbe des mieux connus, le Bacille d'Eberth (Eberth, Gapfky, Chantbmesse et Widal), il semble très simple au premier abord de savoir si une eau est typhogène ; il suflirait pour se prononcer de constater Tabsence ou la présence de ce microbe dans un échantillon de celle-ci. Il en était ainsi il y a quinze ans. Dès qu'une épidémie de fièvre typhoïde surgissait dans une ville, dans une maison, on recherchait Teau de boisson consommée, on analysait celleci et la culture y décelait le Bacille d*Eherih (Brouakdei., Thoi- NOT, Ghantbmsssb, etc).

Malheureusement, les choses n*étaient pas aussi simples. 11 existe dans l'intestin de Thomme et de la plupart des animaux, et par conséquent dans toutes les eaux souillées de matières fécales, un bacille, très voisin du B. dEherth ; c'est le Colibacille j décrit par Escherich sous le nom de Bacillm coli communis (voy.p. 668). Jusqu^en 1889, ce microbe était considéré comme un vulgaire saprophyte, hôte banal de l'intestin ; on croyait aussi pouvoir le distinguer facilement du B. d'Eberlh. C'est ici que se placent les travaux de Rouet et G. Roux, de Lyon^ (les auteurs commencèrent par démontrer que les caractères distinctifs de ces deux microbes, considérés jiisqucn J8S9 comme suilisants, ne permettaient pas la diagnose ; que les cultures du J3. d'Eberth, obtenues si fréquemment par l'ensemencement d'eaux suspectes, étaient toujours ou presque toujours des cultures de Colibacille, Il ne faut pas oublier qu'à cette époque on distinguait le B. d'Ebej'thdvL Colibacille par les seuls caractères macroscopiques des colonies sur gélatine et surtout sur pomme de terre, caractères secondaires et variables qui ne pouvaient compenser les nombreux

* RoDET et Roux, Soc. de Biologie et Soc. des sciences médicales de Lyon. 1889, 1890, etc. et Arch. de médecine expérimentale ^89i, p. H17.

408 AHALtSE BAGTÉRIOLOOIQUB DE l'BAU

points de ressemblance des deux microbes* Continuant leurs travaux, H0O8T et G. Houx montrèrent que le B. (TBbërth de se rencontrait presque jamais dans Teau (méthodes antérieures à 4889)^ qu'il' périssait d'ailleurs rapidement, même dans du liquide de fosse d'aisances filtré S qu'on ne le trouvait presque jamais (en 1889) dans les selles des typhiques. Ils montrèrent tn outre que le Colibacille est non Un saprophyte, mais bien un microbe pathogène (Laruelle, Tavel, Rodbt, etc.). Leur conclusion fut que le B, d*Eberth n'était qu'une variété de Colibacillei variété moins résistante, ayant perdu une partie de ses propriétés, à la suite de la pénétration du Colibacille dans le corps des typhiques î le type du B. d*Bberth s'obtiendrait seulement en ensemençant le suc de là rate des typhiques. Sous des influences encore mystérieuses, le Colibacille deviendrait typhogène et se transformerait en B. d'Eberth.

Cette théorie des auteurs lyonnais a soulevé d*ardentes polémiques et occasionné un nombre incroyable de publications apportant des arguments tantôt favorables, tantôt cotttraires. N'eût-elle eu qtoe le mérite de susciter un pareil nombre de travaux intéressants, la théorie de Hoobt et G. Roux aurait sa place marquée dans la science. A partir de ce moment, la Colibacillose a été créée de toutes pièces ; le Colibacille s'est élevé du rang de vulgaire saprophyte à celui de bacille pathogène chargé de nombreux méfaits. A partir de ce moment, des caractères importants de difl'érenciation ont été cherchés et découverts : fermentation de la lactose, coagulation du lait par le Colibùcille (Chantemesse et Widal, Peroeéx, DUBiBr) agglutination par le sérum des typhiques, etc.

Actuellement la question est jugée. Les expériences de RoDET et G. Roux étaient très remarquables pour l'époque (1889) où elles ont été publiées. Les réserves faites par ces auteurs étaient, alors^ justiflées. Botaniquement, ils avaient raison. Mais, au point de vue pathologique, à la suite des travaux précisément suscités par eux, le doute n'est plus permis. Le

* Vallrt, Le Bacillu9 coli dans ses rapports avec le tiacille d*Eberih, Th. Lyon, 1892.