RÉCOLTE, FABRICATION, STÉRILISATION RÉPARTITION, CONSERVATION

Toute la science bactériologique repose sur l’emploi des cultures microbiennes. Constater indéfiniment la présence de microorganismes dans l’air, l’eau, les liquides organiques, etc., n’aurait pas entraîné de grandes découvertes. Le microbe est un organisme végétal; qui végète et pullule dans un milieu nutritif approprié l, si celui-ci est ensemencé , c’est-à-dire reçoit un échantillon du microbe à cultiver. Les termes de terrain , semence, culture, végétation sont donc parfaitement justes. Si la

1 Le'microbe a besoin, comme toute cellule vivante, dé aliments pour végéter. Il lui faut du carbone, de X oxygène et de Yhydrogène , pour fabriquer les produits ternaires qui composent une grande partie de la masse cellulaire : cellulose, sucres ; il lui faut de l’eau. Le corps microbien contient des matières albuminoides ; il a donc besoin d 'azote, et aussi de soufre et de phosphore. C’est ce besoin d’azote qui nécessite la présence de matières albuminoides dans les milieux de culture et rend par là leur composition si complexe. L’azote des sels ammoniacaux, tels que le lactate ou le tartrate d’ammoniaque, est difficilement assimilable par les microbes ; il en est de même de l’azote de l’urée ou des nitrates qui exigent la présence de matières albuminoïdes. Trouver un aliment simple capable de fournir l’azote aux microbes est le problème actuel (voyez p. 76).

Le carbone sera emprunté aux aliments ternaires, c’est-à-dire à des substances organiques précédemment élaborées, car le microbe, privé de chlorophylle, ne peut l’emprunter à l’air. Peut-être les microbes qui sécrètent des pigments peuvent-ils assimiler directement le carbone de l’acide carbonique de l’air, sous l’influence de la lumière.

Enfin, le microbe a besoin d'éléments minéraux qu’on retrouve dans ses cendres : soufre, phosphore, potassium, calcium, fer, etc.

MILIEUX DE CULTURE

culture est pure, ne contient qu’une seule espèce microbienne, qui a donc été isolée , l’étude des propriétés pathogènes du microbe devient possible. Seulement alors, on peut rechercher quelle a été l’influence du microbe sur le terrain où il a végété ( modification des substances nutritives, fabrication des toxines , des ferments solubles, etc.), et aussi l'influence du milieu sur les propriétés du microbe. Il n’y a pas d’expérimentation possible, avec les microbes, sans cultures pures.

A. C’est Pasteur qui a fondé la bactériologie en créant la méthode des cultures dans ses belles recherches sur la fermentation lactique (1857) et les organismes en suspension dans l’atmosphère (1861). Les premiers milieux employés par Pasteur et ses élèves étaient liquides : solutions minérales, infusions végétales, infusions animales (bouillons), liquides organiques naturels (urine, humeur aqueuse, etc.). Les cultures en milieux liquides forment encore la base de l’expérimentation microbiologique, surtout depuis la part importante réservée à l’étude des produits solubles sécrétés par les microbes.

B. En 1881, Koch introduisit en bactériologie la méthode des cultures sur milieux solides, méthode précieuse qui a ses indications spéciales à côté de la méthode pasteurienne. Les travaux de Koch eurent pour point de départ les observations antérieures d’HoFFMANN (1869) et de Schrœter (1872). Lorsqu’on laisse exposée à l’air la surface d’une pomme de terre cuite, cette surface se recouvre de taches dues au développement de moisissures ou de microbes. Chaque tache est formée par la réunion d’éléments d’une espèce unique ; les microbes, tombés de l’atmosphère, ont pullulé snr place, ayant trouvé un milieu nutritif favorable. On comprend de suite l'énorme avantage de pareilles cultures pour l’isolement des espèces bactériennes et l’examen macroscopique des colonies. Le mot « colonie » a été conservé, et désigne un amas microbien isolé, ayant végété sur un milieu solide. Koch songea de suite à solidifier les milieux nutritifs liquides les plus utilisés ; il gélatinisa le bouillon. C’était créer un milieu solide très nutritif, de compo-

GENERALITES

sition variable à volonté, très transparent, permettant l’étude des colonies. La gélatine fondant à -f- 22° environ, Koch solidifia aussi le bouillon avec une autre subtance gélifiante, Vagar-agar, qui résiste aux températures plus élevées (37 degrés) utilisées pour obtenir le développement des microbes ; il gélifia aussi le sérum sanguin. On voit de quelle importance fut l’œuvre de Koch, puisque la gélatine, la gélose (agar-agar), le sérum, la pomme de terre sont des milieux couramment employés dans tous les laboratoires, à côté des bouillons Pasteur.

C. Parmi les milieux nutritifs liquides ou solides, les uns sont naturels (sérum, urine, humeur aqueuse, pomme de terre, œufs, etc.), les autres sont artificiels (bouillon, gélatine, gélose, etc.). La fabrication des milieux artificiels a une importance capitale. Les meilleurs milieux sont constitués par des bouillons, c’est-à-dire par des infusions animales, mais ils ont le grave défaut d’avoir une composition très complexe et très variable. On comprend dès lors la difficulté qu’on éprouve à faire des cultures toujours identiques à elles- mêmes, à savoir quelles modifications a subi le milieu de culture, quels sont les produits solubles rejetés par celui-ci dans le liquide. Or, ces problèmes sont ceux qui se placent au premier rang dans les préoccupations du bactériologiste.

L’idéal, auquel on doit tendre aujourd’hui, est la possession d’un milieu de culture suffisamment nutritif et de composition simple et définie , d'un milieu fournissant V azote aux microbes sans contenir de substances albuminoïdes. Le jour de sa découverte verra faire un grand pas à l'étude des substances solubles, et par conséquent à la vaccination, à l’immunisation, etc., pour le plus grand profit de la thérapeutique des maladies infectieuses.

Jusqu’à présent les solutions minérales employées sont trop peu nutritives, leur azote est mal assimilé; la végétation se fait mal ou ne se fait pas.

Fermi (1891), Guinochet (1892), Arnaud et Charrin (1892), Ouchinsky (1893), Duflocq (1900), Lepierre (1901), etc., ont essayé de cultiver des microbes pathogènes dans des liquides

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ne contenant pas de substances albuminoïdes. Nous parlerons de leurs recherches au chapitre xn consacré aux Produits solubles microbiens.

D Bien entendu, les milieux doivent être préalablement stérilisés et conservés dans des vases stérilisés et clos.

§ 1. — Milieux liquides

Les milieux liquides employés en bactériologie peuvent être naturels ou artificiels.

A) — Liquides naturels

Un liquide existant dans la nature est employé sans modifications notables.

1° Sérum sanguin. — Le sang de l’animal sain est habituellement privé de microbes. Il suffira donc de le recueillir aseptiquement pour posséder, après rétraction du caillot, un sérum n’ayant pas besoin d’être stérilisé. Tout sérum qu’on sera obligé de stériliser sera presque toujours employé à l’état solide, bien que la stérilisation, à -f- 58°, soit possible par la méthode de Tyndall (voir p. 45).

Pour recueillir le sérum d’un petit animal (lapin, chien), on dénude la carotide (avec toute l’asepsie désirable) ; on la lie aussi près que possible de la tête, et on la pince à la base du cou. On coupe en sifflet, avec de fins ciseaux flambés, le segment isolé, aussi près que possible de la ligature, et on introduit par cette ouverture une petite canule en verre ou un petit trocart stérilisé. On enlève la pince et le sang est recueilli dans un flacon stérilisé. Ce flacon est maintenu incliné (fig. 42) pendant toute la durée de la coagulation. On redresse ensuite le flacon et le sérum s’accumule à côté du caillot; on peut le puiser facilement au bout de quelques heures avec une pipette à boule sans blesser le caillot (fig. 43). Le sérum est immédiatement réparti dans des ballons ou tubes stérilisés.

MILIEUX LIQUIDES NATURELS 69

L'appareil de Latapie (fig. 44) est destiné à puiser aseptiquernent le sang artériel des petits animaux. Le tube trocart (AJ, très effilé, entre dans , le réservoir pipette (B) muni d'une effilure coudée deux fois (C) et d’une tubulure (D). Une bague de caoutchouc (E) les fixe. A l’intérieur est un tube de verre (F)

percé de trous qui fixera le caillot. L’appareil est stérilisé à l’autoclave. On casse I’effilure de (A) et on plonge dans la carotide . On referme l’effilure. On laisse reposer le tube (A) en bas. Le caillot formé, on retourne l’appareil, le sérum tombe en (B) ; on brise

Fig. 42.

Flacon d'Erlenmeyer contenant du sang maintenu incliné, pendant la coagulation, à l’aide d’un simple billot.

Fig. 43.

Le flacon (A) de la figure 42, redressé après la formation du caillot -(G) pour le puisage du sérum (D) à l’aide d’une pipette à boule (B).

l’effilure (G) et on le recueille. On obtient ainsi 80 p. 100 du sang en sérum. Voir l’appareil pour les grands animaux.

Le dispositif des frères Lumière est plus simple (fig. 45), Il se compose d’un seul tube de verre (D B G A E) ; le cylindre (A) est hérissé de pointes à son intérieur. On bouche les deux extré-

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mités avec de la ouate et on fait stériliser au four Pasteur. Pour s’en servir, on adapte à (E) un court tube de caoutchouc muni d’une aiguille en platine irridié et stérilisé à l’autoclave.

Fig. 44.

Appareil de Latapie, pour saigner aseptiquement les petits animaux.

Fig. 45.

Appareil des frères Lumière pour recueillir aseptiquement le sang des petits animaux.

On introduit l’aiguille dans la veine ou l’artère et on aspire par (D) jusqu’à ce que le sang remplisse (A). On pince alors le caoutchouc, on retire l’aiguille, on incline le tube, on enlève le tube de caoutchouc, en maintenant l’extrémité (E) dans la flamme d’une lampe à alcool, on met un tampon d’ouate.

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Quand le caillot est formé, on retourne l'appareil : le caillot est retenu par les pointes de (A); le sérum s’écoule par (D).

Pour avoir du sérum aseptique des grands animaux (cheval, âne, bœuf), on suivra la méthode que nous décrirons avec grands détails à propos de la Sérothérapie (p. 351).

Le sérum liquide est employé pour conserver intacte la virulence de certains microbes ( Steptocoqae pyogène , JB. de la morve, etc.) ; il sert à toutes les expériences où on veut rechercher ses effets bactéricides, agglutinants, etc.

Le sérum seul ne convient pas en général comme milieu de culture ; par contre l’addition de sérum aux milieux liquides ou solides permet ou favorise le développement de la plupart des microbes. L’emploi du bouillon-sérum (5,10, 20 p. 100) a permis d’obtenir in vitro la culture du microbe de la péripneumonie); on incorpore le sérum aux milieux solides (gélosesérum).

2° Sang. — Les milieux à base de sang ont pris une grande importance en bactériologie.

Il faut remédier à la coagulation, pour avoir un milieu liquide.

La défibrination (agiter pendant dix minutes dans un flacon résistant stérilisé, contenant des perles de verre) du sang recueilli aseptiquement est le procédé de choix.

On peut utiliser aussi les propriétés anticoagulantes de certaines substances (peptone, têtes de sangsues, certains sels). La peptone ne convient que pour le chien, la coagulation n’est pas empêchée chez le lapin ; même pour le chien les résultats sont incertains.

Pour utiliser les têtes de sangsues, on les durcit pendant quelques jours dans l’alcool fort, on les dessèche et on les broyé. On fait bouillir dans l’eau (une tête pour 5 à 10 centimètres cubes d’eau), on filtre et on stérilise à -f- 105° pendant cinq minutes. On répartit dans les tubes destinés à recevoir le sang. Le sang se coagule à la longue.

Le citrate neutre de soude à 3 p. 1000 rend le sang incoagulable.

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En somme ; c’est à la défibrination qu’il faut s’adresser.

Le sang, comme le sérum, est ajouté ou incorporé à un substratum liquide ou solide pour augmenter les propriétés nutritives de ce dernier. C’est sur une gélose sanglante que Pfeiffer et Beck ont, en 1892, cultivé le Bacille de linfluenza. Elle a aussi servi à cultiver le Gonocoque, le Bacille de Koch (Bezançon et Griffon, etc.).

3° Lait. — 11 convient à la culture de nombreux microorganismes. Il sert, en outre, à différencier certaines espèces, suivant que celles-ci le coagulent ou le laissent liquide.

On peut le recueillir aseptiquement au pis de la vache (nettoyé et lavé au sublimé) et le distribuer en ballons stérilisés. Un grand nombre de ceux-ci placés à l’étuve, resteront stériles. On s'en assurera en ensemençant une goutte de chacun en bouillon.

En général, on stérilise à l’autoclave à + 110° ou -f 115° pendant un quart d'heure. Le lait est alors privé de ses parties grasses qui restent à la surface.

La méthode de Tyndall (une heure à -f- 65° ou-f- 70° pendant six jours de suite) est applicable.

Pour savoir si les microbes coagulent le lait par formation d'acide ou par sécrétion de présure, on peut additionner le lait de teinture bleue de tournesol stérilisée. Le lait acide virera au rouge.

Nombre de microbes redissolvent (production de présure et decaséase) le caillot formé [B. 'pyocyanique, B. subtilis, etc.).

4U Petit-lait. — Le petit-lait est employé pour la fabrication de certains milieux. On l’obtient, en chauffant à une douce chaleur, du lait additionné d une petite quantité de solution étendue d’acide chlorhydrique. On filtre, on neutralise, on stérilise. (Voir : Petruschky, p. 84.)

5Ü Urine. —Pasteur s'est beaucoup servi de l'urine pour cultiver certains ferments (1876) et, plus tard, la Bactéridie char-

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bonneuse. Ce milieu est bien abandonné aujourd'hui. On peut recueillir burine aseptiquement, et se contenter de réprouvera l’étuve ; sinon elle sera filtrée, neutralisée et stérilisée comme du bouillon. A -j- 110° l'urine acide devient franchement alcaline. Pour Miquel, l’urine normale est peu putrescible; elle l’est davantage après une neutralisation par la soude.

Les solutions d’urée sont quelquefois employées. 11 faut savoir que, si l’urée sèche supporte bien -f- 105° pendant une heure, une solution durée se décompose vers + 90°.

6° Sérosités normales, humeur aqueuse. — L’humeur aqueuse a été employée par Koch pour cultiver « en cellule » la Bactéridie • charbonneuse et étudier son évolution. On recueille l’humeur aqueuse, sur un animal récemment sacrifié.

On peut imaginer toute une série de liquides naturels (liquide céphalo-rachidien, extraits d'organes, etc.).

7° Sérosités pathologiques. — On utilise de plus en plus des liquides d’hydrocèle, de pleurésie, d’ascite (cultures de nombreux microbes exigeant des milieux albumineux).

Onpeutles recueillir aseptiquement dans un appareil de Potain stérilisé. Comme ces liquides contiennent souvent le microbe pathogène delà maladie, il faut les éprouver avec soin. On pourra les stériliser comme le sérum (méthode de Tyndall).

8» Œuf#'— Les œufs peuvent être employés liquides. 11 faut savoir qu’ils ne sont pas toujours aseptiques.

On secoue violemment un œuf frais pour mélanger le jaune avec le blanc ; on lave la coquille au sublimé, et on flambe le bout où se trouve la chambre à air ; on ponctionne ce point avec l’aiguille d’une seringue qui contient la semence, et on pousse quelques gouttes. L’œuf est alors recouvert d’une couche de collodion et mis à l’étuve. Hueppe a cultivé ainsi le V. cholé-

rique ; Weil le B. de Hansen.

On peut aussi séparer le blanc et le jaune, les distribuer dans des ballons ou les utiliser pour la préparation de milieux dont Besredka et Jüpille ont montré tous les avantages.

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Le jaune , est, le plus souvent, employé d'après la formule :

Jaune d’œuf . . .

'Eau distillée . . .

Soude à 10 p. 100

B) — Liquides artificiels

Ce sont des liquides inventés pour les besoins de la bactériologie.

1° Solutions chimiquement définies. — Elles ne contiennent pas de substances organisées.

A. Liquide Pasteur. — Il date de 1859 ; c’est la première solution minérale employée comme milieu de culture i. En voici la formule :

Eau distillée 1 00 grammes..

Sucre candi 10 —

Gendres de levure de bière 0 gr. 075

Pasteur modifia plus tard cette formule de la façon suivante pour cultiver la levure de bière :

Eau distillée 100 grammes.

Sucre candi 10 —

Tartrate d’ammoniaque 0 gr. 1

Cendres de 1 gramme de levure. . . .

B Liquide de Gohn. — Le liquide de Cohn est ainsi composé :

Eau distillée . 200 grammes.

Tartrate d’ammoniaque 2 —

Phosphate de potasse 2 —

Sulfate de magnésie 1 —

Phosphate tribasique de chaux .... 0 gr. 1

C’est le liquide de Mayer avec addition d'une substance azotée, le tartrate d’ammoniaque.

1 Pasteur: Mémoire sur la fermentation lactique. Annales de physique et chimie, 1859.

100 ce.

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C. Liquide Raulin. — Raulin a fait son remarquable travail 1 sur les conditions de développement de YAspergillus niger avec le liquide suivant :

Eau 1 500 grammes.

Sucre candi 70 —

Acide tartrique 4 —

Nitrate d’ammoniaque 4 —

Phosphate d’ammoniaque 0 gr. 60

Carbonate de potasse 0 gr. 60

Carbonate de magnésie 0 gr. 40

Sulfate d’ammoniaque 0 gr. 2L

Sulfate de zinc 0 gr. 07

Sulfate de fer 0 gr. 07

Silicate de potasse. 0 gr. 07

Avec ce milieu, la récolte d’Aspergillus était tellement abondante qu’elle équivalait à 10.000 kilogrammes à l'hectare pour un végétal ordinaire.

Malheureusement, toutes ces solutions minérales, excellentes pour la végétation des champignons, ne conviennent que très mal à celle des bactéries.

D. Liquide Arnaud et Charrin. — Le liquide d’ARNAUD et Charrin (1892), permettant la végétation du B. pyocyanique, est le suivant :

P04K H2 0 gr. 100

P04Na2H + 12 Aq 0 gr. 100

C03KH 0 gr. 134

CaCl2 0 gr. 050

Mg SO4 + 7 Aq 0 gr. 050

Asparagine cristallisée 5 grammes.

Eau : Q. S. pour faire 1 litre.

Il a permis d’étudier le sort de l'azote, du carbone et de l'oxygène, pendant la végétation du microbe. L’azote est fourni par l’asparagine.

1 Raulin, Etudes chimiques sur la végétation. Recherches sur le

développement d'une mucédinée dans un milieu artificiel. Ann. des

Sciences naturelles, 1870.

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E. Liquide Ouchinsky (1893). — 11 est une modification du liquide de Noegeli.

Eau 1 000 gr.

Glycérine 50,0

Chlorure de sodium 7,0

Lactate d’ammoniaque 10,0

Chlorure de calcium • 0,1

Sulfate de magnésie 0,2

Bi-phosphate de potasse 1,0

L’azote est fourni par le lactate d’ammoniaque. Ouchinsky ajoute quelquefois 0,5 p. 100 d’urée ; 0,02 à 0,03 p. 100 d’acide urique ; 0,8 à 1,5 pour 100 de sucre. On ne s’inquiète pas du précipité formé pendant la neutralisation. La plupart des microbes, sauf le B. d'Eberth et le Bacille tuberculeux, pousseraient dans ce milieu. Hugounenq et Doyon n’ont pas réussi à y cultiver le B. de Lof fier et le B. du Choléra, qui avaient si bien végété entre les mains d’OucHiNSKY.

Lepierre a échoué, sauf pour le B. pyocyanique.

F. Liquides Lepierre. — L’auteur a voulu composer un milieu azoté, chimiquement défini, suffisamment nutritif pour la plupart des microbes. Lepierre a utilisé les produits de dédoublement (simple hydratation) des albuminoïdes par les alcalis à 100°, nommés glucoprotéines a, produits cristallisables et de composition: chimique définie. Ces substances sont nutritives tout en n’étant plus protéiques.

Voici une formule pour les espèces peu exigeantes (B. typhique, B. coli, V. cholérique, Staphylocoque pyogène, etc. ) :

Glucoprotéine pure (CB à G11) ... I gr. 5 à 3 gr. 2

Î Chlorure de sodium. . 0 gr. 50

Sulfate de magnésium. 0 gr. 05 Glycérophosphate de

calcium 0 gr. 20 à 0 gr. 30

Bicarbonate de potassium 0 gr. 10 à 0 gr. 20

Eau 100 grammes.

Pour les espèces plus exigeantes [B. anthracis, Streptocoque,

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B. de Nicolaïer , etc.), il est préférable d’employer la formule :

Glucoprotéine pure 2 grammes.

Hydrate de carbone soluble ou alcool polyatomique 2 gr. à 3 gr.

Constante minérale de la formule précédente.

Eau 100 grammes.

Le B. de la tuberculose humaine exige les glucoprotéines en G10 etc11.

Suivant l’auteur, 45 microbes (dont 22 pathogènes) étudiés ont poussé dans ces milieux, aussi bien et aussi virulents que dans les bouillons ordinaires.

G. Frouin (1910) a recommandé pour la culture du bacille tuberculeux la glucosamine et la sarcosine associées dans le milieu suivant :

Eau 1000

NaCl 6