KC

Phosphate bisodique ... 0,5

Sulfate de magnésie. ... 0,3

On a préconisé#encore pour remplacer les matières protéiques mal définies comme l’asparagine, le glycolle, la succinate d’ammoniaque, la succinamide, etc.

H. Eau de mer. — Duflocq, Lejeune et Bertrand (1900) ont utilisé l'eau de mer comme milieu de culture. Ils additionnent d’eau distillée (pour arriver à 9 grammes de sel par litre), de lactate d’ammonium, d’azotate d’ammoniaque et de quelques phosphates. Ils alcalinisent, stérilisent et filtrent. C’est un milieu dépourvu de matières albuminoïdes, et cependant les microbes poussent bien et sécrètent des produits albuminoïdes. L’intérêt de ce milieu résiderait précisément dans ce dernier fait.

2° Infusions végétales. — On a préconisé des décoctions de plantes. U eau de foin a joui d’une grande faveur. Les qualités nutritives de ces infusions sont en général faibles. Elles

umorure ae calcium ... u,iï>

Glycérine 40

Glucosamine 2

Sarcosine 2

MILIEUX DE CULTURE

sont excellentes pour cultiver les champignons; très inférieures pour cultiver des microbes. La préparation se compose des temps suivants : macération, neutralisation, filtration, stérilisation.

L'eau de pomme de terre est préparée en incorporant, à un demi-litre d’eau, 10 à 20 grammes de pulpe de pomme de terre obtenue à l'aide d’une râpe de nickel. Macération pendant deux heures ; ébullition ; filtration ; stérilisation. Ce milieu est légèrement acide.

Lubinsky cultive le Bacille de Koch dans de l’eau de pomme de terre additionnée de 4 p. 100 de glycérine.

L’eau de levure se prépare ainsi. On délaie lentement 100 grammes de levure dans 1000 grammes d’eau. Faire bouillir. Neutraliser oualcaliniser légèrement avec une solution de soude. Filtrer. Stériliser à l’autoclave à -f- 115° pendant un quart d’heure.

Le jus de carottes (auquel on peut incorporer de l’agar) constitue un excellent milieu pour la plupart des bactéries, des champignons (Rochaix).

Veau de malt est une solution de 10 p. 100 de malt (orge germée) dans de l’eau. Chauffer à -f- 55°-58° pendant une heure, sans dépasser cette température, sous peine de détruire la diastase. Porter ensuite à l’ébullition, filtrer, stériliser I + 115°, etc.

G. Roux (1889) a préconisé Veau de touraillons comme un liquide souvent supérieur aux meilleurs bouillons, pour la culture des microbes et particulièrement de certains streptocoques. Le touraillon est le résidu desséché du malt qui a servi aux brasseurs. L’infusion est à 10 p. 100 comme l’eau de malt. Les milieux au touraillon ne permettent pas le développement du Vibrion cholérique; ils sont antiseptiques vis-à-vis de ce microbe (G. Roux).

Pour la décoction de fruits (prunes, etc.), on laisse macérer pendant un jour dans de l’eau, on fait cuire dans cette eau sans écraser. On filtre, on neutralise, on stérilise.

On a aussi employé des décoctions de crottin de cheval ou de tout autre herbivore. On met macérer une partie de crottin frais dans trois parties d’eau pendant vingt-quatre heures; on fait bouillir, on filtre, etc.

BOUILLONS

Le vin neutralisé et stérilisé avait été employé par Pasteur pour cultiver en grand le Bacillus anthracis.

3° Infusions animales (bouillons). — Le bouillon est

le milieu universellement employé pour cultiver la grande majorité des bactéries. C’est le liquide nutritif courant dans les laboratoires. •

A. Bouillons de viande. — Ce sont les liquides de choix. Pasteur s’était d’abord servi de bouillon de poulet. La viande de bœuf ou de veau est préférable. Le bouillon simple est peu usité : on y ajoute en général différentes substances, destinées à augmenter sa puissance nutritive, spécialement de la peptone l.

On prend 500 grammes de viande choisie, débarrassée des os, de la graisse, des tendons, etc., et hachée finement. On les place dans un récipient contenant 1 000 grammes d’eau distillée 2. On mélange soigneusement. On peut alors laisser macérer à froid pendant vingt-quatre heures, ou à chaud pendant une demi-heure (à + 50° environ, c’est-à-dire à une température qui ne coagule pas l’albumine) ; la macération à froid est préférable. On exprime sur un linge mouillé, et on ramène la quantité à 1000 grammes. On ajoute 5 à 7 grammes de chlorure de sodium (la viande est pauvre en chlorure de sodium), 20 grammes de peptone et quelquefois 1 gramme de phosphate de soude. On fait bouillir. On écume, on dégraisse, on filtre sur papier épais et on neutralise. Le bouillon est normalement acide ; il rougit le papier de tournesol bleu ; or, la grande majorité des microbes réclament un milieu neutre ou légèrement alcalin. On verse goutte à goutte dans un bouillon une solution alcaline (carbonate de soude ou soude), jusqu’à ce

1 Ctt. Nicolle pense qu’it y aurait tout intérêt à supprimer la peptone des milieux de culture communs, surtout pour les cultures destinées aux inoculations.

2 II va sans dire qu’on peut modifier la proportion de viande et d’eau pour avoir, s’il en est besoin, des bouillons moins riches. Chauveau a cultivé son vaccin charbonneux dans du bouillon de veau très pauvre à 1/5 au lieu de 1/2.

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que le papier de tournesol donne une réaction neutre ou légèrement alcaline. On filtre de nouveau si c’est nécessaire.

Il faut alors. mettre le bouillon dans le récipient où il sera stérilisé et conservé. Nous employons des flacons à deux tubulures d’une contenance d’un litre (fig. 46) : les deux tubulures sont bouchées par un tampon d’ouate. A travers le tampon de la tubulure latérale (A) passe un tube de verre (B) qui plonge jusqu'au fond du flacon et est recourbé en U renversé au dehors du flacon. La branche externe de l’U est reliée par un petit tube de caoutchouc (C), long de 5 centimètres, à un tube de verre (D) dont l’extrémité inférieure est effilée et fermée à la lampe comme une pipette. Le flacon est rempli de bouillon aux deux tiers et stérilisé à l’autoclave par une exposition de vingt à trente minutes à + 110° à 120°.

Pendant le chauffage, les tubes B, C, D se sont purgés d’air et remplis de vapeur d’eau qui se condense au refroidissement; le bouillon les envahit alors, le siphon s 'amorce donc de lui-même et le flacon a l'aspect représenté dans la figure 46.

Il se produit en général un dépôt assez abondant (surtout si le chauffage a été trop intense ou trop prolongé), qui se condense rapidement au fond du récipient, et ne trouble que les dernières gouttes lors de la décantation.

Pour s’assurer que la stérilisation a été parfaite, on place pendant vingt-quatre heures le flacon chargé de bouillon dans une étuve à + 38°; il doit rester limpide. Un flacon de bouillon . ainsi préparé, peut être indéfiniment conservé dans une armoire à l’abri de la poussière ; le liquide perd cependant à la longue ses propriétés nutritives. On peut lui faire récupérer, en partie tout au moins, par le chauffage.

Lorsqu’on veut transvaser le bouillon du flacon dans des ballons, on opère de la façon suivante (fig. 47). On place une pince de Mohr (E) sur le tube en caoutchouc (C) ; on flambe l’extrémité

Flacon pour la conserve et la distribution du Bouillon (système du siphon).

BOUILLONS

effilée du tube de verre (D) et on la casse avec des pinces flambées ; on reflambe l’extrémité ouverte et on l’introduit dans le goulot d’un ballon stérilisé. Le ballon doit être penché presque horizontalement et le capuchon de papier tenu verticalement l’ouverture en bas, afin d’éviter la chute des germes de l’atmosphère dans le ballon ou dans son capuchon. Ces ballons ont été décrits page 22 et figure 10. Une seule main suffit àtenir le ballon et soncapu-

Fig. 47.

Distribution du bouillon en petits ballons à l'aide du flacon-conserve représenté figure 46 (système du siphon).

chon, ce dernier par les deux derniers doigts (fîg. 47). On presse alors de l’autre main sur la pince, et le liquide coule par siphonnement dans le ballon. On lâche la pince lorsque le tiers inférieur du ballon est chargé de bouillon, on retire le ballon dans une position aussi horizontale que possible, ou. flambe le goulot, et on remet le capuchon avec la main devenue libre. On remplit ainsi un grand nombre de ballons, et on les éprouve pendant vingt-quatre heures à l’étuve à -f- 38° ; ceux qui sont restés clairs sont prêts à être ensemencés.

La manœuvre sera identique pour le transvasement du bouillon dans des récipients quelconques. Si les ballons sont bouchés à la ouate, on tiendra le tampon en l’air avec une pince et on le flambera avant de reboucher. Lorsque le flacon ne contient plus que

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quelques eentimètres de liquide, on le penche latéralement, dans un tiroir par exemple, pour que le siphon ne se désamorce pas. On s’arrêtera dès que le dépôt du fond troublera le bouillon.

On peut employer aussi un autre dispositif dans lequel le bouillon est chassé dans le siphon par refoulement. Le flacon à deux tubulures est alors bouché avec deux bouchons en liège laissant passer deux tubes de verre. Celui du milieu ne dépasse pas la surface inférieure du bouchon ; il est coudé à angle très obtus au sortir du flacon, et bouché à la ouate. Celui de la tubulure latérale est en U renversé dont l’une des branches de calibre uniforme plonge jusqu’au fond du flacon, et dont la branche extérieure est effilée en pipette et est presque de même longueur. Après stérilisation à l'autoclave, les deux bouchons sont vernis à l’extérieur avec de la gutta- percha dissoute dans le chloroforme, ou mieux sont enduits de paraffine qu’on verse chaude avec une plume ou un petit pinceau.

Lorsqu’on veut transvaser le bouillon, on adapte au tube un petit tube de caoutchouc qui permet de souffler dans le' flacon ; l’air sera filtré à mesure dans le tampon de ouate. On flambe , on casse, on reflambe la pointe effilée et on opère comme précédemment. On suspend l’écoulement du bouillon en serrant le tube de caoutchouc entre les dents, ou en appliquant la langue contre son orifice.

Cette disposition ne vaut pas la précédente ; on s’expose à perdre du bouillon ou à laisser rentrer de 1 air entre chaque remplissage de ballon. Elle a le seul avantage de rendre libres les deux mains de l’expérimentateur, et de permettre un écoulement plus rapide lorsqu’on veut transvaser le bouillon dans de grands récipients.

Dans la plupart des laboratoires on stérilise le bouillon dans un grand ballon bouché à la ouate. Pour transvaser on y plonge une pipette Chamberland (fig. 14, p. 24) stérilisée, et on aspire. On écoule ensuite dans les petits ballons le bouillon de la pipette Chamberland, en l'inclinant suffisamment. Cette façon de procéder est longue et expose aux contaminations par l’air pendant les différents temps de l’opération.

Le chauffage étant toujours préjudiciable â la qualité des

BOUILLONS

milieux de culture. La méthode que nous venons d'indiquer doit être préférée à la suivante qui est pourtant d’un usage courant dans les laboratoires.

Les premiers temps de la préparation sont identiques : macération ou cuisson, filtration, addition de la peptone et du sel, neutralisation. On porte le bouillon à l'autoclave à 120° pendant trente minutes, puis on filtre le liquide encore chaud sur papier filtre épais. On obtient un bouillon clair qui est distribué dans les tubes et les flacons, on passe à l’autoclave à 110°-115° pendant vingt minutes. Pendant cette stérilisation il faut veiller avec soin à ce que la température soit toujours inférieure à celle du premier chauffage pour éviter la formation d’un nouveau précipité qui mettrait dans l’obligation de recommencer la série des opérations.

Albert Bekthelot (1910) a préconisé pour la préparation du bouillon de viande la technique suivante : verser dans une marmite émaillée 200 grammes de viande hachée et 13 cc,5 de lessive de soude à 31° Baumé, porter à l’autoclave à 134° pendant une heure; ajouter 500 centimètres cubes d’eau distillée, acidifier légèrement avec l'acide chlorhydrique pur, laisser refroidir filtrer, neutraliser, chauffer 20 minutes à 120°, filtrer et stériliser: On peut diluer avec moitié d’eau. Le liquide obtenu est aussi riche en extrait sec que le bouillon de viande peptoné ordinaire.

B. Bouillons sucrés, glycérines, etc. — On fera naturellement varier la composition du bouillon depuis la simple infusion de viande salée [le bouillon salé est bien supérieur au bouillon simple comme valeur nutritive (Miquel), et permet de conserver plus longtemps la virulence de certains microbes tels que le Streptocoque pyogène (S. Arloing)] en passant par le bouillon peptoné , précédemment décrit et le plus usité, jusqu’aux bouillons glycosés, lactosés, glycérinés, etc.

Pour les bouillons sucrés , on ajoute 2 .à 4 p. 100 de glucose, lactose, mannite ou sucre de canne, en même temps que le sel marin. Si on ajoute 2 p. 100 de carbonate de chaux, il se produit du gaz (CO2) lorsque les microbes font fermenter les

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sucres. Pour le bouillon glycériné on ajoute 5 à 10 p. 100 de glycérine pure, après toutes les filtrations, au moment de verser le bouillon dans le flacon où il sera stérilisé. On s’assurera que le bouillon est resté neutre, pt on le neutralisera si besoin est. Ce bouillon préconisé pour la culture du Bacille tuberculeux (Nocard et Roux, 1887), convient également bien pour le Bacille de la morve.

A la place du tissu musculaire on peut employer différents viscères (foie, rate, thymus, poumons). Ces bouillons ne sont jamais Clairs. Pour Gvosdiansky (1903), ces milieux sont favorables s’ils sont préparés à chaud, et défavorables à la culture s’ils sont préparés à froid.

C. Bouillon au Liebig. — Très employé en Allemagne. Cinq grammes d’extrait pour un litre d’eau. Alcaliniser. Porter à l'autoclave à + 115°-117° pendant 5 minutes. Filtrer à chaud sur un filtre mouillé. Stériliser à -f- 115°. On peut ajouter, avant l’alcanisation : 10 grammes de peptone et 5 grammes de NaCl.

Remlinger a préconisé l’emploi des bouillons desséchés du commerce (bouillons en cubes) pour la préparation des milieux de culture. Ces produits peuvent être utilisés dans les laboratoires improvisés des colonies.

D. Bouillons colorés. — On additionne le bouillon de diverses matières colorantes, pouvant renseigner sur certaines réactions qui accompagnent le développement microbien, et servir à la diagnose de l’espèce.

a. Duclaux est le premier qui ait ajouté de la teinture de tournesol aux milieux liquides, pour apprécier par la coloration, si le liquide était devenu acide ou était resté neutre. On différencie ainsi le Bacille d’Eberth du Colibacille en cultivant ces deux microbes dans du bouillon lactosé (à 2 p. 100) et tournesolé, stérilisé par filtration; seule la culture du Colibacille tourne au rose.

La sensibilité des milieux lactosés et tournesolés est relativement faible. Un Colibacille peu actif, fabriquant peu d’acide, pourrait passer pour un B. d’Eberth.

b. Petruchsky a préconisé le petit-lait tournesolé (caséine

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précipitée par l’acide chlorhydrique). Ce milieu est difficile à neutraliser (on ne peut le faire qu’avec la soude).

Kahlbaum (de Berlin) le vend tout préparé (Lakmusmolke) . C’est un liquide violet, servant surtout à la distinction des B. paratxyphiques (p. 838).

c. Grimbert et Legros ont recommandé un excellent milieu. Il faut que le lactose soit bien pur (le B. d'Eberth est encore le meilleur réactif de cette pureté). On porte à l’ébullition :

Lactose pur 2 grammes.

Peptone 0 gr. 50

Eau distillée 100 grammes.

et on y ajoute une petite quantité de carbonate de chaux pur; on filtre au bout de cinq minutes, et on s’assure que la réaction est neutre. La neutralisation au carbonate de chaux exclut tout danger d’un excès d’alcali. On filtre sur bougie ; on répartit en ballon, et on ajoute la quantité suffisante de teinture de tournesol stérilisée à l’autoclave.

Ce liquide est extrêmement sensible.

d. Rothberger a imaginé le bouillon coloré au Neutralroth, pour faire des cultures différentielles du B. d’Eberth (voir p. 427).

On 'fait bouillir 125 grammes de viande de bœuf dans 150 grammes d’eau; on ramène à 500 grammes ; on filtre ; on ajoute :

Peptone Dufresne 10 grammes.

Sel marin 10 —

Glucose 2 gr. 50

On fait bouillir ; on laisse refroidir. On ajoute 5 centimètres cubes d’une solution aqueuse de Neutralroth à 5 p. 100. On stérilise à -j- 115°. On répartit en ballons.

E. Solutions de peptone. — Une simple solution de peptone à 1 p. 100, salée à 0,5 p. 100, avec 2 p. 100 de gélatine, est le milieu de culture type pour le Vibrion cholérique (Durham, 1887). Koch recommande la peptone de Witte, une dose de 1 p. 100 de sel, et d’alcaliniser fortement.

Les solutions salées de peptone (1, 2 p. 100) sont utilisées

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pour la recherche de l’indol. La production d'indol est variable avec les peptones utilisées.

Le milieu préparé selon la formule de Truchk et Gottoni permet le développement facile d’un grand nombre de germes : peptone Chapoteaut 4 p. 100, glucose 0,2 p. 100, sel marin 0,5 p. 100; on alcalinise jusqu’à coloration violet franc au tournesol.

Voir, page 424, la recherche du Colibacille, dans l’eau, à l’aide de cultures en solutions peptonées.

F. Solution de somatose. — Gerest (1896) préconise une solution de somatose (succédané de la peptone) à 10 p. 100 comme un milieu de préparation facile et rapide.

G. Bouillon Massart et Bordet. — Ma^sart et Bordet (1892) ont cultivé nombre de microbes dans le liquide suivant :

Eau 1 uOO grammes.

Glyrose 10 —

Peptone 20 —

Phosphate de potasse 1 —

Sulfate de magnésium 0,5 —

Chlorure de sodium 5 —

Potasse, jusqu’à faible réaction alcaline.

H. Bouillons Marmorek. — Marmorek (1895) conserve la virulence de son streptocoque en le cultivant dans un mélange de bouillon et de sérum. 11 donne les formules suivantes qui sont par ordre de valeur :

. ( Sérum humain 2 parties.

I Bouillon de bœui peptoné à 1 p. 100. . 1 —

~0 ( Liquide d’ascite ou pleurésie 1 —

( Bouillon de bœuf peptoné à 1 p. 100. . 2 —

„0 ( Sérum d ane ou de mulet 2 —

( Bouillon de bœuf peptoné à 1 p. 100. . 1 —

. i Sérum de cheval 2 —

( Bouillon de bœuf peptoné à 1 p. 100. . 1 —

I. Bouillon Martin. — L’auteur a voulu supprimer le sucre qui existe toujours dans les bouillons, afin d’empêcher la fabrication des acides par le microbe. Il a obtenu ce résultat par