Le bouillon peptonisé glycériné
4. Le sérum, la gélose, le bouillon peptonisés, glycérines, et glywsés.
1. Sérum glycériné. — Scriim glycériné et peptonisé. — « L'addition de la glycérine au sérum ne complique guère la technique : dans un ballon pipette renfermant un poids connu de sérum pur, on aspire une quantité de glycérine stérilisée à 115° à l'autoclave, représentant 6 à 8 p. 100 du poids total. On mélange en agitant, et l'on distribue dans des tubes à essai que l'on porte ensuite dans l'étave à gélatinisation. Le sérum glycériné et peptonisé donne encore de meilleurs résultats ; pour le préparer on dissout la peptone neutre à froid dans la glycérine dans la proportion de 20 p. 100, et la solution stérilisée à l'autoclave est mélangée au sérum comme nous venons de le dire. Pour solidifier le sérum glycériné, il faut une température plus élevée que pour le sérum pur, ~'6° à 78° environ, suivant la proportion de glycérine. Le milieu ainsi préparé est d'ailleurs très beau, aussi transparent que la gélatine de sérum ordinaire » (Nocard et Roux).
2. Gélose glycérinée. — « Il suffit d'ajouter C à8 p. 100 de glycérine à la gélose nutritive préparée delà façon ordinaire, pour en faire un bon tci'rain pour le doveloppenent du microbe de la tuberculose. »
3. Bouillon peptonis)' glycériné. — On ajoute au bouillon peptonisé ï> p. 100 de glycérine stérile.
MALADIES MICROBIENNES
4. On obtiendra les meilleurs résultats en additionnant le sérum, la gélose, le bouillon de :
1 p. 100 de peptone.
6 p. 100 de glycérine.
2 p. 100 de glycose.
C'est là le meilleur terrain, celui sur lequel le bacille de Koch pousse le plus abondamment (Nocard et Roux). Les Allemands emploient la dextrine de préférence à la glycose; tout en étant d'ailleurs très favorables à la culture, les milieux dextrinés ne présentent aucun avantage sur les milieux glycosés.
D'une façon générale, la première mise en train d'une culture du bacille de Koch est difficile, et demande un temps variable, toujours assez long; mais les passages successifs, les séries de cultures soit sur le milieu premier, soit sur un quelconque des autres milieux appropriés, deviennent aisés, et se font plus vite et plus abondamment : il semble qu'il y ait une sorte d'acclimatement du bacille à la culture artificielle ; quand le bacille s'est une première fois accommodé d'un milieu artificiel, il devient aisément cultivable sur tous les milieux propices.
Culture du bacille de Koch sur le sérum gylcérinépeptonisé-glycosé. — Ce milieu est excellent pour la mise en train de la première culture; il est inférieur à la gélose et au bouillon pour les cultures successives. — Au bout de quelques jours, à la température de l'ëtuve, la culture est « épaisse, saillante, mamelonnée, d'un blanc mat, et jaunit un peu avec le temps; elle n'a rien d'analogue à la couche sèche, maigre, écailleuse, qui caractérise la culture sur sérum ordinaire. Si quelques bacilles tombent dans le liquide rassemble au fond du tube, ils s'y développent en petits flocons qui augmentent bientôt de volume (Nocard et Roux).
Les tubes de sérum ensemencés avec le bacille de
TUBERCULOSE
Koch et placés a l'étuve doivent être coifles d'un capuchon de caoutchouc.
Culture du bacille de Koch sur la gélose glycérinéej^ejitonisde-glycost'e. — La culture sur gélose glycérinoe peut se faire enpiqnre, en strie et enfin enplaque.
a Lorsqu'on sème par piqûre un tube de gélose glycérinée, comme on le fait pour un tube de gélose, la culture se fait le long de la piqûre, seulement dans les parties les plus superficielles, et il ny a pas de développement dans la profondeur ; à la surface la culture s'étale sous forme d'une plaque saillante, épaisse, blanche d'abord, puis j-aunàtre, ensuite d'aspect mamelonné, à bords irrégulièrement dentelés » (N. et R.).
La culture en strie sur la gélose glycérinée est infiniment plus favorable que la culture en piqûre. Inférieure peut-être au sérum pour la mise en train d'une première culture, «■ la gélose glycérinée convient surtout pour les séries de cultures successives, qui se font ainsi avec une régularité parfaite et dans un temps relativement court; en quinze jours le développement est plus abondant que sur le sérum après plusieurs semaines. Si la semence a été étalée en couche régulière à la surface de la gélose glycérinée, le développement se fait en une nappe blanchâtre, d'égale épaisseur, qui devient un peu jaunâtre à la longue. Lorsque la semence est irrégulièrement répartie, la couche présente des traînées plus épaisses aux points où la semence était plus abondante; si peu de bacilles ont été semés, ils se développent isolément en donnant de petits amas tuberculeux... L'aspect des cultures est gras et humide, demi-transparent » (N. et R.).
Les tubes de gélose glycérinée ensemencés doivent être placés à l'étuve munis d'un capuchon de caoutchouc.
« Les avantages do la gélose glycérinée sont
màladies microbiennes.
faciles à comprendre. Elle est facile à préparer; elle peut être stérilisée à 115° en une seule 'fois, dans l'autoclave ; en quelques heures on peut en faire une provision aussi grande qu'on veut. Son aspect est non seulement plus plaisant à l'œil, mais sa transparence permet la photographie des cultures qui se détachent nettement sur son fond légèrement ambré. De plus elle rend possible l'emploi des cultures sur plaques » (N. et R.).
Cette culture sur plaques se fait, suivant la méthode de Roux, « dans des tubes de verre longs de 25 à 30 centimètres et larges de 2 à 3 centimètres (V. chapitre iv). Une petite quantité de gélose glycérinée est introduite au fond des tubes que l'on ferme avec un tampon de coton et que l'on stérilise à l'autoclave à 115°. Pour les utiliser il suffit de faire fondre la gélose et de l'ensemencer alors qu'elle est encore liquide. On agite vivement, et on couche le tube sur un plan horizontal; la gelée nutritive s'étale et se moule sur la paroi inférieure du tube. Elle est ainsi répartie sur une grande surface, et si l'ensemencement a été convenablement fait, les colonies qui se développeront seront parfaitement isolées. La couche solide doit être mince pour que l'on puisse facilement examiner les colonies au microscope à travers le verre. Le tube est fermé avec un capuchon de caoutchouc, et il peut rester à l'étuve aussi longtemps que l'on veut sans qu'il se dessèche.
« En deux ou trois semaines on obtient ainsi dans l'intérieur du milieu -de belles colonies isolées du bacille de la tuberculose en partant de cultures pures, de façon à étudier leur aspect. Elles se présentent tout d'abord avec une forme ari'ondie ; elles sont transparentes au centre, et à contour net; à mesure qu'elles grandissent, elles devienncntbrunes et compactes. »
TUBERCULOSE
Culture du bacille de Koch dans le bojulhm peptoniié-ylycériiié-glycosé. — C'est un excclleni, milieu où « le bacille de la tuberculose venant d'une culture sur terrain solide se développe abondamment dans l'espace de huit à dix jours. Il apparaît d'abord sous forme de petits flocons très ténus ([ui se rassemblent sur le Tond du flacon à cultnrc. Ces flocons se désaj^règent facilement si on les agite. Ils s'accroissent rapidement et, si on les laisse en repos, au bout de quinze jours à trois semaines, le fond du vase est couvert de flocons volumineux, rappelant un peu ceux de la bactéridie cfiarbonneuse, mais plus consistants et plus difficiles à désagréger.
« Si le bouillon glycériné est ensemencé avec de la matière tuberculeuse prise sur un animal, la croissance des bacilles est plus lente que si la semence avait été prélevée sur une cultui'e dans un milieu glycériné. Dans ces conditions, il faut un mois pour avoir un développement sérieux. Cependant, en ajoutant au bouillon glycériné un peu de l'albumine de l'œuf, nous avons eu une culture manifeste, en partant de la tuberculose du lapin, au bout de cinq jours; le huitième jour, elle était tout à fait abondante.
« Les cultures successives dans les milieux liquides se font facilement et en conservant leurs caractères. Le développement, très appréciable le huitième ou le dixième jour, est considéi'aBle au bout de deux ou trois semaines. »
E.namm des cultures du bur.Ule de Koch. — L'examen se fera sur lamelles par la technique indiquée ci-dessus.
« Les bacilles provenant de cultures sur S('rum ou ijiHosc glycérines gardent i)arfait(!Uient la couleur. Ils ont le même as])('ct que ceux ([ui ci'oissent sur le sérum pur, mais ils sont un |>eu plus l'i'.. riK Mir.nf)niK. VS
MALADIES MICROBIENNES
gros. Ils sont plus courts que ceux que l'on trouve dans les crachats et dans les produits tuberculeux pris sur l'homme et sur les animaux. Dans les premiers jours de la culture, ils sont homogènes et se colorent dans toutes leurs parties. A mesure que la culture vieillit, les bacilles les plus anciens prennent moins fortement la couleur. IDans une culture vieille de plusieurs mois, nous avons rencontré des formes plus longues qu'à l'ordinaire; quelques-unes d'entre elles présentaientcommeunbourgeonlatéralbranché presque à angle droit sur le bacille principal, et terminé quelquefois par un renflement à son extrémité » (N. et R.).
L'examen des cultures dans le bouillon peptoniséglyccriné-glycosé donne les résultats suivants : <( Les flocons paraissent formés par des bacilles enchevêtrés, bien colorés, et un peu plus petits que ceux qui croissent sur les terrains solides. Plus tard, ils semblent grossir un peu; en vieillissant ils se colorent d'une façon moins intense, et l'on aperçoit dans leur intérieur des grains plus foncés, soit au nombre de deux, un à chaque extrémité, soit au nombre de trois, deux aux extrémités, un au milieu du bacille. Un bacille n'a quelquefois qu'un grain, soit au bout, soit avant son milieu ; parfois aussi on en voit plusieurs répartis dans toute sa longueur. Ces grains qui ont tout à fait l'aspect de spores deviennent plus nombreux et plus nets avec l'âge des cultures » (N. et R.).
Culture du bacille de Koch sur la pomme de terre. — On doit au docteur Pawlowsky, de Saint-Pétersbourg, la connaissance d'un procédé de culture du bacille de Koch sur la pomme de terre (Voir .4??nales Pasteur, 1888).
On prépare des tubes à pomme de terre de
TUBERCULOSE
Houx (V. cluipitre iv) et « les surfaces des Irauclies ainsi préparées sont ensemencées soit avec des cultures pures de bacilles de la tuberculose, soit avec des tissus tuberculeux (1). On l'ait pénétrer la semence dans la substance de la pomme de terre par des frictions avec une spatule de platine ». Les tissus luberculeux seront soigneusement broyés, triturés comme nous l'avons indiqué ailleurs et ensemencés par friction avec la spatule de platine.
Les tubes ensemencés seront fermés à lu kmpe à leur partie supérieure, et placés d9,ns l'étuve à 4- 39°.
La culture commence à être apparente dès le douzième jour; au vinf,'tième, elle est caractéristique. « La surface ensemencée est sèche, blanchâtre, lisse, moins consistante et se laisse facilement enlever par le raclage avec la spatule. Par sa couleur blanchâtre et sa sécheresse, elle se distingue nettement des parties non ensemencées de la pomme de terre, qui sont jaunes, plus fermes, i.'renues et humides. La multiplication des bacilles se l'ait dans les couches superficielles. La culture ne s'élève que^ peu au-dessus de la surlace de la pomme de terre.
« Après un mois, les cultures sont très abon dantes ; elles sont très manifestes même dans les tubes ensemencés avec des aiguilles de platine. Au bout de cinq à six semaines, elles se présentent comme un enduit blanchâtre qui, dans quelques tubes, prend l'aspect de granules blancgrisàlre, de la dimension d'une tète d'épingleu Ces granules s'observent surtout au tiers inférieur de la pomme de terre. »
(I) L'auteur n'a [ju cuUiver sur la pomme do tniTc ([ue la moelle dos os d'un lapin iiioculii avec, une culture sur gclose glycériiiùe. Les ((uciques ess.tis tentés avec dos tuberculoses d'aulres [irovenances n'out [jas réussi.
MALADIES MICROBIENNES
Les cultures sur pommes de terre peuvent se faire en séries d'une pomme de terre sur l'autre : le développement a lieu en deux ou trois semaines.
