I. Chat. — Est réfractaire adulte ; jeune/ il est sensible

/. Porc. — Beaucoup moins sensible que les bovidés. l.

BACTERIDIE CHARBONNEUSE

K. Oiseaux. — Le pigeon est réceptif quand il est jeune; le pigeon adulte ne succombe qu’à l:inoculation dans la chambre antérieure. Les bacilles, ayant passé par le pigeon ou le chien, sont exaltés et tuent alors facilement le pigeon par inoculation sous-cutanée. L’immunité du pigeon serait due à une phagocytose active (JVIetchnikoff, Thiltges) .

La poule est encore plus réfractaire, à moins d’être refroidie, par immersion des pattes dans l’eau froide (Pasteur), ou par injections répétées d'antipyrine (Wagner). Le sérum de la poule est bactéricide pour la bactéridie charbonneuse (Thiltges).

L. Vertébrés a sang froid. — Les Batraciens soht réfractaires. L’hippocampe est réceptif (Sabrazès et Colombot).

M. Invertébrés. — Lode aurait infecté des limaces en les maintenant à -f- 32°.

E) — Toxines

Les cultures ordinaires en bouillon, filtrées ou tuées par la chaleur, sont peu ou pas toxiques.

Toussaint (1878) avait signalé une substance phlogogène dans les cultures du B. anlhracis.

Brieger et Frænkel (1890) ont isolé des cadavres charbonneux une toxalbumine assez active. Hankin (1889) aurait extrait des cultures une albumose qui serait très toxique pour les réfractaires et très peu pour les sensibles ; elle conférerait une certaine immunité à la souris.

Marmier (1892) a tenté de mettre en évidence la toxine de la bactéridie charbonneuse. Il purifie avec soin la peptone du commerce et prépare le liquide suivant :

EauL 1 000 centimètres cubes.

Pqptpne. 40 grammes.

Chlorure de sodium 15 —

Phosphate de soude 0 gr. 50

— de potasse 0 gr. 20

Glycérine pure 40 grammes.

La solution, est filtrée et stérilisée à -f- 115°. On ensemence

IMMUNISATION, CULTURES ATTENUEES 729

avec une culture virulente, on met deux jours à -j- 37° et quelques jours à la température du laboratoire. On sature de sulfate d’ammoniaque pendant quinze heures. On filtre sur papier, et on lave le filtre avec une solution saturée de sulfate d’ammoniaque. On recueille le précipité sur le filtre, et on le traite par une très petite quantité de glycérine. On décante au bout de deux jours, on remplace la glycérine, on décante de nouveau. On réunit les liqueurs glycérinées ; on les précipite par quatre fois leur poids d’alcool fort. Le précipité est lavé à l’alcool absolu, à l’éther et desséché dans le vide. On obtient une substance amorphe, brune, soluble dans l’eau distillée qui n’est pas albuminoïde.

Cette substance est toxique. Le lapin succombe à des doses variant de 25 à 200 milligrammes. La mort survient en hypothermie, avec de la diarrhée, de la paraplégie, du deuxième au vingtième jour. Les cobayes, les souris sont sensibles. Les animaux réfractaires ou immunisés ne sont pas sensibles,

La toxine n’est qu’atténuée par un chauffage à -f- 110°.

Marmier a extrait la même toxine active des cultures jeunes sur gélose. Cette substance est intraprotoplasmique.

Bodin (4906) a extrait diverses toxines du corps des bacilles à l’aide de l’éther et du chloroforme. Les matières grasses adhérentes seraient l’origine de l’œdème.

En cultivant la bactéridie dans du bouillon de viande nutrosé à 1 p. 100 on peut mettre en évidence par filtration ou par centrifugation une hémotoxine. Le pouvoir hémolytique est surtout marqué vis-à-vis des globules du lapin et de l'homme, les hématies du cobaye et de la souris sont plus résistantes (Heyrovsky et Landsteiner) .

F) — Immunisation, Cultures atténuées

Le problème de la vaccination anticharbonneuse avait à la fois un intérêt économique (vacciner les troupeaux) et un intérêt scientifique de premier ordre (on ne connaissait encore que les cultures atténuées du choléra des poules).

On savait que le charbon ne récidive pas chez l’homme ; Pas-

teur avait remarqué que les vaches ayant guéri du charbon étaient devenues réfractaires, que des moutons ayant résisté à une première inoculation étaient également réfractaires. La possibilité de la vaccination s'imposait.

Toussaint (1880) filtrait du sang charbonneux sur plusieurs doubles de papier, le chauffait à + 55° et obtenait ainsi un liquide vaccinal. La même année, Chauveau montrait qu’on pouvait obtenir la vaccination par inoculation d’un petit nombre de bacilles, et que les agneaux, nés de mères charbonneuses étaient réfractaires au B. anthracis. En 1881, Pasteur, Chamberland et Roux (28 février et 21 mars) publiaient la découverte d’un vaccin charbonneux constitué par des cultures ayant une atténuation permanente, transmissible. En 1882 et 1883. Chauveau faisait connaître ses vaccins obtenus soit par le chauffage, soit par l’emploi de l’oxygène comprimé. La valeur de la vaccination par cultures atténuées ( méthode pasteurienne) à été consacrée par la mémorable expérience de Pouillyle-Fort, où 25 moutons vaccinés résistèrent à l’inoculation qui /tua les 25 témoins.

Woldridge aurait vacciné avec des cultures filtrées obtenues en bouillon de thymus et de testicule de veau. L’albumose de Marmier peut immuniser. Hankin disait aussi avoir immunisé avec sa toxine. Ce sont là les seuls exemples (après l’expérience de Toussaint) de vaccinations chimiques.

1° Vaccins obtenus par cultures à des températures dysgénésiques. — Ce sont les vaccins Pasteur (Voir p. 343). Le principe est d’avoir des cultures sans spores. Il suffit de cultiver à -f- 42°5. La bactéridie ne donne plus de spore et le mycélium qui cultive subit de jour en jour une atténuation régulière de sa virulence. Si l’on vient à placer à 37° une culture modifiée par un séjour plus ou moins prolongé à 42°, 5, il se forme des spores qui conservent la virulence du mycélium dont elles proviennent. On peut rendre au bacille sa virulence, en se basant sur ce fait que les jeunes animaux sont plus sensibles que les adultes. Tel vaccin qui est inoffensif pour le cobaye adulte, tuera le cobaye d’un jour ou de deux jours, etc. ; si bien

IMMUNISATION, CULTURES ATTÉNUÉES

que l’action pathogène sur le cobaye de un, deux, trois ou quatre jours, est une véritable mesure de virulence. On inoculera donc des cobayes ou des souris très jeunes, et, avec leur sang, des animaux un peu plus âgés, et ainsi de suite. On arrivera ainsi à rendre la virulence aux vaccins.

Technique de la vaccination. — La vaccination des petits animaux de laboratoire (cobaye, lapin), est difficile à obtenir en raison de leur sensibilité; ils sont presque toujours tués par les vaccins (Roux et Chamberland). On peut inoculer au lapin qui supporte bien le premier vaccin, des virus intermédiaires entre le premier et le second vaccin (Pasteur, Feltz). Le lapin supporte dans les veines deux injections successives à un ou deux jours d’intervalle de 40 centimètres cubes du premier vaccin, huit jours après on lui injecte 0 cc. 25 du second vaccin (Roux et Chamberland). Marchoux est arrivé à vacciner le lapin avec les vaccins ordinaires, en injectant d’abord des doses faibles de premier vaccin cultivé et âgé de vingt-quatre heures.

2° Vaccins obtenus par le chauffage. — Ce sont les vaccins de Toussaint, puis de Chauveau. (Voir les vaccins Chauveau, p. 343). Chauveau chauffe à + 47° des cultures sans spores obtenues à -J- 42°, 5. Pour obtenir des races définitivement atténuées, il opère de la façon suivante : 1° cultiver à -j- 42°,5 pendant vingt-quatre heures ; 2° chauffer trois heures, à 47° ; 3° semer et placer cinq à sept jours à + 37° (culture sporulée) ; 4° chauffer pendant une heure à une heure et demie, à -j- 84° ou + 82°. Ces spores fournissent un vaccin à virulence fixe, qui ne peut tuer le mouton. Le premier vaccin a été chauffé à -j- 84° : le second à + 82°.

Ces vaccins conservent leur virulence atténuée plus longtemps que les vaccins Pasteur : par contre, leur activité disparaît en quelques mois.

L’influence de l’oxygène est nulle dans ce procédé d’atténuation (Chauveau).

3U Autres vaccins. — Toussaint avait modifié le sang charbonneux avec des antiseptiques (voir p. 346). Chamberland et

BACTÉRIDIE CHARBONNEUSE

Roux ont diminué la virulence des cultures en s’inspirant du même principe. Chauveau a fabriqué des vaccins en employant l’oxygène comprimé (voir p. 345). Ce vaccin est utilisé au Chili.

Paladino-Blandini (1903) a cherché à retirer du corps des microbes et des spores une substance chimique vaccinante. La nucléoalbumine obtenue tue le cobaye en injection intraveineuse par coagulation du sang, mais n’immunise pas, pas plus qu’elle ne rend le sérum agglutinant.

G) — Diagnostic bactériologique

1° Examen microscopique. — Si l’autopsie est pratiquée aussitôt après la mort, l’examen du sang, même sans coloration, montre les altérations globulaires et la présence des bactéridies. Les bactéridies sont surtout abondantes dans la rate, les reins, les ganglions hypertrophiés.

Rate de souris, quatre heures Sang desséché du bœuf, . soixante-dix-

après la mort. neuf heures après la mort.

Fig. 285.

Bactéridie charbonneuse.

Mise en évidence de la gaine par la méthode de Klett.

Pour préciser la morphologie des éléments rencontrés on fera des préparations colorées par la fuchsine, la thionine ou par la méthode de Gram. Les solutions liydro-alcooliques usuelles permettent de voir la gaine de la bactéridie, mais il est préférable de recourir aux colorations spéciales.

Méthode de Johne. — Fixation par la chaleur. Coloration à chaud, quinze à vingt secondes, par le violet de gentiane à 2 p. 100, après lavage, décoloration rapide par l’acide acétique à 2 p. 100. Lavage, dessiccation.

DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE 733

Méthode de Klett. Coloration simple. — Fixation à chaud. Coloration par la fuchsine ou le violet de gentiane. Décoloration par lavages répétés (10 à 12) à l’eau distillée, au-dessus de la flamme, dessiccation.

Double coloration. — Fixation par la chaleur. Coloration par le bleu de méthylène à 1 p. 100; différenciation à l’eau distillée chaude, coloration de contraste: #vec la fuchsine à 1 p. 100.

Méthode de Lüpke. — Coloration à chaud par le violet de gentiane à 0,2 p. 100.

Fig. 286.

Bactéridie charbonneuse. Réaction de M’ Fadyean.

Sang de vache morte du charbon.

Entre les leucocytes, dont le noyau seul est teinté, et les bactéridies, on distingue les amas irréguliers (de coloration rouge pourpre ou violacée) caractéristiques, (d’après M’ Fadyean).

Méthode de Oit. — Coloration à chaud, une à deux minutes, par la safranine à 2 ou 3 p. 100.

Méthode de Ràbiger. — Dessiccation, fixation et coloration par une solution formolée de violet de gentiane (20 secondes) ; lavage à l’eau, dessiccation.

La solution de Rabiger est obtenue en dissolvant 10 à 15 grammes de violet de gentiane dans 100 à 150 de formol à 40 p. 100. Contact de vingt-quatre heures, filtration. Le formol évite la formation des pseudo-capsules par rétraction du protoplasma, lors de fixation par la chaleur.

Méthode de Franke. — Coloration vingt secondes dans l’éosine aqueuse à 0,5 p. 100 et dix secondes dans le bleu de méthylène à 0,5 p. 400.

On peut obtenir d’excellents résultats avec le Romanowsky, le Giemsa ou même avec la thionine phéniquée.

Méthode à V encre de Chine. — (Voir p. 252).

Fig. 287.

Bactéridie charbonneuse.

Préparation par décalque d’une colonie sur gélose (Fischoeder).

Réaction au bleu de méthylène (M’ Fadyean). — Consiste à déposer sur une lame une gouttelette de sang (2 millimètres de diamètre), à l’étaler sur une surface de 10 à 12 millimètres de diamètre ; dessiccation et fixation par la flamme, sans trop chauffer. Coloration avec une solution de bleu de méthylène à 1 p. 100 (bleu de Grübler, solution préparée à l’ébullition et additionnée de 0,5 p. 100 de bicarbonate de soude). La particu-

DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE

larité de la réaction consiste dans la présence de fines granulations ou d’amas de couleur violette ou rouge pourpre, disséminés irrégulièrement entre les globules rouges, les leucocytes et les bactéridies. L’éclairage artificiel permet une appréciation plus facile.

L'examen microscopique suffisant avec les produits frais.

Bacille pseudo-charbonneux .

Prélèvement d'une colonie sur gélose (Fcschoeder). Grossissement 750 D.

recueillis purement ne permet plus d’assurer le diagnostic lorsque les prélèvements ont été tardifs, ou lorsque les produits sont, examinés tardivement ou ont été souillés. Les difficultés peuvent résulter de la rareté des bactéridies (charbon du porc) , de la présence de microbes analogues à B. anthracis ou des modifications morphologiques de B. anthracis.

Les bacilles pseudo-charbonneux sont rencontrés dans les

cadavres des animaux sains, ils existent dans le sol et dans l’eau ( bacilles anthracoïdes). La différenciation morphologique est impossible. Les cadavres peuvent renfermer le vibrion septique (grandes dimensions, mobile, plus grêle que la bactéridie), le bacillns subtilis peut avoir contaminé les produits à analyser.

Fig. 289.

Bactéridie charbonneuse. Colonie sur gélose (Fischoeder).

Grossissement 28 fois.

Les bactéridies peuvent ne pas exister dans le sang (abatage précoce des animaux charbonneux, charbon du porc) .

La gaine de la bactéridie n’est pas un caractère spécifique, on la retrouve dans nombre de bac. anthracoïdes. Les bactéridies sont rapidement détruites par la putréfaction, mais les capsules résistent deux à trois jours peut-être huit à douze jours. La réaction de M’ Fadyean persiste trois à quatre jours dans le sang putréfié.

Dans bien des cas l'insuffisance ou l’incertitude de l’examen

DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE 737

microscopique obligent à rechercher les propriétés biologiques des bactéridies.

2° Culture. — La culture est le moyen le plus sûr du diagnostic. L'isolement de la bactéridie sera pratiqué sur gélatine

Fig. 290.

Bacille pseudo-charbonneux. Colonie sur gélose (Fischof.der). Grossissement 28 fois.

ou sur gélose en boîtes de Pétri. Les colonies dont les caractères sont analogues à celles de B. anthracis seront examinées et inoculées, beaucoup de bac. anthracoïdes piorphologiquement semblables à la bactéridie, donnent des colonies identiques, il est donc toujours nécessaire de rechercher les caractères pathogènes des microbes isolés.

3° Inoculation. — De préférence à la souris ou au cobaye, elle peut être faite au lapin. L’inoculation sous-cutanée pro-

BACTERIDIE CHARBONNEUSE

voque la mort dus animaux inoculés en trente-six à quarante heures (cobaye, souris) en quarante-huit à soixante heures (lapin) on peut rechercher les bactéridies au point d’inoculation dans les heures qui suivent l’insertion virulente. Le diagnostic doit être complété par l’autopsie (œdème blanc, rate hypertro-

phiée et ramollie, urine sanguinolente) et par l’examen microscopique.

Avec les produits souillés, recueillis tardivement, l'inoculation peut ne pas donner de résultat (Pasteur). La bactéridie inoculée en même temps que le streptocoque de l’érysipèle, le cocco-bac. procligiosus, le pneumobacille, le bac. pyocyanique , le staphylocoque, le bac. coli, Yenterilidis Gartner, e donne pas le

DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE

charbon. Le vibrion septique passe rapidement dans le sang des animaux morts de charbon et les animaux réactifs succombent à la septicémie gangréneuse. On aura recours aux scarifications (cobaye, souris), à l'inoculation intraveineuse chez le lapin. Pratiquée d’emblée avec les produits suspects l’inoculation est rarement une méthode de démonstration décisive.

Il est donc nécessaire, dans tous les cas pour obtenir une certitude d’associer l’examen direct, la culture et l’inoculation.

Extrait. . .

Sérum précipi tant

Réaction

zonale

4° Prélèvement, conservation et envoi des produits suspects. — Prélever aussi rapidement que possible après la mort, dans le cœur, dans une veine ou dans la rate. Si l’autopsie est tardive recueillir le sang dans un vaisseau superficiel (jugulaire,, veines de l’oreille, spumosités sanguinolentes des cavités nasales). On peut exciser l’oreille ou un segment de la queue ou encore prélever un lambeau de peau que l’on fixe sur une planchette (Ciuca et Stoicesco). L'examen des matières excrémentitielles,

riches en spores, serait un moyen sûr de diagnostic post-mortem même quand les cadavres sont putréfiés.

Le sang sera desséché rapidement (les bactéridies sont beaucoup plus résistantes dans le sang desséché que dans les produits humides) sur une lame porte-objet, sur une feuille de

Fig. 292.

Diagnostic du charbon bactéridien par la thermo-précipitation d’Ascoli.

BACTERIDIE CHARBONNEUSE

papier, sur des fils de soie, sur un tampon de laine ou d’ouate. On peut mettre quelques gouttes de sang dans un tube stérile bouché avec de l’ouate la dessiccation est obtenue rapidement.

On peut conserver les produits en réalisant immédiatement les conditions favorables à la sporulation de B. anthracis. On peut mettre le sang entre deux moitiés d’une pomme de terre cuite. 11 est préférable de recourir au procédé strasbourgeois (1906) (Forster, Jakobsthal, Pfersdorff). Le sang recueilli dans une veine superficielle est étalé sur une baguette de plâtré imbibée au préalable d’eau du robinet. On a substitué au bâton de plâtre une baguette de craie, des rouleaux de papier, de petits morceaux de carton... pour s’arrêter actuellement à la terre cuite. (Muller et Engler). On stérilise par l’ébullition un petit fragment de pot à fleurs, on refroidit dans l’eau du robinet fraîche et bien aérée, on laisse égoutter. Sur la face rugueuse on étale une épaisse couche de sang dans laquelle on recherchera les bactéridies ; sur la face lisse les produits sont étalés en couche mince pour réaliser une sporulation aussi rapide que possible. On expédie dans une petile boîte. Au laboratoire on racle la face lisse, on dilue dans du bouillon et on porte à 18° ou 22°. Après quelques heures on chauffe deux minutes à 65° pour détruire les microbes autres que la bactéridie sporulée, on refroidit et on isole par dilution dans la gélose et étalement des boîtes de Pétri.

5Ù Séro-diagnostic. — a. Agglutination. — Le procédé n’a pas donné de résultats (voir plus haut, p. 723).

b. Précipitation. — Le sérum des animaux morts de charbon précipite à 1 p. 50, et même à 1 p. 200 un extrait dans l’eau physiologique du produit de broyage de la rate d’un cobaye charbonneux (Ascoli et Valenti). Le procédé peut être utilisé pour le diagnostic, même avec les produits putréfiés.

II) — Sérothérapie, séro-vaccination

A. — Behring avait montré que le sérum des rats blancs jouit de propriétés bactéricides vis-à-vis du B. anthracis. Ce sérum

SÉROTHÉRAPIE, SÉRO-VACCINATION 741

n’est cependant ni préventif, ni curateur. 11 faut qu’il soit mélangé à la culture pour en atténuer les effets. Injecté séparément, il ne préserve pas (Metchnikoff et Roux) .

B. — Marchoux (1895) aurait obtenu un sérum thérapeutique en inoculant à des moutons vaccinés des doses progressivement' croissantes de cultures virulentes. On saigne quinze et vingt jours après la dernière inoculation.

Gè sérum est actif à 1/2000. Un centimètre cube de sérum injecté vingt-quatre heures avant l’infection préserve le lapin (2 kilogrammes) contre l’inoculation sous-cutanée d’un quart de centimètre cube d’une culture virulente. Il faut des doses vingt fois plus fortes de sérum si l'inoculation virulente est intraveineuse. Ce sérum ne préserve pas le cobaye.

Injecté en même temps que la culture, il préserve inconstamment le lapin , même à de fortes doses. Injecté après l’inoculaion, mais avant l’apparition de l’œdème, il peut guérir le t apin.

C. — Sclavo (1895) a préparé, un sérum anti charbonneux, qui a été recommandé contre la pustule maligne de Y homme.

Mendez (1900) aurait obtenu un sérum assez actif pour guérir le mouton et le bœuf à la dose de 1 /2 centimètre cube, et l’aurait appliqué au traitement de Y homme et des animaux.

Jourgueliounass (1902) a obtenu par hyperimmunisation de la chèvre et du mouton un sérum doué de propriétés préventives pour le cobaye. Le B. anthracis se développe dans ce sérum mieux que dans le bouillon.

San Felice (1903) immunise le chien ; le sérum est préventif et curateur (pour le lapin, pour l’homme) mais pas bactéricide.

Le sérum anticharbonneux n’étant pas bactéricide, ni in vitro, ni in vivo, il aurait le pouvoir de paralyser les échanges nutritifs de la bactéridie ( immunité antiblastique d’ Ascoli) .

Sobernheim a obtenu un sérum qui, à la dose de 2 centimètres cubes protège le lapin contre 1/1000 d’ôse d’une culture virulente, et contre l'ingestion des spores charbonneuses. Dès 1902, Sobernheim a fait connaître une méthode de séro-vaccination.

BACTÉRIDIE CHARBONNEUSE

On injecte aux animaux du sérum préventif en un point du corps (5 centimètres cubes pour le bœuf et le cheval, 4 centimètres cubes pour le mouton) et cinq minutes plus tard en un autre point 1/2 ou 1/4 de centimètre cube d’une culture dont la virulence correspond à celle du second vaccin de Pasteur. La valeur de la méthode est encore discutée.