CHAPITRE V

TECHNIQUE GÉ.\ÉRALE DES CULTURES

A. CcLTUBE DES MICBODBS AÉROBIES.

I. Culture dans les milieux liquides : culluic dans les bouillons, le lait, etc.

II. Culture dans les milieux solides transparents et demi-transparents : gélatine, gélose, sérum.

[II. Culture sur milieux opaques: punîmes déterre. IV. Culture en plaques.

B. CoLTURE DES siicnoriES ANAÊnoniES : Culture dans les bouillons, le lait etc., sur gélatine, sur gélose, sur pommes de terre, en plaques.

Les cultures se font tantôt en présence do l'air, tantôt il l'abri de l'air, soit dans le vide, soit en yirésence d'un gaz inerte.

Le premier procédé convient aux microbes aérobies, le deuxième aux microbes absolument ou facultativement anaérobics.

Nous décrirons donc successivement :

A. La culture di'n microbes (icrobics :

n. Iai culture des microbes aiKulrobies.

A. CULTURE DES MICROBES AÉROBIES

Les niilioux de culture employés sont, ainsi ([ue nous rav(ms dit ailleurs, //V/ii/i/t.s ou solides, et les

TECEiNIQUE DES CCLTURES.

milieux solides sont eux-mêmes transparents, demitransparents, opaques. Nous aurons donc à traiter successivement de la culture sur ces différents milieux.

Mais avant d'aborder notre sujet, disons un mot de l'emploi de deux appareils qui sont les instruments essentiels de la pratique des cultures : la pipette Pasteur et le fil de platine.

Pipettes Pasteur. — Nous avons indiqué ailleurs (V. chap. II) ce qu'était la pipette Pasteur, comment on la construisait, comment on la stérilisait à l'intérieur : nous avons dit aussi dans une autre partie (V. chap. IV) quelles précautions on devait observer quand on se sert de cet appareil. Une rapide redite à ce sujet ne saurait cependant être inutile.

Pour faire usage de la pipette, préparez-la de façon suivante : prenez un de ces petits appareils préalablement flambés dans le four Pasteur; détachez-en la pointe (1) en laissant à reflilure une longueur variable : lorsque la pipette doit être portée dans un vase à culture, matras ou tube, l'effilure doit rester assez longue. Flambez la surface extérieure de l'effilure sur la lampe à alcool, de façon à y détruire tous les germes atmosphériques qui s'y sont déposés pendant l'exposition à l'air; la pipette est alors prête pour Tusage voulu.

Fils de platine. — On doit avoir des fils de platine dedifl'ércnts diamètres, et il est indispensable d'en posséder dont lextrémité libre soit aplatie à la façon d'une petite palette (fig. 22 et 22 his).

Les fils de platine doivent être d'une longueur supérieure à celle dos tubes à essai; ils sont mon-

(1) On détaclie 1» pointe d'une pipette soit .ivec le doigt ilirectcment, soit apn\s :noii- marqué un trait de lime à l'endroit choisi pour la coupure.

CULTURE DES MICROBES AÉROBIES

tés sur le petit appareil connu en histologie sous le nom de porteaiguille, appareil dont la garniture en cuivre permet de variera volonté la longueur du 111 qu'elle engaine, et assure la fixité parfaite de celui-ci.

Les Allemands montent ordinairement les fils de platine sur une baguette de verre plein, et cette monture se fait cxtemporanément.

Nous ne la conseillons pas, car il est impossible avec elle de varier la longueur du fil; la fixité est moins grande; et la pratique du flambage fait à tout instant éclater Textrémité du verre dans laquelle s'enchâsse le fil de platine.

Lorsqu'on doit se servir du fil de platine, on commence par le stériliser, ce qui se fait en le portant au rouge dans toute son étendue sur la flamme de la lampe à alcool, d'un bec Runsen. etc., et on attend qu'il soit rcfi'oidi, ce qui n'exige, on le sait, que quelques secondes; l'appareil est alors prêt pour l'usage voulu, mais il faut s'en servir dès qu'il est froid, sans délai, soiif^ pcimi de perdre tout le liénélicc de la stérilisation.

En règle absolue, dès que le fil de platine a été mis en usage, il doit être soigneusement sl&rilisé, de façon à ce qu'il no reste à la surface aucune parcelle do substanm virulente.

(■•it:

TECHNIQUE DES CULTURES

I. Culture dans les milieux liquides. Culture dans les bouillons.

Nous ne parlerons dans cet article que de la culture dans les bouillons; ce que nous en dirons sera facilement appliqué, s'il y a lieu, au lait, à Yiiriiie, aux liquides minéraux, etc.

On prend un matras Pasteur contenant un bouillon stérilisé suivant les règles indiquées, et ayant, sans se troubler, supporté l'épreuve d'un séjour prolongé à l'étuve entre 3b° et 40°. La technique générale de la culture qu'on se propose de faire dans ce bouillon comprend deux opérations :

A. L'ensemenceincnl ;

B. La mise à la température voulue.

— A. Ensemencement. Cette opération comporte : a) L'ouverture du matras ;

6) L'ensemencement proprement dit, c'est-àdire l'acte de déposer la semence dans le bouillon; c) La fermeture du matras.

Savoir ouvrir et fermer j^uronent un matras, c'està-dire de façon à n'y introduire aucun germe étranger, est chose essentielle; qu'il s'agisse de porter ou de prélever la semence dans le matras, la manœuvre est identiquement la même; elle exige les mêmes précautions. Nous allons, une fois pour toutes, décrire la manière de l'exécuter.

Pour ouvrir un matras, placez-le dans la paume de la main gauche tenue horizontalement; iîic/me-le de telle façon que son ventre repose dans la paume de cette main, et que son col fasse avec celle-ci un angle de 4b° tout au plus.

Maintenez le matras en position avec le pouce et les doigts de la main gauche. Débouchez-le de la main droite, tenez le iiouchon entre le troisième et le quatrième doigts de la main droite, et, sans chanijer la position du ballon, sans bouger la main

CULTURE DES MICROBES AÉROBIES

qui le lient, clïecluez l'opération (ensemencement ou prélèvement de semence).

Pour fermer le malras, rebouchez-le, maintenant toujours et YincHnaifton du. ballon et Vimmobilitéde la main; quand il est bouché, vous pouvez le redresser, mais seulement alors.

En ouvrant et en formant lemalras suivant cette technique, vous éviterez que les poussières atmosphériques ne viennent en souiller le contenu.

]j ensemencement proprement dit consiste, dès que le malras est ouvert, à porter avec la main droite la semence contenue dans une pipette Pasteur ou à l'extrémité d'un fil de platine stérilisé sur le fond du ballon. On dépose en cet endroit rapidement la semence, et on retire aussitôt la pipette ou le fil de platine.

Les malras ensemencés doivent être pourvus tout aussitôt d'une étiquette indiquant la nalure de la culture, sa provenance, et la date de l'opération.

Telle est la technique générale de rensemencemcnt d'un bouillon; nous allons maintenant passer en revue les divers cas qui peuvent se présenter dans la pratique de cet ensemencemont.

1. Ensemencement immédiat des produits recueillis à raulopsic. — Ces produits sont, ainsi que nous l'avons dit (V. ciiap. IV.) recueillis dans des pipettes F'asteur. Dès que la semence est prélevée dans l'organe, sans fermer la pipette, prenez un des malras Pasteur que vous aurez placés à votre portée, disposez-le dans la main gauche, ainsi qu'il a été dit, débouchez-le et portez rapidement FiixIrémiLé de la pipetli: sur le fond. Si la semence est liquidi', une goutte tombera (l'(di(! niènu; en donnant a hi pipette une légère inclinaison; si la semence est plus ('paisse, soufllezà ti'uvers le tampon d'ouate par la grosse extrémitc'; do la pipette, de façon a

TECHNIQUE DES CULTURES

faire tomber une parcelle de cette semence sur le fond du matras.

Dans certains cas (quelques lésions tuberculeuses par exemple), l'ensemensement des pulpes exige certaines précautions préalables; il faut broyer la pulpe pour mettre les bacilles en liberté ; on devra, dans ces cas, renoncer à l'ensemencement immédiat, fermer la pipette, et agir comme nous allons le dire ci-dessous.

2. Ensemencement tardif des produits recueillis à l'autopsie. — Dans ce cas les pipettes ont été fermées et c'est dans leur intérieur qu'il faut aller prélever la semence.

Disposez à votre portée le matras à ensemencer, une pipette B ou un fil de platine. Pi'enez la pipette A qui renferme la semence, enfoncez le tampon d'ouate dans l'intérieur du tube jusqu'à petite distance delà face supérieure delà semence; faites sur le verre, au niveau du milieu du tampon d'ouate un trait de lime circulaire, et coupez en cet endroit la pipette avec le charbon de Berzélius ou une pointe de verre rougie à blanc sur le chalumeau à gaz.

Préparez alors la pipette B, c'est-à-dire brisez son extrémité cflilée et flambez sa surface externe, ou le fil de platine, c'est-à-dire passez-le dans la flamme.

Enlevez le tampon d'ouate de la pipette A que vous venez de couper, flambez son extrémité ouverte (1) et portez la pipette B, ou le fil de platine, dans l'effilure où est contenue la semence.

(I) Celte pratique est fort inii)orlante : elle a pour but ilo détruire tous les geniies qui se sont déposés sur la surface extérieure (le la pipette au niveau du poiut où l'on a l'ait l'ouverturo. Ces germes pourraient souiller l'exti-éiuité de U pipette H ou du fil de platiuesi,au moment où on va les porter dans l'eflilure de la pipette A, CCS instruments ventiient à entrer en contact avec cette surface.

CULTURE DKS MICROBES AÉROBIES.

Si vous faites usage de la pipcltc pour prélever la semence, opérez de la f^çon suivante ; la main gauche tenant la pipette A, aussi inclinée que possible, avec la main droite portez relTilure de la pipette B sur la semence et aspirez.

llejetez aussitôt la pipette A, et, sans déposer la pipette 13, qui restera dans la main droite, saisissez le matras, disposez-le dans la main gauche, ouvrez-le et portez-j- la semence.

Si vous faites usage du fil de j}laiine, il sera commode de placer horizontalement la pipette A débouchée, ouverte et tlambée à son extrémité entre deux des doigts delà main gauche; dans cette même main on disposera le matras, on le déboucliera, et la main droite tenant le fil de platine stérilisé le plongera dans TetTilure de la pipette A, et immédiatement après le portera dans le matras.

Dans certains cas, avons-nous dit, la pulpe doit être broyée avant d'être ensemencée. Cette pratique a pour but de mettre en liberté les microbes emprisonnés dans les tissus. L'opération se fait facilement avec un fil de platine fort, de diamètre un peu inférieur au diamètre intérieur de l'effilurc de la pipette qui contient la semence. On introduit le fil de platine stérilisé et refroidi dans reflilure de cette pipette; coupée, ouverte et flambée, comme nous l'avons dit ; on imjjrinK! au fil de platine des mouvements de rotation, d(! va-et-vient, et lorsqu'on juge ([ue la trituration est suflisante, on procède à l'ensemencement du matras soit avec ce même fil de [)!atine, soit avec une ])ipette (|ii'on plonge dans la substance broyée. Une précaution fort impoi-tante h observer est de laisser l'cxtn'mité du fil de platine cachée dans l'efliiure de la fii[ictte, si on se sert de cet appareil, jusqu'au moment précis cb; rensemencemeut.

■i. Ensemencement de matras à matras. — Dans

TECHNIQUE DES CULTURES

un matras A contenant la culture donnée, prélevez purement avec une" pipette quelques gouttes de liquide.

La manœuvre est simple : nous en avons indiqué, en traitant de la façon d'ouvrir et de fermer purement les matras, les éléments essentiels.

Ouvrez donc purement le matras A ; allez, avec une -pipette bien flambée à l'extérieur, cueillir quelques gouttes du liquide qu'il contient ; fermez le matras A, prenez immédiatement, et sans déposer la pipette (1), le matras Bà ensemencer, ouvrez-le et portez-y une goutte de la semence dont est chargée la pipette.

4. Ensemencement dans un bouillon d'une culture provenant d'un milieu solide. Que la 'culture provienne d'un tube gélatine, de gélose, de sérum, d'une pomme de terre, la technique est la même. Recueillie purement avec un fil de platine, suivant des procédés que nous indiquerons en traitant des cultures sur milieux solides, la parcelle de culture prélevée est portée tout aussitôt dans le matras Pasteur, en observant toutes les précautions de règle.

H. Mise de la culture à la lempcralure voulue. — La température extérieure avec ses variations infinies, ses minima très bas, convient peu au développement cyclique parfait des cultures. Il est donc nécessaire de soumettre celles-ci, quand le milieu de culture ne s'y oppose pas, à une température de 3,") à 40° qui permettra une multiplication régulière, normale et rapide des germes.

L'étuve de M. Pasteur représentée ci-contre

(1) Il arrive parfois qu'uno pipette chargée de semence ne peut être ulilispe immédialenieut, mais seulement après un court délai; ilconviendra dans ce cas de rejeter, eu les laissant écouler de la pipette sur un papier-filtre (que l'on brûlera ensuite) les premières gouttes de la sonuwico ; ou enseineucera ensuite sans crainte.

CULTURE DES MICROBES AÉROBIES. 87 (fig. 23) remplit parfaitement le but, et se prêle

l'i». 2:). — F'Uuvo Pastoiir.

aux tompéraluros jusqu'à -f- 4:;". C'est une étiivi; en bois, avec doultlo i>ar()i, doiilile porte vitréi',

TECHNIQUE DES CULTURES

chauffée par la vapeur d'eau circulant à la partie inférieure de l'étuve, ce qui permet d'obtenir des températures différentes d'environ 2" par étage, allant en décj'oissant vers la partie supérieure de l'étuve. L'appareil de chauffage est en cuivre brasé et est muni d'un régulateur.

Les matras ensemencés seront donc placés dans l'étuve Pasteur; on choisira l'étage qui convient le mieux à la température cherchée ; un thermomètre devra toujours, à cet effet, être placé à chaque étage.

Pour certaines expériences (et nous citerons ici l'atténuation des virus, la recherche du degré de résistance à la chaleur etc.) il est de toute nécessité d'avoir des étuves avec régulateur permettant de lixer la température, d'une façon invariable pendant un temps indéfini. Cette condition est entièrement réalisée par l'appareil de M. le D"' d'Arsonval représenté ci-contre et que nous allons sommairement décrire, tel que l'ont fait les dernières modifications que l'auteur a apportées à sa construction (fig. 24).

L'appareil à double paroi se compose d'un cylindre vertical terminé par deux cônes. L'étuve s'ouvre par une porte latérale, et est divisée par une tablette en deux étages indépendants. Le cône inférieur porte le régulateur entièrement métallique et les deux brûleurs munis chacun d'un robinet d'arrêt. Le cône supérieur porte à son sommet la douille par laquelle se fait remplissage.

L'espace annulaire qui existe entre les deux corps de Tétuve est rempli d'eau.

Cette eau est cluiuflee parla flamme des brûleurs qui s'engage dans des tubes traversant le liquide, mode de chauffage analogue à celui d'une chaudière tubulaire.

Pour mettre Tappareil en marche, on verse par

Cl'LTURE DES MICROBES AÉflOBIES.

TECHNIQUE DES CULTURES

la douille centrale située au sommet du cône supérieur, de l'eau bouillie récemment, c'est-à-dire privée d'air. On allume les brûleurs.

Quand on veut Oxer une température, il suffit de boucher cette douille avec le bouchon qui porte un tube de verre vertical ; ce réglage est fait une fois pour toutes pour une température déterminée. Si on éteint Tétuve, elle retombera exactement au même point quand on la rallumera : l'appareil par sa construction métallique est indéréglable.

Lors donc que l'on voudra faire agir sur une culture en milieu liquide une température fixe et devant être maintenue telle pendant un temps déterminé, on placera le matras qui contient la culture dans l'étuve de d'Arsonval (l'I.

II. Culture dans les milieux solides transparents et demi-transparents.

Ces milieux sont, ainsi qu'on le sait, la gélatine, la gélose (simple ou additionnée de glycérine, glycose, dextrine, etc.) et le sérum.

La culture dans l'un quelconque de ces milieux comprend deux opérations :

1° L'ensemencement du milieu;

2° La mise à la température voulue.

La gélatine, la gélose et le sérum sont renfermés, pour la culture, dans des tubes d'essai bouchés à l'ouate.

(I) Les objets phieés dans des étuves (Pasteur, d'ArsonvaL etc.) à air ne se mettent que très lentement eu cquililire de température avec I air ambiant. C'est un inconvénient grave, lorsqu'on veut préparer des vaccins, étudier l'intlucnce d'une température donnée pendant un temps long sur tel ou tel microbe. Il faut alors ou employer des ballons séjournant depuis plusieurs jours à la température déterminée, on, ce qui vaut mieux, les plongera demi dans l'eau d'une étuve à eau munie d'un régulateur quelconque (Schlésing, Uoux, etc.).

CULTURE DES MICRODES AÉRODIES. 91

Ensemenri'v un de ces lubes comprend dois phases :

(i) L'ouvcrlurc du tube;

h) L'ensemencement proprement dit, ou inoculation, c'est-à-dire l'acte do déposer la semence dans Tépaisscur ou à la surl'ace du milieu ;

c) la fermeture du tube.

Indiquons tout d"abord, et en tète de cet article, la manière d'ouvrir et de fermer un tube de culture jmrrmeni, c'est-à-dire de façon à n'y introduire aucun germe étranger. Qu'il s'agisse d'un tube de gélatine, de gélose ou de sérum ; qu'il s'agisse de porter la semence dans le tube ou de l'y prélever, la technique est la même : en l'exposant ici nous éviterons des redites incessantes.

VouT ouvrir purement un tube de culture, placezle entre le pouce et l'index gauche, le pouce en dessus, l'index en-dessous; donnez-lui entre ces deux doigts une position ou horizontale ou à peine inclinée (t); enlevez le bouchon d'ouate, en lui imprimant un mouvement de torsion, avec la main droite, et placez-le entre deux des doigts de la main gauche.

Dés qu'il est débouché le tube doit rester immobile dans la main qui le tient, et celle-ci doit pendant tonte l'opération, quelle qu'elle soit, garder une position invariable. On évitera, en suivant strictement ces règles, que les germes atmosphériques ne viennent souiller la surface du milieu de 'cullui'o.

Pour fermer le tiUie, replacez le bouciiou et seulement alors redressez le tube; chaufTez ensuite fortement les ])ar()is du tube au niveau du liuupon

(I) lo cas tout particulier oii l'opcrulioii porlo sur un tulie

«le gcliitiiio li(|iii'fino il vu sans dire que hi position à clonniM- no peut i"lr<! l'horizontale. On se bornera à placi;r li' Inhe il.iin une- position aussi peu inclinée (pin possible.

TECHNIQUE DES CULTURES

d'ouate sur la flainmc de la lampe à alcool, en ayant soin de ne pas carboniser l'ouate ; ce flambage détruira tous les germes dont le tampon ouaté aurait pu se charger pendant son exposition à l'air. Enfin pour préserver l'ouate de toute souillure ultérieure, pour éviter l'évaporation, coiffez le tube du manchon de papier filtre dont il était pourvu avant l'opération, ou d'un capuchon de caoutchouc : cette dernière pratique doit être préférée quand il s'agit de cultures qu'on veut garder longtemps.